基于網絡藥理學探討梔黃止痛散治療類風濕性關節炎作用機制及實驗驗證

田曉云,楊瑩潔,鄭婉婷,黃鳴清,趙海譽,南麗紅,陳劍鈺

(1.福建中醫藥大學藥學院,福建 福州 350122;2.中國中醫科學院中藥研究所,北京 100700)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種慢性自身免疫性疾病,臨床表現為關節疼痛、僵硬及腫脹,屬于中醫“痹癥”的診療范疇。該病發病人群廣、發病率高、治療周期長且致殘率高。近年來,中藥復方在干預、治療RA取得較好效果,因此,具有巨大潛力。研究表明,益腎清絡活血方可通過抑制炎癥反應,降低炎癥評分及血清中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素1β (interleukin-1 beta,IL-1β)的表達,升高OPG/RANKL的比值來調節關節骨破壞的環境,進而緩解RA病情[1];甘草養陰湯抑制大鼠成纖維滑膜細胞增殖,從而抗炎[2];斷藤益母湯可通過下調VEGF信號通路抑制人臍靜脈血管內皮細胞(HUVECs)的增殖、遷移、黏附和血管形成,減輕RA血管翳的形成[3];四妙勇安湯合白虎湯加味可以抑制可溶性髓樣細胞觸發受體-1(triggering receptor expressed on myeloid cells 1,sTREM-1)、白細胞介素32(interleukin 32, IL-32)、葡萄糖-6-磷酸異構酶(glucose-6-phosphate isomerase, GPI)等炎癥介質的表達,減輕RA軟骨炎癥損傷[4]。

梔黃止痛散(Zhi-Huang-Zhi-Tong powder,ZHZTP)是全國名老中醫王宏坤教授參考《誠書》梔黃散所得的經驗加減方,由梔子、大黃、姜黃、黃柏、天花粉、赤小豆、赤芍、白芷、木香、冰片組成,其中梔子、大黃破瘀通脈、消腫散結為君藥;天花粉、姜黃、黃柏可以加強活血化瘀之功為臣藥;赤小豆、赤芍、白芷、木香行氣利水消腫,冰片開竅通絡,引領諸藥,促使藥物的吸收,是為佐使。ZHZTP的功效為清熱解毒、逐瘀通經、消腫止痛,臨床在關節扭傷、骨關節炎、關節滑膜炎等方面具有較好的治療效果。王銘增等[5]研究表明,使用ZHZTP治療急性痛風性關節炎患者,可顯著降低血清炎性因子、C-反應蛋白(c-reactive protein,CRP)、血清尿酸(serumuric acid,UA)的水平,減輕患者疼痛;齊秀春等[6]發現,ZHZTP能夠減輕機體膠原纖維損傷、拮抗損傷局部過氧化反應,縮短急性踝關節扭傷患者疼痛時間;溫陽陽等[7]發現,ZHZTP可明顯降低IL-1β、TNF-α等炎性因子水平,促進痛風患者關節腫脹消退。可見,ZHZTP在臨床上治療各類關節炎疾病具有較好效果,然而其有效成分、作用機制、以及是否對RA具有治療效果尚無報道。

網絡藥理學是一種多學科交叉、通過整體生物網絡分析探討藥物,尤其是復雜中藥,作用于疾病機制的研究方法,能快速挖掘藥物與作用靶點間的相互關系、揭示中藥活性成分間的協同作用[8]。本文運用網絡藥理學方法探討ZHZTP化學成分、作用靶點及信號通路,挖掘其治療RA的可能作用機制并進行體外細胞實驗驗證,為臨床治療及后期臨床前研究提供理論依據,具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 網絡藥理學初步探索

1.1.1梔黃止痛散活性成分及靶點預測 利用TCMSP數據庫( https://old.tcmsp-e.com/index.php)檢索ZHZTP君臣藥(梔子、大黃、姜黃、黃柏、天花粉)的化學成分及相應靶點蛋白,另外,將相應靶點蛋白名稱用uniprot數據庫(https://www.uniprot.org/)轉化為其基因名。

1.1.2RA疾病靶點獲取 Genecards數據庫(https://www.genecards.org/),OMIM數據庫和TTD數據庫,綜合匯總RA疾病發病過程中重要靶點。

