薏苡仁油聯合奧沙利鉑對結腸癌細胞增殖、凋亡的影響

王韜 費建東 聶雙發 李磊

(河北北方學院附屬第一醫院胃腸外科,河北 張家口 075000)

結腸癌是常見的消化道惡性腫瘤,是一種嚴重威脅生命健康的疾病,其發病率和病死率逐年上升〔1〕?；熉摵辖Y腸癌根治術是治療結腸癌的常用手段,化療藥物主要包括卡培他濱、奧沙利鉑、氟尿嘧啶等。研究顯示,術后單獨采用化療藥物治療結腸癌對提高患者術后生存率的效果并不理想,故嘗試聯合用藥方式迫在眉睫〔2〕。薏苡仁油是從薏苡仁中提取的活性成分,具有多種用藥效果,包括減少腹部脂肪,抗腫瘤,提高免疫力等〔3,4〕,在多種癌癥的化療聯合治療中,均可提高腫瘤治療效果,減輕不良反應,同時改善患者生活質量,但其發揮凋亡作用的具體機制尚未完全明確〔5,6〕。本研究探討薏苡仁油聯合奧沙利鉑對結腸癌HT-29細胞株增殖、凋亡的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1試劑與細胞株 人結腸癌HCT-116細胞株購于瀘州醫學院附屬醫院醫學實驗中心;注射用薏苡仁油,浙江康萊特藥業公司,批號1503163-1;胎牛血清,美國Gibco公司,批號16000-044;RPMI1640培養基,美國Gibco公司;奧沙利鉑,杭州中美華東制藥有限公司,批號150403;碘化丙啶(PI),美國Sigma公司,批號MKBP1360V;膜聯蛋白(Annexin)-Ⅴ/PI凋亡試劑,北京索萊寶科技有限公司,批號1030D057;甲基唑藍,美國Sigma公司,批號M2128。

1.2細胞培養 將細胞置于含雙抗、含10%胎牛血清的RPMI1640培養基中,同時在溫度為37 ℃,含有5%二氧化碳的細胞培養箱中進行培養,選擇對數生長期細胞完成實驗。

1.3四甲基偶氮唑藍(MTT)法測定細胞增殖情況 實驗分組:以注射用薏苡仁油濃度為依據,將其分為薏苡仁油10、20、40 μl/ml組、奧沙利鉑組(50 μl/ml)、奧沙利鉑組+薏苡仁油10 μl/ml、奧沙利鉑+薏苡仁油20 μl/ml組、奧沙利鉑+薏苡仁油40 μl/ml組、空白對照組。將細胞按照每孔2×104的標準在96孔培養板中接種,等到細胞貼壁之后,實驗組將以上各種細胞藥物加入,空白對照組加入等體積生理鹽水,每組均設置副孔6個;藥物分別培養24、48及72 h,在避光條件下分別將20 μl MTT加入每孔中,行4 h孵育之后,將MTT與培養基去除,分別將150 μl二甲基亞砜(DMSO)加入每孔中,行5 min震蕩處理,對各孔吸光度值(OD)進行測定,細胞增殖抑制率=(1-實驗組OD值/空白對照組OD值)×100%,細胞抑制率嚴格按照公式進行計算,行3次重復實驗,最終結果取3次實驗結果的平均值。

1.4流式細胞術測定細胞凋亡情況 對實驗組及空白對照組行48 h培養之后的HT-29細胞進行收集,按照1 000 r/min的速度行5 min離心處理,將上清液去除,采用磷酸緩沖液(PBS)行2次漂洗,將PI、AnnexinV-異硫氰酸熒光素(FITC)染液加入,混勻之后在4 ℃的環境下行15 min避光染色處理,最后再上機分析檢測熒光強度。

1.5RT-PCR法測定Survivin表達水平 對用藥前后的結腸癌細胞進行收集,對細胞總RNA進行提取,嚴格按照試劑盒說明書行擴增、逆轉錄操作,選擇PCR產物進行電泳,同時在紫外燈下進行攝影。

1.6統計學分析 采用SPSS20.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1各組人結腸癌HT-29細胞增殖抑制率對比 薏苡仁油組、奧沙利鉑組、奧沙利鉑+薏苡仁油組均會對人結腸癌HT-29細胞增殖產生一定抑制作用,且薏苡仁油濃度越高,作用時間越長,細胞增殖抑制率越高,差異有統計學意義(P<0.05);與薏苡仁油組、奧沙利鉑組相比,奧沙利鉑+薏苡仁油組細胞增殖抑制率更高,差異有統計學意義(P<0.05),見表1。

