綠原酸生物合成調控及其應用研究進展

陳治民 李翠 韋繼天 李昕然 劉嶧 郭強

（1. 北京市農林科學院草業花卉與景觀生態研究所，北京100097; 2. 天津農學院園藝園林學院，天津 300392）

綠原酸（chlorogenic acid, CGA）作為植物苯丙烷類重要的次生代謝產物之一，廣泛存在于蕨類植物和雙子葉植物中。1947年，Rudkin和Nelson首次確定了綠原酸的化學結構，其分子結構中有多元酚、不飽和雙鍵和酯鍵等，與植物的生物與非生物抗性密切相關［1-2］。目前發現富含綠原酸的植物主要有咖啡樹（Coffea）、杜仲（Eucommia ulmoi）、金銀花（Lonicera japonica Thunb.）和番茄（Solanum lycopersicum）等［3］。近年來，因綠原酸具有抗氧化、抗衰老等功效，被制成藥品、保健品等用以提高人體免疫力。此外，綠原酸還作為食品添加劑起增香和保色作用［4］。可見，綠原酸對人體健康具有諸多益處，但植物的綠原酸含量并不高，難以滿足市場的需求。因此，如何提高綠原酸產量顯得尤為重要。

隨著現代生物技術和酶化學的發展，綠原酸的生物合成途徑逐漸被破解。在合成綠原酸時，也會受不同轉錄因子的調控，進而影響綠原酸的含量。同時，生物脅迫、非生物脅迫、植物激素和環境因素也會影響綠原酸的含量。鑒于此，本文將從綠原酸的結構、功能、生物合成途徑以及轉錄因子和外源誘導影響綠原酸含量方面進行綜述，以期為綠原酸開發利用以及提高作物抗逆性提供新的思路。

1 綠原酸的結構和作用

1.1 綠原酸的結構

綠原酸是由咖啡酸的1位羧基和奎尼酸的3位羥基縮合而成的酯類物質，由于咖啡酸與奎寧酸酯化的部位不同使得綠原酸類物質存在多種類型化合物，主要包括單咖啡酰奎寧酸（3-咖啡酰奎寧酸、4-咖啡酰奎寧酸、5-咖啡酰奎寧酸）、雙咖啡酰奎寧酸（1,3-二咖啡酰奎寧酸、3,4-二咖啡酰奎寧酸、3,5-二咖啡酰奎寧酸等）、三咖啡酰奎寧酸以及阿魏酰奎寧酸等。它們因結構的不同，存在的藥理活性亦呈現出多樣化（表1）。

表1 綠原酸類物質的分子結構與生物活性Table 1 Molecular structure and bioactivities of chlorogenic acids

1.2 綠原酸的作用

1.2.1 綠原酸在植物抗逆生理中的作用 作為天然酚酸類化合物，綠原酸在提高植物抗逆性中發揮重要作用。研究表明，外源施加綠原酸，對櫻桃番茄（Lycopersicon Esculentum var. cerasiforme A. Gray）中黑曲霉分生孢子萌發、芽管伸長、細胞活力和菌絲生長均有明顯的抑制作用，顯著抑制了櫻桃番茄腐爛病的發生［27］。類似地，在煙草（Nicotiana tobacum）中施加綠原酸能顯著抑制其疫霉病的生長，且抑制作用隨著綠原酸施加濃度的遞增而增強［28］。可見，綠原酸在增強植物抗病性方面發揮著重要的作用。此外，綠原酸還具抗蟲功能。研究發現，對美國白蛾（Hyphantria cunea）幼蟲飼喂一定濃度的綠原酸后，會破壞它的解毒系統，美國白蛾的生長發育、繁殖等活動因此受到抑制［29-30］。其原因是施加綠原酸后能夠提高過氧化物酶（peroxidase, POD）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）和過氧化氫酶（catalase, CAT）等相關抗氧化酶活性，從而提高植物抵御病菌侵害以及環境脅迫的能力［28］。而隨著綠原酸處理時間延長會引起內質網應激，導致內質網中的Ca2+釋放到細胞質，隨后進入線粒體，導致Ca2+在線粒體中過量積累并破壞體內Ca2+穩態，致使線粒體結構受損，致病菌活力下降［31］。同時，綠原酸的積累也有助于提高植物的抗寒性、抗旱性、耐鹽性以及抵御強光照射或紫外輻射［32-34］。由此可見，綠原酸在植物的生長發育、抗病、抗蟲以及抵御外界脅迫環境中扮演重要角色。