1.1.3梔黃止痛散活性成分關系分析 將RA疾病相關靶點與中藥活性成分的作用靶點取交集,獲得交集靶點導入STRING數據庫(https://string-db.org/),Cytoscape3.8.2軟件作圖分析Network Analysis功能計算出節點的degree,betweenness、closeness值,并取以上3項均大于平均值的靶點,確定參與調控的核心靶點,并進行蛋白-蛋白網絡關系(PPI)網絡分析。

1.1.4構建“藥物-成分-靶點”網絡 Cytoscape3.8.2軟件繪制“藥物-成分-靶點”網絡圖,以網絡中的節點和邊表示各因素之間的關聯性。利用軟件中的“Network Analyzer”功能對“藥物-成分-靶點”網絡進行分析,選取degree、betweenness及closeness大于平均值的成分,從而分析通過作用RA重要靶點發揮治療作用的各單味藥之間、單味藥與成分的關聯性,進而闡明ZHZTP的藥效物質基礎。另外,也可提示ZHZTP中重要化學成分與重要靶點的關聯性,從而推測ZHZTP可能的作用機制。

1.1.5GO和KEGG通路富集分析 將“1.3”結果中的交集基因通過DAVID數據庫進行GO和KEGG分析,從而確定ZHZTP所調控的信號通路及所涉及的相關分子功能。

1.1.6關鍵成分與核心靶點的分子對接驗證 取Cytoscape3.8.2軟件分析“藥物-成分-靶點”關聯性中degree排名前3的靶點,確定其為ZHZTP治療RA的核心靶點。使用AutoDock vina軟件,將關鍵活性成分與上述核心靶點進行分子對接,確定其結合作用及結合位點,結果用pymol軟件展示。

1.2 體外驗證

1.2.1主要試劑與儀器 試劑:TNF-α(AF-300-01A),PeproTech公司;噻唑藍(0793-1),Lablead 公司;胎牛血清(FBS,10099-141)Gibco公司;青霉素-鏈霉素(Penicillin-Streptomycin Solution,15140122),Gibco公司;DMEM 基礎培養基(11965-092),Gibco公司;β-actin(P31029),北京全式金生物公司;PI3K(154598) ,Abcam公司;AKT(4691S),Cell Signaling Technology公司;m-TOR(2983S)抗體,Cell Signaling Technology公司; 鼠二抗(SA00001-1),Proteintech公司;兔二抗 (SA00001-2),Proteintech公司。

儀器:ALPHA1-2 LD plus冷凍干燥機(德國Christ公司); 552BR138222 型電泳儀,71BR13865 型化學發光成像儀(美國 Bio-Rad 公司); 30174782 型多功能酶標儀(美國 Bio-Tek 公司); AS2000倒置生物顯微鏡(Motic公司)。

1.2.2梔黃止痛散凍干粉的制備及含量測定 ZHZTP由大黃30 g,天花粉20 g,黃柏20 g,梔子15 g,赤芍15 g,白芷15 g,赤小豆15 g,姜黃15 g,木香15 g,冰片10 g組成,均購自福建省第三人民醫院,按常規中藥煎煮法制備并濃縮,將濃縮液平鋪于100 mm的培養皿中,置-80 ℃冰箱預冷過夜。將培養皿放入冷凍干燥機進行凍干,48 h后將凍干粉快速捻勻后放入50 mL離心管中,儲存于-20 ℃備用。按2020版《中國藥典》梔子、大黃項下含量測定方法檢測,ZHZTP凍干粉中熊果酸含量為0.34%,大黃素含量為0.023%。

適量凍干粉加入二甲亞砜(DMSO)配制質量濃度為50 g·L-1的ZHZTP母液,使用0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌,于-80 ℃冰箱保存。實驗時提前解凍母液,用培養基對母液進行稀釋,獲得不同實驗所需藥物濃度,藥物最大濃度的含藥培養基中DMSO的濃度<1%。

1.2.3細胞培養 HUVECs購自ATCC公司,用含10% FBS、1% PS的DMEM高糖培養基,在37 ℃,5% CO2條件下培養。培養皿細胞在倒置顯微鏡下觀察,根據細胞的狀態、密度,進行換液、傳代培養、凍存、復蘇或者種板等操作,其中4～6代細胞進行實驗。