表1 各組人結腸癌HT-29細胞增殖抑制率、凋亡率、Survivin mRNA表達對比

2.2各組人結腸癌HT-29細胞凋亡率對比 薏苡仁油組、奧沙利鉑組、奧沙利鉑+薏苡仁油組細胞凋亡率均明顯高于空白對照組(P<0.05);薏苡仁油濃度越高,細胞凋亡率也越高,差異有統計學意義(P<0.05);奧沙利鉑+薏苡仁油組細胞凋亡率高于單獨奧沙利鉑組、薏苡仁油組,差異有統計學意義(P<0.05),見表1。

2.3奧沙利鉑聯合薏苡仁油對HT-29細胞Survivin mRNA表達的影響 薏苡仁油各濃度組Survivin mRNA表達較空白對照組明顯降低(P<0.05);與空白對照組對比,奧沙利鉑組Survivin mRNA表達強度明顯提高(P<0.05);奧沙利鉑+薏苡仁油組Survivin mRNA表達強度較單獨奧沙利鉑組明顯降低(P<0.05),見表1。

3 討 論

結腸癌是我國乃至全球范圍內發病率和病死率都較高的惡性腫瘤之一,主要的治療方式包括靶向治療、放化療、手術等,然而受傳統觀念影響和醫療條件的限制,我國結腸癌患者的早期就診率低,誤診率高,中晚期病例較多,手術結合化療是結腸癌的主要治療手段之一〔7〕。奧沙利鉑為臨床治療結腸癌的常見化療藥物,單獨用藥效果不理想,極易產生耐藥性〔8〕。薏苡仁油是從薏苡仁中提取出來的一種有效成分,具有清熱排膿、舒筋除痹、健脾去濕、利水消腫功效〔9〕。以薏苡仁油為主要成分的抗腫瘤藥物康萊特注射液已經在臨床上得到了廣泛的應用。薏苡仁油能對T淋巴細胞活性、細胞因子水平進行調節,促使機體免疫功能提高;對腫瘤細胞周期進行干擾,對腫瘤細胞增殖進行抑制,對腫瘤細胞凋亡進行誘導;該藥物還能對血管形成、血管內皮生長因子蛋白陽性表達進行抑制,進而避免腫瘤復發、轉移〔10～12〕。

本研究結果提示,薏苡仁油不僅能對HT-29細胞生長進行抑制,同時還能進一步提高奧沙利鉑對HT-29細胞活性、增殖的抑制作用,并具有時間-劑量依賴性特點。楊穎等〔13〕研究顯示,薏苡仁能促使吉西他濱抑制人肝癌細胞增殖的作用進一步增強。盧立欣等〔14〕研究發現,在腹腔灌注化療基礎上聯合薏苡仁能對惡性腹腔積液的產生起明顯抑制作用。以上結果均與本研究結果高度相似,進一步證明薏苡仁能增強化療效果,對腫瘤細胞增殖進行抑制。與此同時,通過對比不同組腫瘤細胞凋亡情況得知,注射用薏苡仁油濃度越高,細胞凋亡率也越高;聯合奧沙利鉑與注射用薏苡仁油治療結腸癌利于發揮藥物協同作用,進一步增強對腫瘤細胞的殺傷作用,其作用機制可能和Survivin mRNA表達調節存在密切相關性。Survivin屬于一種凋亡抑制蛋白,只表達于腫瘤和胚胎組織,且與腫瘤細胞的分化增殖及浸潤轉移密切相關,同時參與腫瘤細胞化療抵抗〔15〕。研究顯示,Survivin高表達是腫瘤細胞逃避凋亡,進而產生耐藥性的重要原因〔16〕。對腫瘤細胞中的Survivin表達進行抑制,不僅能對腫瘤細胞凋亡進行誘導,同時還能促使化療效果進一步增強。本研究提示,注射用薏苡仁油能在一定程度上抑制Survivin表達;奧沙利鉑可能對HT-29細胞中Survivin高表達具有誘導作用,這也是HT-29細胞對奧沙利鉑具有耐藥性的重要原因之一;注射用薏苡仁油不僅能促使HT-29細胞中的Survivin mRNA表達強度降低,同時也能促使奧沙利鉑誘導的Survivin高表達降低,推測這可能是薏苡仁油提高HT-29細胞對藥物奧沙利鉑敏感性的重要機制。

綜上所述,薏苡仁油聯合奧沙利鉑可協同發揮對結腸癌HT-29細胞增殖的抑制作用,并協同發揮對細胞凋亡的誘導作用,其作用機制可能和Survivin表達有密切相關性,但仍需進一步探討是否存在其他作用機制。