1.2.2 綠原酸在動物健康中的作用 在動物的飼料中添加一定量的綠原酸對動物的生長和品質等有著積極的影響。研究發現，在魚飼料中添加綠原酸可以提高鯽魚（Carassius auratus）腸道、肌肉和肝臟組織的抗氧化能力，促進其健康生長［35］。同時，綠原酸具有使肌原纖維蛋白的二級結構和三級結構變松散的功能，以提高肌原纖維蛋白的熱穩定性和凝膠特性，從而改善魚肉品質［36］。一般而言，高密度飼養會顯著降低雞（Gallus gallus）的生長、體重和空腸絨毛長度，但在添加含有綠原酸的飼料后，能顯著增加雞腸道有益微生物種群，改善其腸道屏障的完整性，從而改善雞在高密度飼養環境中的健康生長［37］。在飼料中添加低濃度的綠原酸可以誘導背部最長肌肌肉向更多氧化性肌纖維轉化，進而改善豬肉品質［38］。另外，綠原酸亦能改善動物抗病性。添加綠原酸可抑制豬（Sus scrofa domesticus）的呼吸綜合征病毒活性和抑制雞的傳染性支氣管炎病活性［39-40］。有趣的是，奶牛（Bos taurus）飼料中添加綠原酸能顯著抑制奶牛乳腺上皮細胞促炎因子的表達，從而減輕炎癥反應［41］。其作用機理為綠原酸通過抑制免疫細胞和活化抑制因子來激活宿主的免疫系統，進而增強動物機體免疫保護功能，提高機體免疫防御作用［42］。因此，綠原酸在動物的生長發育和抗病中起重要作用，可通過在飼料中添加一定濃度的綠原酸改善動物的健康生長。

1.2.3 綠原酸對改善人體健康的作用 綠原酸具有較強的生物活性，是重要的治療性藥物，對改善人體健康具有積極的作用。研究表明，服用綠原酸可以顯著增強睡眠中的脂肪氧化，最大限度地減少睡眠延遲，且不會對睡眠質量產生任何不利影響［43］。同時，持續服用綠原酸6個月可以明顯改善老年人的注意力、執行和記憶功能［44］。其作用機制是綠原酸通過對成纖維生長因子21（fibroblast growth factor 21, FGF21）信號通路的激活降低微管相關蛋白（microtubule associated protein τ, tau）的活性，減少過度磷酸化的tau蛋白的產生，從而延緩衰老相關神經退行性疾病的發生［45］。除此之外，綠原酸還有降脂、抗腫瘤、抗癌等多種功效［46-47］。降脂可以通過激活腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine 5'-monophosphate-activated protein kinase, AMPK），抑制3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原的活性來調控脂質代謝［48］。抗腫瘤和抗癌則可以通過綠原酸阻滯細胞生長周期，抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡等多種機制得到緩解［47-48］。可見，綠原酸對改善人體健康至關重要，未來，也應多挖掘綠原酸保健品和綠原酸功能性食品。

2 綠原酸的生物合成途徑及關鍵酶基因

2.1 綠原酸的生物合成途徑

綠原酸的合成來源于復雜的苯丙烷途徑，根據現有文獻分析，總結出4條綠原酸的合成途徑（圖1）。首先，植物中的葡萄糖經過相關酶的催化轉化成莽草酸，再由莽草酸轉化成苯丙氨酸，而后在苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸4-羥化酶和4-香豆酸-輔酶A連接酶的連續催化下轉化為對香豆酰輔酶A。對香豆酰輔酶A是類黃酮與木質素生物合成的前體，同時也是綠原酸的合成路線的重要起點。（1）路線1為奎寧酸羥基肉桂酰轉移酶與對香豆酰輔酶A發生酯化反應形成對香豆酰奎寧酸，然后通過羥基化反應生成綠原酸［49］（圖1，路線1）。（2）路線2是對香豆酰輔酶A在莽草酸和對-香豆酸3-羥化酶的催化下生成咖啡酰輔酶A，咖啡酰輔酶A和奎寧酸在羥基肉桂酰輔酶A奎寧酸羥基肉桂酰轉移酶催化下生成綠原酸［50-51］（圖1，路線2）。（3）路線3是對香豆酸能在對-香豆酸3-羥化酶和肉桂酸-4-羥化酶催化下轉化為咖啡酸，然后在4-香豆酸-輔酶A連接酶與羥基肉桂酰輔酶A奎寧酸羥基肉桂酰轉移酶連續作用下生成綠原酸［49,52］（圖1，路線3）。（4）路線4是通過奎寧酸羥基肉桂酰基轉移酶將咖啡酰基葡萄糖苷轉化為綠原酸［50-51］（圖1，路線4）。