1.2.4MTT檢測HUVECs活力 將HUVECs以5×103個/孔的密度接種于96孔板,培養至細胞對數生長期。 分別以濃度為0、15.6、31.3、62.5、125、500 mg·L-1ZHZTP孵育細胞,各劑量組均設3個復孔。24 h后棄去上清,每孔加入100 μL MTT(5 g·L-1)工作液,繼續培養4 h后用酶標儀測定在490 nm處的吸光度A,并計算細胞活力,每次實驗重復3次,取均值進行統計分析。

確定給藥濃度范圍后,分別設置空白組、模型組(基于課題組前期研究TNF-α 20 μg·L-1)、ZHZTP低、中、高劑量治療組(12.5、25、50 mg·L-1),按照上方法進行檢測,計算細胞活力,每次實驗重復3次,取均值進行統計分析。

1.2.5平板劃痕實驗檢測HUVECs遷移情況 平板劃痕實驗,即傷口愈合實驗(wound-healing assay),在融合的單層細胞上制造一個空白區域,稱為“劃痕/傷口”,邊緣的細胞會逐漸進入空白區域使“劃痕/傷口”愈合。因其類似體外傷口愈合過程,廣泛用于觀察藥物、基因等外源因素對細胞遷移和修復的影響。用marker筆在24孔板背后,以直尺均勻劃橫線,大約每隔0.5～1 cm/道,橫穿過孔,根據3.4結果,設置空白對照組、模型組(TNF-α 20 μg·L-1)、ZHZTP低、中、高劑量治療組(12.5、25、50 mg·L-1)。在每孔中加入HUVEC約5×104個,過夜待細胞鋪滿,加入無血清培養基饑餓12 h,以排除細胞增殖的影響。用10 μL槍頭垂至于背后的橫線劃痕,用PBS洗細胞3次,去除劃下的細胞,加入無血清培養基,ZHZTP低、中、高劑量治療組依次加入(12.5、25、50 mg·L-1)ZHZTP預處理2 h,模型組和ZHZTP治療組分別加入TNF-α(20 μg·L-1),放入37 ℃,5% CO2培養箱培養。按0、12 h取樣,每個樣本選取3個視野,拍照。使用ImageJ軟件進行處理,取均數進行統計學分析,實驗重復3次。愈合率=(各處理組0 h面積-12 h面積/各處理組0 h面積)×100%。

1.2.6Western blot檢測HUVECs中部分關鍵靶點的表達 將HUVEC細胞以30×104個/孔的密度接種于6孔板,培養至細胞對數生長期,分組給藥參照3.5。給藥24 h后,收集細胞,加細胞裂解液50 μL,冰上充分裂解30 min,4 ℃,12 000 r·min-1,10 min,收集上清液,采用BCA試劑盒定量蛋白濃度,10% SDS-PAGE膠電泳分離蛋白,冰上轉膜80 min。轉膜結束,5%脫脂奶粉封閉2 h,加入一抗PI3K(1 ∶1 000)、AKT1(1 ∶1 000)、m-TOR(1 ∶1 000) 和β-actin(1 ∶1 000),4 ℃孵育過夜。除去一抗后,按要求分別加入鼠二抗(1 ∶3 000)、兔二抗(1 ∶3 000)室溫孵育2 h。最后ECL化學發光顯影,采集圖像,并分析灰度值。

2 結果

2.1 網絡藥理學分析結果

2.1.1梔黃止痛散有效活性成分及作用靶點篩選結果 通過TCMSP數據庫分析并篩選ZHZTP有效成分共116個,并通過TCMSP分析此116個活性成分的靶點信息,用Uniprot數據庫轉化為基因名,去重后得到242個靶點。

2.1.2RA疾病靶點篩選結果 綜合GeneCards數據庫、OMIM數據庫和TTD數據庫,去重后匯總共得RA相關靶點共1 364個。將RA相關靶點(1 364個)與TCMSP分析得到的ZHZTP靶點(242個)取交集,得到共有靶點93個(如Fig 1)。

