重組人糖蛋白激素β5/α2融合蛋白在CHO-S細胞中的表達純化及功能活性分析

千愛君,蕭耿苗,李 壯,梁志成,穆云萍,趙子建,李芳紅

(1. 廣東工業大學生物醫藥學院,2. 華南理工大學醫學院,廣東 廣州 510006)

糖蛋白激素家族,包括促甲狀腺激素(TSH)、促卵泡激素(FSH)、促黃體素(LH)和絨毛膜促性腺激素(CG),參與調節機體多項生理活動,包括生殖、生長和發育以及能量代謝[1-2]。2002年發現了一種新的糖蛋白激素,稱為糖蛋白激素β5/α2 (glycoprotein hormone beta5/alpha2, GPHB5/GPHA2, CGH)[3]。它是一種促腎上腺皮質激素衍生的糖蛋白激素(corticotroph-derived glycoprotein hormone, CGH),由α(GPA2)和β(GPB5)亞單位組成,是人類中唯一含有這些特定亞單位的糖蛋白分子。研究表明,CGH能夠刺激甲狀腺,通過與細胞表面跨膜促甲狀腺激素受體(thyroid stimulating hrmone receptor, TSHR)結合,激活腺苷酸環化酶,使細胞內環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)水平升高,進而發揮生物學效應[4]。值得注意的是,與TSH相比,CGH與TSHR的親和力更強。此外,CGH的β亞基GPHB5基因高度保守,從低等無脊椎動物線蟲到人類一直被保留[5]。雖然CGH的作用因物種而異,但在刺激甲狀腺[6]、骨骼發育[7]、癌癥[8]以及生殖[9]等調節過程中發揮重要的作用,是極具應用潛力的蛋白類候選藥物。

有研究采用基因工程技術將具有生物學活性的功能蛋白分子(如細胞因子、激素、生長因子、酶等)與CG的β亞基羧基末端肽CTP基因融合表達,發現獲得的融合蛋白不但具有常用重組卵泡刺激素(rFSH)的生物活性,還具有融合伴侶分子的特殊功能,顯著延長藥物在體內的半衰期[10]。

為了顯著提高蛋白表達量及研究潛在的更長效的CGH制劑,本研究運用基因重組技術,首次將CTP與單鏈CGH有序連接,即融合蛋白氨基酸序列從N端到C端依次是GPHB5亞基、CTP、GPHA2亞基,得到重組人源CGH-CTP基因,進而構建pcDNA3.1-rhCGH-CTP表達載體,并于懸浮CHO-S細胞中大量表達,經親和層析及離子交換層析純化后,通過高表達TSHR基因的成熟脂肪細胞3T3-L1驗證CGH-CTP蛋白生物學活性。該研究將為進一步探索CGH蛋白功能及研究長效hCGH奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1載體、菌株和細胞株 大腸桿菌E.coliJM109感受態細胞由本實驗室保存;pcDNA3.1(-) 載體購于上海捷瑞生物工程有限公司;懸浮CHO-S細胞購于賽默飛公司;小鼠胚胎成纖維細胞3T3-L1由中國科學院干細胞庫提供。

Fig 2 Scheme of 3T3-L1 cell differentiation experiment n=3)

Fig 3 Restriction endonuclease digestion of recombinant pcDNA3.1-GPHB5-CTP-GPHA2

Fig 4 Sequence alignment of GPHB5-CTP-GPHA2

Fig 5 Western blot analysis of rhCGH-CTP expression in CHO-S cell culture supernatant