圖1 綠原酸的生物合成途徑Fig. 1 Biosynthesis pathway of chlorogenic acid

2.2 綠原酸合成途徑中的關鍵限速酶基因功能

在綠原酸的4條生物合成途徑中，其中苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羥化酶（C4H）、4-香豆酸-輔酶A連接酶（4CL）、對-香豆酸3-羥化酶（C3H）、莽草酸/奎尼酸羥基肉桂酰轉移酶（HCT）、羥基肉桂酰輔酶A奎尼羥基肉桂轉移酶（HQT）是綠原酸生物合成的關鍵酶，誘導其表達有助于提高植物中綠原酸的含量。

2.2.1 苯丙氨酸解氨酶 PAL是連接初生代謝和次生代謝的關鍵橋梁，能將苯丙氨酸催化轉化為肉桂酸，是控制前體進入苯酚途徑的代謝通量，也是影響累積的酚類化合物的總體水平重要組成部分［53］。因此，PAL在植物的生長發育、響應植物的生物與非生物應激防御，如機械損傷、紫外線等中起關鍵作用［54］。研究表明，綠原酸的積累與PAL的表達相關。在甘薯中，過量表達IbPAL1提高苯丙烷通量，促進了綠原酸在葉片中的積累［55］。同時，PAL基因在其他植物中也具有不同的功能。例如，在毛果楊（Populus trichocarpa）中，PtPAL1和PtPAL3可能負責單寧的產生，而PtPAL2、PtPAL4和PtPAL5可能在木質素生物合成中發揮作用［56］。可見，PAL不僅能促進綠原酸的生物合成，也會調控苯丙烷途徑中其他次生代謝物質的合成。

2.2.2 肉桂酸-4-羥化酶 C4H是催化苯丙烷途徑的第2個關鍵限速酶，定位于植物細胞的內質網，是細胞色素P450酶CYP73蛋白家族的成員［57］。作為P450蛋白，C4H催化不可逆反應，在氧和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH）的存在下，該酶以NADPH作為電子供體，將反式肉桂酸催化生成對香豆酸［57-58］（圖2）。在煙草中，NtC4H基因沉默上調了Nt4CL的表達，增加了綠原酸的含量［59］。因此，可通過C4H的沉默來誘導其他基因的表達，促進綠原酸的生物合成。

圖2 C4H催化原理Fig. 2 Catalytic mechanism of C4H

2.2.3 4-香豆酸-輔酶A連接酶 4CL是肉桂酸的主要分支點，可以將肉桂酸的衍生物，包括對香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和肉桂酸，轉化為不同類型的輔酶A，這些中間體是合成苯丙烷類化合物的基礎，如木質素、綠原酸和類黃酮類。在陸地棉（Gossypium hirsutum）中，過表達Gh4CL3提高了4CL活性，增強了肉桂酸、對香豆酸等酚類化合物前體，促進綠原酸的合成［60］。系統發育樹表明，4CL基因家族被分為class I和class II，表現出不同的功能，其中class I參與木質素的生物合成和創傷反應，class II參與類黃酮的合成［61］。4CL具有兩個保守的多肽基序：AMP結合結構域Box I（SSGTTGLPKGV）和Box II（GEICIRG），Box I在4CL蛋白家族和乙酰CoA合成酶等酰基活化酶中高度保守，是4CL蛋白直接催化底物的活性中心，Box II是4CL的絕對保守結構域但不直接參與催化，這可能與酶的空間構象有關［62-63］。由此可見，4CL在綠原酸、木質素和類黃酮的生物合成中扮演著重要角色。