2.1.3“藥物-成分-靶點”網絡關系 利用Cytoscape3.8.2軟件繪制ZHZTP治療RA的“藥物-成分-靶點”網絡圖(Fig 2)。圖中節點表示藥物或成分或靶點因素,邊表示不同因素之間的關聯性;節點的面積越大,顏色越深,表示該因素重要性越高;連線的顏色越深,表示該因素與其他因素的關聯性越強;網絡中共包括471個節點和1 821條邊。將“成分-靶點”分析結果中Degree排序篩選前3得到靶點AKT1、TNF和IL-6(Tab 1),推測它們可能是ZHZTP治療RA的核心靶點。作用RA相關靶點的單體成分中熊果酸、大黃素的degree值明顯高于其它成分,在“藥物-成分-靶點”網絡圖中占據成分的核心地位,表明這兩個成分與RA重要靶點密切相關,可能是ZHZTP治療RA的主要活性成分。另外,通過“藥物-成分”分析發現熊果酸、大黃素分別屬于君藥梔子、大黃中的重要成分。

Fig 1 Intersection of predicted targets of Zhi-Huang-Zhi-Tong powder and RA

Tab 1 Hub targets regulated by Zhi-Huang-Zhi-Tong powder in RA treatment

2.1.4GO和KEGG通路富集分析 將RA相關靶點與ZHZTP靶點取交集得到的93個,通過DAVID數據庫進行GO和KEGG分析,從而確定ZHZTP所調控的信號通路及所調控的相關分子功能。GO功能分析中biological function(BP)、molecular function(MF)和cell components(CC)均取中的繪制柱形圖,結果如Fig 4,表明ZHZTP對BP、MF和CC均有影響。KEGG通路富集得到共156條信號通路(P<0.05),從中選取前20的繪制氣泡圖。結果表明,ZHZTP的功能主要富集在PI3K-AKT、TNF和IL-6信號通路。

2.1.5蛋白質-蛋白質互作關系(PPI)分析及核心靶點篩選 將RA疾病相關靶點與ZHZTP有效成分靶點取交集得到的93個靶點(Fig 1)。Network Analysis分析篩選滿足degree、betweenness和close-ness大于平均值的靶點前20,見Tab 1。其中,位居前3的分別是AKT1、TNF和IL-6,它們在PPT網絡(Fig 3)中占據核心地位,可能是ZHZTP治療RA的核心靶點。因此,使用AutoDock vina軟件,將關鍵活性成分熊果酸、大黃素與上述核心靶點AKT1、TNF和IL-6進行分子對接,確定其結合作用、結合位點及鍵長,結果用pymol軟件展示,如Fig 5所示;它們之間的結合能對接結果如Tab 2所示。其中,單一化合物與3個核心靶點的比較中,我們發現大黃素與熊果酸與核心靶點結合能由低到高依次為AKT1

Tab 2 Binding energy by interaction of compounds and targets

最后,本研究也總結ZHZTP“有效成分-重要靶點-信號通路”網絡調控作用關系(Fig 6),內圈粉紅色代表ZHZTP抗RA重要有效成分;中間圈橘黃色代表上述重要有效成分作用于RA疾病過程中重要的靶點;外圈藍色代表上述重要靶點所介導的信號通路。

2.2 細胞實驗結果

2.2.1梔黃止痛散對HUVECs活力的影響 采用MTT法考察不同濃度ZHZTP處理后細胞活力的影響,IC50=2 232 mg·L-1(Fig 7A)。與正常對照組比較,ZHZTP在給藥濃度為0～62.5 mg·L-1時對細胞活性無明顯抑制作用。確定50,25,12.5 mg·L-1濃度為后續研究劑量,ZHZTP在選定濃度下對細胞活性均抑制作用(Fig 7B)。

2.2.2梔黃止痛散對TNF-α誘導的HUVECs增殖的影響 采用MTT法考察不同濃度ZHZTP對TNF-α誘導的HUVECs增殖的影響,細胞活力在一定程度上體現細胞的增殖活性。與空白組比較,模型組能明顯促進HUVECs的增殖(P<0.01);與模型組比較,ZHZTP治療組細胞增殖活性均明顯降低(P<0.01)(Fig 7C)。

