Ghrelin 基因單核苷酸多態性與老年癡呆及認知功能的相關性

劉文廣 吳麗媛 高智勇 何世鋒 潘哲拓 李西 郭安琪

(1溫州醫科大學附屬康寧醫院(浙江省精神心理疾病臨床醫學研究中心) 精神科,浙江 溫州 325000;2溫州怡寧老年醫院精神科)

阿爾茨海默病(AD)又稱老年性癡呆癥,是一種多因素進行性神經系統退行性疾病,臨床上主要癥狀表現為記憶力和認知缺陷〔1〕。據統計,截止于2019年全球AD患者超4 000萬例,而我國是全球AD患者數量最多的國家。我國AD患者占世界AD患者總人口的1/4〔2〕。隨著病情發展AD患者記憶力減退、語言障礙、視覺空間技能損害、思維遲鈍、注意力散漫和情感障礙及人格變化等特點,同時伴隨社會活動能力和自身生活能力的減退,嚴重影響患者日常生活活動乃至威脅患者生命安全,同時給社會和家庭帶來極大的壓力與負擔〔3～5〕。但對于AD的發病原因和機制還不確定,無法在早期快速便利確診,也無特效治療方法。饑餓素(Ghrelin)是一種含有28個氨基酸的功能性激素,主要作用于下丘腦,通過結合G-蛋白耦聯受體(GHSR-1a)調控大腦邊緣系統-下丘腦-垂體-腎上腺皮質(LHPA)軸的激素分泌〔6〕。Ghrelin與肥胖癥和代謝綜合征有關但也與神經保護、記憶和學習有關〔7〕。本研究旨在探討Ghrelin 基因單核苷酸多態性(SNP)與老年癡呆及認知功能的相關性。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選擇溫州醫科大學附屬康寧醫院于2021年6月至2023年6月收治的老年AD患者100例,其中男63例,女37例;年齡65～79歲,平均(71.32±5.42)歲;病程1～12年,平均(6.32±1.65)年。另選擇健康體檢老年人72例對照組,其中男47例,女25例;年齡65～78歲,平均(71.54±6.57)歲。兩組一般資料無統計學差異(P>0.05)。納入標準:(1)符合國際疾病分類第10版(ICD10)癡呆標準(研究用);(2)簡易智力狀態檢查(MMSE)量表評分<24分;(3)軀體功能正常;(4)簽署知情同意書。排除標準:(1)肝腎功能不全;(2)惡性腫瘤;(3)視聽功能不全;(4)并發腦外傷、腦卒中等其他中樞神經系統疾病;(5)存在溝通交流嚴重障礙者。

1.2Ghrelin基因SNP分析 (1)DNA抽提:參照OMEGA公司的SE Blood DNA Kit試劑盒說明書從被試全血標本中提取基因組DNA。具體步驟:取無菌1.5 ml小離心管一只,加入300 μl待測血液,再加入900 μl細胞裂解液;室溫孵育10 min(期間顛倒離心管2～3次混勻)裂解紅細胞,然后以6 000 r/min室溫離心20 s;盡可能將上清移棄干凈,勿攪動白色沉淀;重復加入細胞裂解液,室溫孵育后離心,棄掉上清;使用渦旋振蕩器劇烈混勻,直至白細胞重懸;向重懸細胞溶液中加入核裂解液300 μl;加入2 μl RNaseA溶液,混勻后,室溫反應10 min;加入250 μl緩沖液BL放于65 ℃水浴箱中10 min,期間拿出震蕩3次;加入250 μl無水乙醇,渦旋震蕩;將上述液體移至試劑盒配套的HiBind DNA管里,然后1 500 r/min室溫,離心1 min;加入500 μl HB緩沖液,1 500 r/min室溫離心1 min,棄液,重復1次;3 000 r/min室溫,離心2 min;將HiBind DNA管放入新的EP管內,加入50 μl 65 ℃的洗脫緩沖液,65 ℃反應5 min后,3 000 r/min室溫,離心1 min;再加入50 μl 65 ℃的洗脫緩沖液,65 ℃反應5 min后,3 000 r/min室溫,離心1 min;最后EP管內為提取的基因組DNA。(2)聚合酶鏈反應(PCR)擴增:根據選取的SNP位點設計引物,以Ghrelin基因的DNA片段為模版,進行聚合酶鏈式反應。反應體系體積為40 μl,反應條件:96 ℃預處理5 min,96 ℃變性30 s,退火溫度為53 ℃,退火時間為30 s,72 ℃延伸30 s,共35個循環,最后72 ℃延伸5 min。PCR產物通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳(100 V)檢測(96 ℃高溫使雙鏈DNA解離形成單鏈,退火53 ℃使引物與模板DNA互補區結合,中溫72 ℃使DNA聚合酶催化以引物為起始點的DNA鏈延伸反應)。(3)酶切驗證:根據SNP位點多態性設計選取合適的酶進行酶切驗證。(4)序列分析:將PCR擴增后所得基因序列交由上海生工生物公司測定序列后進行分析。