2.2.4 對-香豆酸3-羥化酶 C3H是綠原酸合成途徑的另一個關鍵酶，也是脂肪酸、咖啡酸等酚酸生物合成途徑中的第2個羥化酶，屬于細胞色素P450單加氧酶中的CYP98A家族［64］。C3H可以決定木質素單體的碳源流向，并調控植物體內H單體向G單體和S單體轉換［65］。同時，C3H的表達也可以控制類黃酮和綠原酸等次生代謝物質的合成。在煙草中，過量表達NtC3H使煙草葉片中綠原酸和蘆丁的含量分別提高了3.6倍和6.1倍［66］。可見，C3H正向調控綠原酸的生物合成。

2.2.5 莽草酸/奎尼酸羥基肉桂酰轉移酶 HCT屬于BAHD酰基轉移酶家族，存在兩個共同的保守結構域，包括HXXXD和DFGWG，在所有陸生植物中都是保守的［67］。在參與的苯丙烷代謝途徑中，由于其位于C3H催化的羥基化過程的上游與下游結合處，能同時調控上下游的靶基因，既能生成對香豆酰草莽酸/奎寧酸來作為C3H酶作用的底物，又能將C3H催化生成的產物咖啡酰草莽酸/奎寧酸轉變為咖啡酰輔酶A，因此認為HCT在苯丙烷羥基化途徑中具有雙重作用［68］。HCT具有底物普適性，以咖啡酰輔酶A、對香豆酰輔酶A和阿魏酰輔酶A等多種酰基輔酶作為酰基供體。對煙草中純化得到的HCT活性進行分析表明，對香豆酰輔酶A和咖啡酰輔酶A是HCT最匹配的酰基供體，且酰基轉移到莽草酸酯比奎尼酸酯更為有效，說明該酶對莽草酸的親和力更高［69］。HCT是綠原酸合成途徑中的關鍵酶。在煙草中過量表達NtHCT，轉基因煙草葉片中的綠原酸提高了2.0-6.3倍，而將本式煙草（Nicotiana benthamiana）NbHCT基因沉默表達后，煙草葉片中綠原酸含量降低，表明HCT可正向調控綠原酸的合成［70］。同時，HCT也是木質素單體合成途徑中的關鍵酶。煙草中HCT基因表達下調會導致木質素中H單元增加，G單元和S單元降低，使木質素含量降低，植株多莖矮小，但在二穗短柄草（Brachypodium distachyon）中HCT基因表達的下調對木質素的組成影響不大［71-72］。可見，HCT具有雙重功能，在合成綠原酸與木質素發揮重要作用，但二者之間是否存在疊加影響有待繼續研究。

2.2.6 羥基肉桂酰輔酶A奎尼羥基肉桂轉移酶HQT也屬于BAHD酰基轉移酶家族，亦包含HXXXD和DFGWG兩個基因序列［67］。而在三葉鬼針草（Bidens pilosa）、紫錐菊（Echinacea purpurea）、灰氈毛忍冬（Lonicera macranthoides）和白掌（Spathiphyllum floribundum ‘Clevelandii’）等植物中還檢測出HQT的HTLSD基序［73］。HQT基因有3種異構型，即HQT1、HQT2和HQT3［73］。3種異構型表現出組織特異性，例如，在朝鮮薊（Cynara scolymus）中，HQT1在苞片中的表達水平較高，是葉組織的4.3倍，HQT2在莖和6周齡的葉組織中表達最強，HQT3在莖組織中的表達水平非常高，是葉組織的17倍［74］。研究發現，HQT與HCT是緊密連鎖的。不同于HCT的底物普適性，HQT具有底物特異性，是參與綠原酸生物合成的最后一步關鍵限速酶，可催化咖啡酰輔酶A和奎尼酸進行酯交換生成結構不同的綠原酸［75］。在丹東蒲公英（Taraxacum antungense）中，過量表達TaHQT使蒲公英葉片中綠原酸含量提高了82.49%［76］。朝鮮薊中過量表達HQT1、HQT2和HQT3，顯著增加了轉基因朝鮮薊葉片中綠原酸含量［74］。然而，沉默NtHQT基因表達，使煙草中的綠原酸含量顯著降低［71］。因此，通過誘導HQT的表達是提高植株體內綠原酸生物合成的重要途徑之一。

3 綠原酸生物合成調控

3.1 轉錄因子對綠原酸合成調控的影響

轉錄因子（transcription factor, TF）是一類重要的具有序列特異性的DNA結合蛋白，通過與靶基因啟動子中的順式作用元件特異性結合，調控參與眾多植物代謝過程中的基因表達［77］。常見的轉錄因子包括WRKY、MYB（v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog）和bHLH（basic helix-loop-helix）等，它們在綠原酸合成調控中扮演著不同的角色。