1.1.2試劑與儀器 限制性內切酶NotⅠ、EcoRⅠ、DNA Marker均購自TaKaRa公司;DMEM(12800017)和胰酶(25200072)均購自Gibco公司;新生牛血清(04-102-1A)購自BI公司;胎牛血清(164210-50×10)購自武漢普諾賽生命科技有限公司;PierceTMBCA Protein Assay Kit試劑盒(23225)、質粒中提試劑盒(K210005)、ExpiCHOTMExpression Medium (A29100-01)、ExpiFectamineTMCHO Transfection Kit(A29129)、OptiPROTMSFM (12309-050)均購自于賽默飛公司;His-Tag (D3I1O) XP? Rabbit mAb(12698S)抗體購自CST公司;含His標簽的Recombinant Human alpha-Galactosidase A/GLA Protein(6146-GH)及cAMP Parameter Assay Kit(KGE002B)購于RD公司;飽和油紅O染色液(G1260)購于北京索萊寶科技有限公司;SDS-PAGE蛋白考馬斯亮藍染色液(P0017F)購于碧云天公司;LB肉湯培養基(A500859-0005)及基因測序由上海生工生物完成;PrePack Ni-NTA purose 6FF(ZA41002-02)購于江蘇千純生物有限公司;HiTrapTMCaptoTMS 1 mL購于Cytiva公司;其余試劑均為分析純。CO2細胞培養箱(ESCO/藝思高)、冰柜(美菱公司)、電泳和轉印系統&化學發光凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)、低溫離心機(美國Thermo)、-80 ℃冰箱(中國美菱)、AKTA pure 25L蛋白純化系統(美國GE公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1重組hGPHB5-CTP-GPHA2真核表達載體的構建和鑒定 根據NCBI基因庫獲取hGPHB5(NCBI Gene ID: 122876)和hGPHA2(NCBI Gene ID: 170589)基因組序列委托上海捷瑞生物工程有限公司合成。通過連接肽CTP (GGGGS)3將hGPHB5的C端連接至hGPHA2的N端。利用NotⅠ、EcoR Ⅰ酶切位點亞克隆到pcDNA3.1(-) 表達載體,將該重組基因命名為rhCGH-CTP, 重組質粒命名為pcDNA3.1-rhCGH-CTP,其中基因合成及矢量構建均由上海捷瑞生物工程有限公司進行(Fig 1)。連接產物轉化至大腸桿菌感受態細胞JM109,挑取轉化子,提取質粒送生工生物工程(上海)股份有限公司完成測序。

1.2.2重組hCGH-CTP蛋白的表達和純化 在37 ℃、8% CO2飽和濕度及附加搖床速度為109r·min-1的恒溫培養箱條件下[11],CHO-S懸浮細胞在ExpiCHOTMExpression Medium培養基中培養和傳代。待細胞生長密度達7×(109～1010) L-1時,將轉染細胞稀釋為6×109L-1,在ExpiFectamineTMCHO Reagent的介導下,取25 μg重組質粒pcDNA3.1-rhCGH-CTP轉入CHO-S懸浮細胞中,轉染20 h后分別添加150 μL ExpiCHOTMEnhancer和6 mL ExpiCHOTMFeed,繼續培養。轉染后,每24 h收集100 μL細胞混懸液直至CHO-S細胞活率顯著降低。將收取的細胞混懸液4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min以去除細胞碎片,收集培養上清液加入5×SDS上樣緩沖液混勻,置于95 ℃金屬浴中變性10 min,樣品稀釋100倍取10 μL進行Western blot檢測,實驗中使用的抗體為HRP標記的兔單抗His標簽抗體。

5×SDS上樣緩沖液混勻,置于95 ℃金屬浴中變性10 min,樣品稀釋100倍取10 μL進行Western blot檢測,實驗中使用的抗體為HRP標記的兔單抗His標簽抗體。

將培養6 d后的CHO-S細胞培養液離心后收集上清,上清經0.22 μm濾膜過濾,使用Ni2+柱在AKTA pure 25 L蛋白純化系統上進行親和色譜純化, 用含有500 mmol·L-1咪唑的磷酸鹽緩沖液(2 mmol·L-1KH2PO4, 10 mmol·L-1Na2HPO4, 2.7 mmol·L-1KCl, 137 mmol·L-1NaCl)梯度洗脫收集目的蛋白,置于3 ku超濾管中濃縮透析,利用SDS-PAGE分析純化后蛋白純度。再通過HiTrapTMCaptoTMS柱進一步純化,用含有800 mmol·L-1NaCl的MES緩沖液梯度洗脫收集目的蛋白,并用BCA蛋白測定試劑盒對純化后的蛋白進行定量。

1.2.3重組hCGH-CTP蛋白生物學活性檢測 3T3-L1前脂肪細胞以每孔8×104細胞分至6孔板中,在含有0.5 mmol·L-1IBMX、1 μmol·L-1地塞米松及10 μmol·L-1胰島素分化誘導劑的DMEM培養基誘導分化為具有明顯脂滴的成熟脂肪細胞,3T3-L1細胞誘導分化實驗過程及結果見Fig 2。

