次苷酸查爾酮對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞iNOS和COX-2表達(dá)的影響

王 萌,高盼微,羅子娟,常惠琳,張 玥,袁 慶,柴麗娟

(天津中醫(yī)藥大學(xué)組分中藥國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,方劑學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津市中藥藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 301617)

補(bǔ)骨脂為豆科植物補(bǔ)骨脂 (PsoraleacorylifoliaL.)果實(shí),具有溫腎助陽、溫脾止瀉的功效[1],臨床上被用于治療皮膚病、腎炎、骨折等[2-3]。次苷酸查爾酮(corylifol A,CYA) 是中藥補(bǔ)骨脂的活性成分之一,是一種異黃酮類化合物,具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗骨質(zhì)疏松的特性[4-5]。有研究表明,CYA能明顯抑制破骨細(xì)胞的分化,且能明顯降低 LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞一氧化氮(NO)的生成[6-7]。前期課題組對(duì)補(bǔ)骨脂成分CYA的抗炎活性進(jìn)行初步研究,發(fā)現(xiàn)CYA能抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞IL-1β釋放,初步表明其有一定的抗炎活性[8]。巨噬細(xì)胞中由iNOS和COX-2誘導(dǎo)的NO過度表達(dá)在炎癥性疾病的發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[9],本實(shí)驗(yàn)通過 LPS誘導(dǎo) RAW264.7細(xì)胞建立炎癥模型,考察CYA對(duì)炎癥因子NO、 iNOS、COX-2等表達(dá)的影響,以此來探討CYA的抗炎作用,為CYA的開發(fā)研究奠定基礎(chǔ),同時(shí)為補(bǔ)骨脂的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞株小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞株,中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。

1.2 藥物和試劑Corylifol A(購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院,純度(HPLC)≥98%);LPS (#L2880,Sigma);MTT(#M5655,Sigma);高糖DMEM培養(yǎng)基(#C11995500BT)、FBS (#10099-141)均購(gòu)于Grand Island;BCA試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);NO檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司);β-actin (#4967,美國(guó)CST公司);iNOS(#ab178945)、COX-2 (#ab179800)均購(gòu)于Abcam。

1.3 儀器倒置相差顯微鏡(日本Nikon公司);CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó) THERMO 公司);酶標(biāo)儀(瑞士TECAN 公司);5418R型小型高速冷凍離心機(jī)(德國(guó) Eppendorf 公司);電泳儀(美國(guó) Bio-Rad 公司);Western blot凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)GE公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)將RAW264.7細(xì)胞置于含有10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中,在37 ℃、含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至80%左右傳代。

2.2 細(xì)胞分組處理對(duì)照組:正常培養(yǎng)細(xì)胞24 h。模型組(LPS組):細(xì)胞正常培養(yǎng)24 h后,加入62.5 μg·L-1LPS繼續(xù)培養(yǎng)24 h。給藥組:細(xì)胞正常培養(yǎng)24 h后,加入含有不同濃度CYA的培養(yǎng)基,使CYA溶液的終濃度分別為0.01、0.1、1 μmol· L-1,處理4 h后,然后加入62.5 μg·L-1的 LPS,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

2.3 MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率按照“2.2”細(xì)胞分組實(shí)驗(yàn),細(xì)胞分別培養(yǎng)24 h后,向每個(gè)孔中加入100 μL MTT,37 ℃孵育4 h,棄去上清液,再加入200 μL DMSO,輕微振搖10 min,用酶標(biāo)儀在490 nm處檢測(cè)各孔的吸光度(A)值,并計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=(A給藥-A空白)/(A對(duì)照-A空白)×100%。

2.4 Griess檢測(cè)NO濃度RAW264.7細(xì)胞接種于96孔板,按“2.2”中的方法分組培養(yǎng)24 h后,取上清50 μL,在各孔中加入Griess Reagent Ⅰ,Griess Reagent Ⅱ,混勻,在540 nm處測(cè)各孔的吸光度(A)值,并計(jì)算其NO的含量。

Tab 1 Effects of CYA on cell viability,NO,iNOS,COX-2 in LPS-induced RAW264.7 cells

2.5 Western blot檢測(cè)iNOS和COX-2蛋白表達(dá)水平將RAW264.7細(xì)胞以1×109L-1的密度接種在6孔板中,并根據(jù)“2.2”中的方法對(duì)其進(jìn)行分組,培養(yǎng)24 h之后,用 PBS清洗,加入100 μL的裂解液,12 000 r·min-1,4 ℃離心20 min,取上清,BCA法進(jìn)行蛋白定量,取蛋白樣品電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉,加入一抗孵育過夜,用TBST洗膜3次,加入二抗反應(yīng)1 h,用TBST洗滌4次,凝膠成像系統(tǒng)顯色曝光,β-actin作為內(nèi)參,分別計(jì)算各組細(xì)胞蛋白表達(dá)水平,ImageJ軟件用于灰度值分析。

3 結(jié)果

3.1 CYA對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響通過MTT實(shí)驗(yàn)來評(píng)估CYA對(duì)細(xì)胞活性的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如Tab 1所示,62.5 μg·L-1的LPS以及CYA在 0.01～1 μmol·L-1的范圍內(nèi)對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率無明顯影響,表明62.5 μg·L-1的LPS以及CYA在濃度 0.01～1 μmol·L-1的范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞均不具有細(xì)胞毒性作用。

3.2 CYA對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞上清液中NO含量的影響如Tab 1 所示,與Control比較,LPS處理后模型組細(xì)胞NO的含量上升(P<0.01);與Model組比較,給藥組細(xì)胞NO的含量明顯下降(P<0.05)。

3.3 CYA對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞iNOS表達(dá)的影響如Tab 1 所示,與Control組比較,LPS處理后的模型組細(xì)胞的iNOS表達(dá)量增加(P<0.01);與Model組比較,給藥組細(xì)胞的iNOS表達(dá)量下降(P<0.01)。

3.4 CYA對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞COX-2表達(dá)的影響如Tab 1 所示,與Control組相比,LPS處理后的模型組細(xì)胞的COX-2表達(dá)量增加(P<0.01);與Model組相比,給藥組細(xì)胞的COX-2表達(dá)量下降(P<0.05)。

4 討論

RAW264.7細(xì)胞是小鼠體內(nèi)的單核巨噬細(xì)胞,LPS可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌多種炎癥因子,如 NO、 iNOS、COX-2等,一般情況下iNOS和COX-2的表達(dá)量非常低,但它們卻能夠在炎癥反應(yīng)的誘導(dǎo)中被激活,從而引起炎癥反應(yīng)。iNOS和COX-2是調(diào)控炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因子,iNOS是NO合成的限速酶,主要對(duì)機(jī)體產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng),NO能促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子COX-2的釋放,而COX-2是炎癥細(xì)胞加重炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵酶[10]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞表達(dá)的iNOS和COX-2蛋白含量明顯增加,給予不同濃度的 CYA處理,隨著給藥濃度的增加,這兩種蛋白的含量逐漸降低,NO的含量也因此下降,從而有效的控制炎癥反應(yīng)的發(fā)生,這可能是CYA發(fā)揮抗炎機(jī)制的作用之一。綜上所述,CYA可抑制RAW264.7細(xì)胞COX-2和iNOS蛋白在LPS誘導(dǎo)下的表達(dá),這可能是CYA發(fā)揮抗炎作用的原因之一,但其具體的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。