3.1.1 WRKY轉錄因子 WRKY是植物特有的鋅指型轉錄調控因子，其可以與順式作用元件W-box、WT-box、PRE和SURE特異性結合，從而調控目的基因的表達。植物WRKY基因家族在進化過程中主要被分為Group I、Group II和Group III三大類，在植物的生長發育、抵御生物與非生物脅迫中起重要作用。值得注意的是，WRKY亦參與苯丙烷途徑調控。尤其在綠原酸生物合成途徑中，WRKY能與綠原酸合成關鍵酶基因共表達。例如，共表達網絡分析表明，WRKY在C4H中存在結合位點，表明WRKY參與綠原酸合成調控［78］。EMSA分析表明在桃樹（Prunus persica）中PpWRKY70與Pp4CL啟動子中的W-box特異結合，從而調控綠原酸、新綠原酸等苯丙烷類化合物的生物合成［79］。在蒲公英中過量表達TaWRKY14，可調控TaPAL1的表達，促使綠原酸含量得到提高［80］。楊樹（Populus）原生質體瞬時表達系統中驗證表明，PtHCT2受防御反應WRKY的調控，其葉片表達量與綠原酸含量顯著相關［81］。

3.1.2 MYB轉錄因子 MYB廣泛存在于植物中，根據結構域，將MYB分為1R、R2R3、3R、4R四種類型。MYB 轉錄因子被證實參與調控植物苯丙烷類化合物代謝。在煙草中過表達NtMYB59 基因可顯著的提高煙草葉片中的綠原酸含量，說明NtMYB59能夠正向調控煙草中的綠原酸合成［82］。通過酵母單雜交和雙熒光素酶報告基因實驗證實，灰氈毛忍冬中LmMYB15可調控4CL基因表達，促使其綠原酸的生物合成和苯丙素的代謝［50］。另外，MYB與苯丙烷途徑中HQT基因也呈正相關關系，可上調HQT基因的表達來增加綠原酸的含量。研究表明，AtMYB12能使HQT基因上調表達，顯著提高轉基因馬鈴薯（Solanum tuberosum）體內綠原酸的含量［83］。然而，MYB也對苯丙烷合成途徑起抑制作用。例如，在楊樹中過表達MYB165和MYB194顯著下調PAL1表達，導致苯丙烷類化合物含量降低［84］。類似地，茶樹（Camellia sinensis）CsMYB4a基因的表達與酚酸的積累呈負相關性，并在煙草中過表達時，顯著抑制苯丙烷類途徑基因C4H和4CL表達，引起綠原酸含量的降低［85］。而同樣是過表達MYB1，在茄子（Solanum melongena）中可促進綠原酸增加，在煙草中則會抑制綠原酸［86-87］。說明，轉錄因子MYB 在不同植物綠原酸合成調控中亦發揮不同的作用，具體的調控機理需進一步地研究探索。

3.1.3 其他轉錄因子 bHLH家族蛋白保守結構域約含60個氨基酸，能識別并特異性結合E-box（CATGTG）、G-box（CACGTG）等順式作用元件來調控植物次生代謝物質的合成。雙熒光素酶、酵母單雜交和凝膠遷移率改變分析表明，在丹東蒲公英中，過表達TabHLH1通過E-box基序直接與TaHQT2和Ta4CL啟動子結合，顯著上調TaHQT2和Ta4CL基因表達，從而調控綠原酸的合成與積累［88］。除此之外，ERF（ethylene responsive factor）、bZIP（basic region-leucine zipper）等轉錄因子也可以正向或負向調控綠原酸的合成。例如，在煙草中，過表達NtERF13a可通過直接結合NtHCT基因啟動子中的GCC box和DRE元件，誘導NtHCT基因的mRNA豐度，促進煙草葉片中綠原酸的積累［89］。金銀花中，LjbZIP8在轉基因煙草中過表達時，則抑制了NtPAL1、NtPAL2和NtPAL4的表達，降低了新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸的含量，表明LjbZIP8是一個轉錄抑制因子［90］。在灰氈毛忍冬中，LmHY5基因的沉默會導致轉本氏煙草（Nicotiana benthamiana）葉片中綠原酸含量顯著降低，表明HY5與綠原酸積累之間存在正調控關系［91］。另外，轉錄因子之間也可以協同表達。香蕉（Musa nana）中，過表達MusaMYC29協同激活WRKY和bHLH的表達，進而提高綠原酸的含量［92］。