TRIzol法提取3T3-L1前脂肪細胞分化為脂肪細胞的-3、0、4、 6、 8、10 d的RNA, 定量檢測 RNA濃度,逆轉錄合成cDNA,進行RT-PCR實驗。反應條件為95 ℃預變性2 min,95 ℃變性5 s,60 ℃退火延伸20 s,循環進行40次。采用△△CT法分析CT值,以 2-△△CT法計算TSHR基因表達。

以質量濃度分別為0、0.5、1、2 mg·L-1重組hCGH-CTP蛋白孵育細胞1 h,收取樣品。利用ELISA試劑盒檢測細胞內cAMP含量。

Tab 1 Sequence of Real-time PCR primers

1.2.4油紅O染色 經不同濃度0.25、0.5、1 μmol·L-1重組hCGH-CTP蛋白處理3T3-L1細胞24 h后,用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次,用4%多聚甲醛固定10 min,蒸餾水充分洗滌,60%異丙醇浸洗,然后加入60%油紅O染色工作液染色15 min,60%異丙醇分化至間質清晰,蒸餾水浸洗3次直至沒有多余油紅O染液殘留。顯微鏡觀察染色情況并拍照。在各孔中加入等體積異丙醇,室溫靜置10 min將油紅O溶出,測量450 nm處的吸光度A值。

1.3 統計學分析所有數據均使用Prism 9.4.1進行統計學分析,兩組間數據采用t檢驗。

2 結果

2.1 重組hGPHB5-CTP-GPHA2表達載體pcDNA3.1-rhCGH-CTP的鑒定重組表達質粒pcDNA3.1-rhCGH-CTP的PCR擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳分析,可見6333 bp的pcDNA3.1-rhGPHB5-CTP-GPHA2基因片段,大小與預期一致;經NotⅠ和EcoRⅠ雙酶切,可見約5427 bp的載體片段和約906 bp目的基因片段(Fig 3),大小均與理論值相一致。將重組質粒送至上海生工生物進行測序, 測序結果與hGPHB5-CTP-GPHA2基因序列完全符合(Fig 4),表明重組表達質粒pcDNA3.1-rhCGH-CTP構建成功。

2.2 重組hCGH-CTP在懸浮CHO-S細胞中表達用重組質粒pcDNA3.1-rhGPHB5-CTP-GPHA2瞬時轉染CHO-S懸浮細胞,每24 h收集100 μL細胞混懸液直至CHO-S細胞活率顯著降低。通過Western blot實驗驗證hCGH-CTP蛋白表達分析結果(Fig 5),CHO-S的細胞發酵上清液在約40 ku處出現目的條帶,說明rhCGH-CTP蛋白在CHO-S懸浮細胞中成

功表達。且隨著CHO-S細胞培養時間的延長,細胞上清液中hCGH-CTP蛋白的表達量先升高后下降,其中以含有5 ng His標準品相對定量,計算出蛋白表達量可高達715.4 mg·L-1。

2.3 重組hCGH-CTP在懸浮CHO-S細胞中純化利用AKTA pure 25L蛋白純化系統首先對收取的重組蛋白進行Ni2+親和色譜純化(Fig 6A),并利用考馬斯亮藍染色SDS-PAGE驗證純化蛋白的純度(Fig 6B),結果顯示在170～300 mmol·L-1咪唑范圍內梯度洗脫可獲得純度相對較高的重組蛋白。通過HiTrapTMCaptoTMS陽離子交換層析柱對蛋白進一步純化(Fig 6C),結合SDS-PAGE圖分析在230～390 mmol·L-1NaCl的MES緩沖液范圍內梯度洗脫可獲得純度相對較高的目的蛋白(Fig 6D)。以上結果表明成功表達和純化出了hCGH-CTP蛋白。

2.4 重組hCGH-CTP蛋白生物學活性檢測在高表達TSHR基因的成熟脂肪細胞3T3-L1中(Fig 7A),不同濃度重組hCGH-CTP融合蛋白可刺激細胞內cAMP水平明顯升高(Fig 7B),說明重組hCGH-CTP融合蛋白具有生物活性。

2.5 重組hCGH-CTP蛋白對3T3-L1成熟脂肪細胞內TG水平影響油紅O染色結果顯示,對照組脂肪細胞內充滿紅染大脂滴,少數細胞胞漿中有數顆小脂滴,說明對照組脂肪細胞內脂質含量多;與對照組相比,不同濃度rhCGH-CTP蛋白刺激24 h后,脂肪細胞內大脂滴數量明顯減少,其中1 μmol·L-1CGH劑量組中紅染脂滴明顯變小變密(Fig 8)。表明rhCGH-CTP蛋白可呈濃度依賴性降低脂肪細胞內TG水平。