1.3認知功能評估 (1)MMSE:評分0～30分,評分越高認知功能越好,MMSE評分≥27分表示認知功能正常,MMSE評分<27分表示認知功能障礙。以MMSE評分21～26分為輕度認知功能障礙,10～20分為中度認知功能障礙,0～9分為重度認知功能障礙。(2)AD評定量表-認知(ADAS-Cog)量表評定:ADAS-Cog評分0～70分,評分越高認知功能越好。

1.4生活能力評估 采用癡呆患者生活質量量表(QOL-AD)和日常生活活動能力(ADL)評價。其中QOL-AD評分13～52分,評分越高生活質量越好;ADL評分,0～100分,評分越高生活質量越好。

1.5統計學方法 采用SPSS26.0軟件行χ2檢驗、t檢驗和Pearson相關性分析。

2 結 果

2.1兩組rs55821288位點等位基因分布情況比較 AD組rs55821288位點A等位基因頻率高于對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組rs55821288位點等位基因、基因型分布比較〔n(%)〕

2.2兩組rs55821288位點基因型分布情況比較 AD組rs55821288位點AA基因型頻率高于對照組,差異有統計學意義(P<0.05),見表1。

2.3兩組MMSE和ADAS-Cog、QOL-AD、ADL評分比較 AD組MMSE、ADAS-Cog、QOL-AD、ADL評分低于對照組,差異有統計學意義(P<0.001),見表2。

表2 兩組MMSE、ADAS-Cog、QOL-AD、ADL評分比較分)

2.3Pearson相關性分析 rs55821288位點A等位基因與MMSE和ADAS-Cog呈線性負相關(r=-0.574、-0.651,均P<0.001)。rs55821288位點AA基因型分布與MMSE和ADAS-Cog呈線性負相關(r=-0.607、-0.718,均P<0.001)。

3 討 論

AD是由遺傳、環境等因素引起的一種常見的神經內科疾病,具有病程長、逐步進展等特點,易不可逆損傷患者生活質量和社會功能,降低患者日常生活能力,且隨著病情發展將逐漸減退患者生活質量〔8～10〕。AD患者會表現出不同程度認知功能障礙,而認知功能損害多與炎性損傷、神經變性及神經內分泌有關〔11,12〕。現階段,針對老年AD患者仍以藥物治療為主,但采用藥物治療雖可改善患者臨床癥狀,延長生存時間,但常需終身服藥,患者溝通障礙且依從性差,常不配合治療〔13～15〕。本研究表明,老年癡呆患者存在明顯的認知功能障礙;生活能力明顯下降。

Ghrelin主要來自胃黏膜A或X/A樣細胞,是從胃組織中分離出的一種生長素釋放肽,也是脂肪細胞因子之一。Ghrelin作用除促進生長激素釋放外,還可調節能量代謝,影響葡萄糖代謝和胰腺的內分泌功能。Ghrelin還可通過抑制脂肪分解和刺激脂肪生成,從而促進內臟組織中血漿非酯化脂肪酸的儲存。此外,Ghrelin對能量自穩態、脂代謝及糖代謝具有重要調節作用,還可以與抵抗素和瘦素等脂肪因子相互作用,從而調節細胞的胰島素敏感性〔16〕。Ghrelin與肥胖癥和代謝綜合征有關〔17,18〕,但也與神經保護、記憶和學習有關〔19〕。AD早期的一個特征是海馬退化,而Ghrelin被證實對海馬神經元具有保護作用。已有實驗證明Ghrelin參與了許多更高的大腦功能,如記憶、獎勵和睡眠等〔20〕。Ghrelin基因rs55821288位點主要位于第4內含子,包含G和A兩種等位基因。目前,臨床上尚無有關Ghrelin基因rs55821288位點與老年癡呆患者認知功能方面的研究,缺乏可靠臨床參考依據。本研究表明,A等位基因可能是PCOS發病的危險因素;老年癡呆患者rs55821288位點AA基因分布明顯增加。但本研究入組樣本量相對較小,可能會造成研究結果存在偏倚,故還需筆者后續增加病例,進一步探討Ghrelin基因多態性與老年癡呆及認知功能相關性,以期提供可靠臨床參考依據。綜上,Ghrelin等位基因A及基因型AA對老年癡呆患者認知功能具有促進作用,且與認知功能密切相關,具有重要臨床研究價值。