3.2 外源誘導對綠原酸含量的影響

3.2.1 生物脅迫 生物脅迫如病菌侵害會在植物中引發與防御相關的反應，使抗菌化合物積累，而綠原酸作為植物中最重要的防御性酚類化合物之一，在病原體攻擊時其含量會相應的增加或減少。葡萄（Vitis vinifera）在感染霜霉病和白粉病后，不同葡萄品種的綠原酸含量發生了不同程度的變化，如圓葉葡萄和美洲葡萄品種的綠原酸含量會增加，歐亞種葡萄綠原酸含量則減少［93］。同樣，病菌侵害也可以通過增加綠原酸合成途徑關鍵酶如PAL1、C4H、HQT和HCT等的轉錄水平來提高綠原酸的含量。例如，索邦（Sorbonne）在橢圓葡萄孢的侵染下，PAL與HCT會上調表達，促進綠原酸積累［94］。但關鍵酶的轉錄水平也會隨病菌的類型以及侵染時間而發生變化。向日葵（Helianthus annuus）在立枯絲核菌或叢枝菌根真菌的侵染下，HCT的表達隨侵染時間而增加，HQT和C3H的表達會隨侵染時間的延長逐漸減少［95］。而同樣是叢枝菌根真菌侵染，不同植物關鍵酶轉錄水平會出現相反情況，例如在向日葵中會上調C4H的表達，在番茄中卻會下調C4H的表達［95-96］。可見，適當的生物脅迫可以促進綠原酸的積累，進而提高植物的防御系統。

3.2.2 非生物脅迫 非生物脅迫包括干旱、低溫、鹽、重金屬等，植物對各種非生物脅迫會產生不同的生理性反應，通過調整由初生代謝轉向次生代謝來構建防御體系，建立抵抗或適應環境脅迫的物理屏障和化學屏障。研究表明，非生物脅迫會導致氧化應激，是由于活性氧（reactive oxygen species, ROS）的產生和消除速率之間的平衡失調引起的［97］。而氧化應激誘導的自由基與植物代謝途徑中的許多化學物質相互作用，導致產生綠原酸、類黃酮等植物次生代謝物質［98］。綠原酸則清除過量產生的ROS，減少細胞膜過氧化，從而保護細胞免受氧化應激的傷害，提高植物的抗逆性。

非生物脅迫可以使綠原酸生物合成途徑相關酶活性和基因表達升高，從而使綠原酸積累。例如，低溫、干旱以及鹽脅迫可以誘導HCT的表達，重金屬脅迫可使PAL和HCT的表達上調［99-100］。同時，綠原酸的含量還會受到脅迫程度的不同作出相應的變化。在香青蘭（Dracocephalum moldavica）中，隨著干旱程度的升高，呈現出先升高后下降的趨勢，在中度干旱時綠原酸含量最高［101］。表明在一定脅迫程度范圍內能促進綠原酸的合成。而不同植物對非生物脅迫的耐受性不同，同種脅迫會導致綠原酸含量的變化存在相反的結果。例如在玉米（Zea mays）中重金屬脅迫會使綠原酸含量增加，而在番茄中則會使綠原酸含量下降［102-103］。因此，可以通過適當濃度的非生物脅迫提高綠原酸的含量，進而在提高植物抗逆性的同時還能促進植物的生長。

3.2.3 外源處理 植物激素在調節植物代謝中起重要作用。在甘薯中，脫落酸（abscisic acid, ABA）、水楊酸（salicylic acid, SA）和赤霉素（gibberellin,GA）處理72 h后，PAL、C4H、HCT和HQT得到相應表達，促進甘薯莖尖綠原酸含量增加［104］。草莓（Fragaria×ananassa Duch.）施加乙烯（ethylene,ET）后，誘導了ABA的積累，兩種激素協同作用，促進了綠原酸的增加［105］。在獼猴桃（Actinidia chinensis Planch.）中外源施加茉莉酸甲酯（methyl jasmonate, MeJA）后，PAL、4CL和C4H基因及MYC轉錄因子均被上調表達，促進了綠原酸的積累［106］。除此外，外源施加油菜素甾醇（brassinosteroid, BRs）、多巴胺（dopamine, DA）、褪黑素（melatonin, MT）以及胰蛋白酶后，均能提高綠原酸的含量，并增強植物的抗逆性［107-110］。