2.2.3梔黃止痛散對TNF-α誘導的HUVECs 遷移能力的影響 劃痕實驗結果顯示,與空白組比較,模型組愈合率明顯增加(P<0.01);與模型組比較,ZHZTP治療組愈合率明顯減少(P<0.01)(Fig 8)。

Fig 2 Network profile of targets regulated by Zhi-Huang-Zhi-Tong powder in RA pathogenesis

Fig 3 The PPI network map of Zhi-Huang-Zhi-Tong powder in RA treatment

Fig 4 GO and KEGG enrichment for mechanism regulated by active compounds of Zhi-Huang-Zhi-Tong powder in RA treatment

Fig 5 Molecule docking between active compounds and targets

2.2.4梔黃止痛散對PI3K/AKT/m-TOR信號通路蛋白表達的影響 Western blot 結果顯示(Fig 9),與空白組比較,模型組 HUVECs中PI3K,AKT,m-TOR蛋白相對表達水平明顯升高;與模型組比較,ZHZTP治療組PI3K、AKT及m-TOR蛋白相對表達明顯降低。

3 討論

ZHZTP臨床用于治療RA,療效顯著,但其物質基礎及作用機制尚不清楚。本研究運用網絡藥理學方法分析其抗RA有效成分及相關作用機制。結果表明,ZHZTP中通過調控RA疾病過程重要靶點的主要有效成分有20種,其中,熊果酸、大黃素位居前二,對RA疾病過程重要靶點的調控作用強于其它治療RA的有效成分。提示這兩個成分與RA重要靶點密切相關,可能是ZHZTP治療RA的核心有效成分。另外,進一步分析這兩個核心有效成分,發現它們均來自梔子(君藥)和大黃(君藥);且兩個成分與ZHZTP治療RA的核心靶點AKT1、TNF和IL-6的結合能表現一致,以上可闡明ZHZTP中梔子、大黃共為君藥的合理性,及各藥物君臣佐使配伍相對合理,可發揮協同抗RA作用。

本研究也發現ZHZTP治療RA的核心靶點依次為AKT1、TNF和IL-6,對接結果也顯示核心有效成分與它們之間均有結合作用,且與AKT1結合能最低。核心靶點中TNF-α、IL-6均在RA滑膜微環境中高度表達,并通過直接或間接作用于RA滑膜組織中的不同細胞類型產生促血管生成分子,促使內皮細胞異常增殖,促進微血管新生進一步形成RA病理血管翳[9-11]; AKT1屬于PI3K-AKT通路蛋白,該通路介導細胞增殖、分化和凋亡等多種細胞功能[12];這3個靶點與RA密切相關。提示,ZHZTP可通過作用AKT1和TNF、IL-6調控RA疾病的細胞水平和分子水平,從而發揮治療RA的作用。

Fig 6 Complicated network of “active compounds-targets-pathways” mediated by Zhi-Huang-Zhi-Tong powder in RA treatment

Fig 7 Effect of ZHZTP on cell viability of HUVECs or TNF-α-stimulated HUVECs

考慮到RA病理性血管翳的形成是由于血管內皮細胞遷移及侵襲能力增強,促進滑膜組織新生血管形成,為增生的滑膜組織供血供氧,進一步促進滑膜增生,加重RA病理發生發展。因此,我們分別考察ZHZTP對HUVECs活力及遷移能力的影響。

此外,TNF-α在RA病理過程中起著“中心犯罪的作用”,因此,我們采用TNF-α誘導HUVECs研究VEC功能的重要細胞系)細胞模型,評估ZHZTP對TNF-α誘導HUVECs活力、遷移作用及相關機制。研究發現ZHZTP可抑制由TNF-α誘導的HUVECs異常增殖,及遷移;進一步機制研究發現ZHZTP可能與下調PI3K/AKT/m-TOR信號通路有關。

Fig 8 Effect of ZHZTP on migration of TNF-α

Fig 9 Effect of ZHZTP on expression of PI3K, AKT and m-TOR in TNF-α induced HUVECs

4 結論

ZHZTP抗RA的有效物質基礎,主要為熊果酸、大黃素,可能通過PI3K/AKT/m-TOR信號通路抑制HUVECs細胞活力、遷移發揮抗RA作用。