Fig 6 Purification of hCGH-CTP recombinant protein

Fig 7 Biological activity of purified recombinant hCGH-CTP protein n=6)

3 討論

肥胖和超重已經成為一種全球性流行病,影響了全球超過24億人群的健康[12]。據世界衛生組織統計,全世界約有13%的成年人患有肥胖癥。肥胖會引發代謝綜合癥并伴隨一系列并發癥,與2型糖尿病、心血管疾病、不孕不育、脂肪肝、以及多種癌癥都緊密相關[13-16]。非遺傳性肥胖和超重的主要原因是攝入和消耗的卡路里之間存在能量失衡,從而導致機體脂肪含量過多或脂肪分布異常。脂肪細胞具有很強的脂質存儲能力,同一個脂肪細胞直徑能長大20倍,理論上能存儲近8 000倍的甘油三酯[17]。有報道指出[18],生長分化因子15及其受體可能成為治療肥胖和消耗類疾病的新靶點。隨著全球超重、肥胖和代謝綜合征發病率的持續增加,我們必須提高對白色脂肪組織,尤其是內臟白色脂肪組織能量代謝利用的認知。本研究新發現的糖蛋白激素家族新成員CGH可為抗肥胖和抗代謝疾病藥物提供一個良好的治療窗口。

Fig 8 Effect of recombinant hCGH-CTP protein on fat accumulation in mature adipocytes 3T3-L1 (×400) n=3)

糖蛋白激素β5/α2是2002年新發現的一種異二聚體糖蛋白,存在于不同物種的各組織中,具有多功能性。從通過增加代謝率減肥到人類卵巢癌的進展,提示它是一個重要的信號分子。作為一治療性蛋白,后續研究離不開高效的異源表達和具有更長半衰期的重組CGH。先前研究通過從組織中提取GPHB5及GPHA2全長cDNA,亞克隆至雙啟動表達載體pBudCE4.1,通過轉染293T及COS-7細胞表達并純化蛋白[4,7],雖然都成功驗證了其蛋白生物學活性,但在貼壁細胞中表達量低及循環半衰期短的問題極大限制了其研究。因此,本研究采用CHO-S懸浮表達系統表達rhCGH-CTP,并驗證其生物學功能活性。CTP技術的應用為延長蛋白質藥物的半衰期提供了一種新的方法,利用重組技術將一段天然存在的28個氨基酸序列與蛋白質融合,增加唾液酸含量,唾液酸能增加黏蛋白的黏度,遮蔽蛋白上的糖鏈,使其不被糖苷酶水解,保護蛋白質免受蛋白酶降解;同時可提高蛋白糖基化程度,增加分子量使蛋白質排泄速度減慢。本研究通過合成人源CGH-CTP基因并在CHO-S細胞中成功進行外源性表達且具有生物學活性,但目前商業化CHO-S表達體系表達外源蛋白最高可達g·L-1,因此,我們仍需進一步優化實驗條件提高rhCGH-CTP蛋白表達量。后續我們將進一步使用密碼子優化算法設計最佳的編碼序列并選擇最合適的表達載體;調整表達條件參數來提高蛋白質的溶解度,如:溫度(在轉染24 h后將溫度從37 ℃降至33 ℃培養)、培養基添加劑(添加生長因子;添加組蛋白脫乙酰基酶抑制劑,使染色質解聚并增加整合基因的轉錄活性)、優化純化方法提高蛋白表達。

本研究旨在提出一種大量表達rhCGH-CTP蛋白方法,為進一步探索GPHB5/ GPHA2在代謝疾病中研究奠定基礎。綜上所述,在CHO-S細胞中成功表達并純化rhCGH-CTP融合蛋白,且具有良好的生物學活性,并能有效降低脂肪細胞內甘油三酯含量。本研究所表達的CGH蛋白可作為一種潛在的減肥減脂分子靶標,在未來我們將進一步探索CGH蛋白在糖脂代謝方面的作用并在細胞層面探索其分子機理,本研究也為探索 CGH在其它領域作為治療性蛋白提供重要基礎。