值得注意的是，通過改變生長條件也可以調節綠原酸的合成。研究表明，光質、光周期、CO2濃度和空氣溫度通過調節相應生物合成途徑關鍵酶基因如PAL、C4H及C3H等，對綠原酸含量產生影響［111］。光通過兩種方式調控綠原酸的積累與合成，一方面，光作為物質基礎調節碳水化合物和其他初級代謝產物的合成，另一方面，通過光信號調控關鍵酶及下游基因的轉錄表達，改變綠原酸含量。例如遮光后，HY5被誘導表達，從而積累綠原酸［91］。光質的不同會影響綠原酸的積累。例如，生菜（Lactuca sativa var. ramosa Hort.）培養條件中補充藍光和紅光，會顯著增加綠原酸含量，而補充遠紅光則抑制綠原酸的合成［112］。而生菜中綠原酸含量在不同光周期條件下也發生變化，其中每100 g鮮重在光照24 h/黑暗0 h條件下比光照12 h/黑暗12 h時含量高出4倍，每100 g干重在光照24 h/黑暗0 h條件下比光照12 h/黑暗12 h時含量高出2倍，表明持續光照有利于綠原酸的積累［113］。同時，在高CO2濃度下，生菜中的綠原酸含量增加，但在連續光照、高光照強度和高CO2協調作用下，會抑制綠原酸的積累［113］。另外，空氣溫度也是影響綠原酸含量的重要因素。研究表明，生菜體內綠原酸含量隨空氣溫度的降低而增加，空氣溫度在15℃時的含量是25℃時的1.6倍［111］。因此，可以通過施加植物生長激素以及優化外界生長環境來提高綠原酸的含量。

4 總結與展望

綠原酸作為一種重要的次生代謝物質，廣泛存在于植物中，因其較強的生物活性和藥理作用，在植物的生長發育和抗逆性、食品風味調節、預防和治療人類疾病以及畜牧生產中發揮重大作用。綠原酸的合成來源于苯丙烷代謝途徑，現發現綠原酸的合成途徑有4條，在合成過程中會涉及到大量的酶。目前研究對涉及綠原酸生物合成途徑的相關關鍵限速酶進行了酶活性分析，并對相應的關鍵限速酶基因進行了克隆、表達分析以及功能鑒定。然而，綠原酸的生物合成是一個十分復雜的基因互作網絡，涉及的轉錄因子數量龐大，現階段主要對MYB、WRKY和bHLH研究得較多，對于其他未知的并參與綠原酸生物合成途徑的轉錄因子還有待挖掘。植物中綠原酸含量的高低不僅受基因表達水平的影響，同時也因環境條件的差異而不同，因此可以通過物理和化學等手段誘導相關酶的編碼基因表達，如合理范圍內增加光照時間、CO2濃度的增加以及適度的生物脅迫與非生物脅迫等，以提高植物中綠原酸的生物合成量。

目前對綠原酸的生物合成途徑及調控途徑研究日益增多并取得一定的成果，但仍存在以下問題需要突破：（1）天然綠原酸含量低，生產成本高且生物利用率低，而生物利用率是決定綠原酸生物活性的先決條件，需要在降低生產成本的同時確保提取高質量綠原酸并提高綠原酸生物利用率，例如優化提取工藝等。（2）隨著對綠原酸研究的不斷深入，綠原酸生物合成途徑關鍵酶與轉錄因子相繼被發現，但他們之間的調控關系還需進一步探討。（3）苯丙烷代謝途徑有很多分支，各分支的相互關系及調控機制研究較少，加強其他分支調控綠原酸途徑的研究，將有助于通過其他代謝途徑提高綠原酸的合成。（4）通過外源誘導可以影響綠原酸的積累，但不同脅迫之間和不同環境因子之間的拮抗或協同作用以及各關鍵基因節點對環境的響應研究不夠全面，需進一步深入研究。

未來，應借助基因組學、多組學（蛋白質組、轉錄組、代謝組、表型組）以及酶化學等聯合手段，進一步對綠原酸生物合成與調控機制進行深入探索，以期為綠原酸的合理開發利用以及作物或牧草抗逆遺傳改良提供參考。