Surfactin的結(jié)構(gòu)、生物合成及其在生物防治中的作用

王俊芳 黃秋斌 張飄丹 張彭湃

（河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，開(kāi)封 475004）

脂肽是由微生物產(chǎn)生的一類低分子量生物表面活性劑，這類活性物質(zhì)具有獨(dú)特的兩親性分子結(jié)構(gòu)，由氨基酸結(jié)合形成極性親水肽鍵與由脂肪酸烴鏈組成的非極性疏水基構(gòu)成［1］。因此，脂肽類表現(xiàn)出多樣的生物活性，如抗菌、抗炎和環(huán)境修復(fù)等生物活性，其在醫(yī)藥、化工、農(nóng)業(yè)、食品和環(huán)境治理等領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用［2-3］。依據(jù)肽鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的不同，微生物所產(chǎn)脂肽可以分為線性脂肽和環(huán)狀脂肽。線性脂肽是由氨基酸肽鏈與脂肪酸鏈結(jié)合形成鏈狀的脂肽化合物。環(huán)脂肽是由氨基酸肽鏈連接成環(huán)或肽鏈氨基酸上的羧基與部分脂肪酸鏈上的羥基或氨基結(jié)合形成內(nèi)脂鍵或酰胺鍵，成為環(huán)狀的脂肽化合物。根據(jù)合成脂肽的基因簇和化學(xué)結(jié)構(gòu)的差異，芽孢桿菌（Bacillus spp.）所產(chǎn)脂肽主要有表面活性素（surfactin）、伊枯草菌素（iturin）、泛革素（fengycin）3大家族［4］，其結(jié)構(gòu)如圖1所示，多為環(huán)脂肽形式，它們的脂質(zhì)部分都是由異構(gòu)或長(zhǎng)度和飽和狀態(tài)不同的β-羥基脂肪酸（fatty acid, FA）鏈組成，肽段由7個(gè)（surfactins, iturin）或10個(gè)（fengycin）L或D型的氨基酸殘基組成［5］。本文主要介紹芽孢桿菌分泌的surfactin的結(jié)構(gòu)、生物合成機(jī)制、結(jié)構(gòu)多樣性及其在農(nóng)業(yè)中的生防作用等。

圖1 Surfactin、fengycin和iturin A的結(jié)構(gòu)Fig. 1 Structures of surfactin, fengycin and iturin A

1 Surfactin的結(jié)構(gòu)及生物合成

1.1 Surfactin的結(jié)構(gòu)

Surfactin是被研究的最多的生物表面活性劑。1968年，Arima等［6］在研究微生物代謝產(chǎn)物對(duì)纖溶系統(tǒng)和凝血系統(tǒng)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，了幾株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）菌株分泌到發(fā)酵液中的一種強(qiáng)效凝血抑制劑，經(jīng)分離純化凝血抑制劑為淺黃色針狀物，由于它的高表面活性超過(guò)了十二烷基磺酸鈉，因此被命名為“表面活性素（surfactin）”。Kakinuma等［7-8］通過(guò)對(duì)surfactin氨基酸序列和脂肪酸鏈分析闡明了其結(jié)構(gòu)，surfactin具有親水性肽段和親脂性脂肪酸鏈的兩親性，有特殊的表面活性。Surfactin是具有共同結(jié)構(gòu)特征的一個(gè)脂肽家族，該家族的肽鏈為七元肽，結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是由7個(gè)α-氨基酸殘基的短肽與鏈長(zhǎng)12-17個(gè)碳原子的β-羥基脂肪酸通過(guò)內(nèi)酯鍵交聯(lián)組成的環(huán)狀物質(zhì)。Surfactin家族典型的氨基酸順序?yàn)椋篖-Glu1-L-Leu2-D-Leu3-L-Val4-L-Asp5-D-Leu6-L-Leu7，它們具有手性序列［9］，位置3和6含有D型氨基酸殘基，兩個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸殘基Glu和Asp組成surfactin的極性部分（在天然surfactin分子中），其分子形成馬鞍形構(gòu)象，導(dǎo)致兩個(gè)氨基酸殘基形成一個(gè)極性帶負(fù)電荷的爪狀結(jié)構(gòu)，電離時(shí)具有螯合能力（pKa = 5.8），因此，surfactin具有可以通過(guò)pH值來(lái)控制的螯合和吸附性能。

利用核磁共振氫譜（nuclear magnetic resonance,H NMR）技術(shù)檢測(cè)surfactin的三維結(jié)構(gòu)，研究表明，surfactin存在一個(gè)親水結(jié)構(gòu)域和一個(gè)疏水結(jié)構(gòu)域。親水結(jié)構(gòu)域由環(huán)肽的主鏈及其兩個(gè)帶負(fù)電荷的Glu1和Asp5氨基酸殘基形成。疏水結(jié)構(gòu)域由脂肪酸鏈和Leu2、Leu3、Val4、Leu6和Leu7氨基酸殘基形成［10］，這種雙結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)使surfactin具有兩親性，因此決定了其具有高的表面活性。濃度為20 μmol/L的surfactin可以將水的表面張力從72 mN/（mol·L）降低到27 mN/（mol·L），這大大低于文獻(xiàn)中大多數(shù)生物表面活性劑的表面張力［11］。Surfactin在細(xì)胞中利用蛋白質(zhì)在水介質(zhì)中的β-片層結(jié)構(gòu)形成的特殊構(gòu)象，從而賦予surfactin分子廣泛的生物活性，它們通過(guò)幾種干擾機(jī)制破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，具有抗菌活性，如通過(guò)類洗滌劑機(jī)制使細(xì)胞膜溶解、包裹磷脂雙分子層，通過(guò)離子擴(kuò)散穿過(guò)膜屏障或形成孔狀通道等而改變膜的滲透性等生物活性［12-13］。由于不同菌株產(chǎn)生的surfactins的氨基酸殘基和脂肪酸鏈組成不同，變異性大，導(dǎo)致surfactin的生物活性具有多樣性。Surfactin具有抗細(xì)菌、抗真菌、抗炎、溶栓、環(huán)境修復(fù)、抗支原體、抗高膽固醇、抗病毒、抗癌活性和對(duì)胰島素抵抗的改善等生物活性［14-22］。

1.2 Surfactins的生物合成

Surfactins的生物合成包括脂肪酸的合成及活化、氨基酸的合成、肽段的合成和釋放幾部分組成，下面主要介紹其肽部分和脂肪酸的合成。

1.2.1 Surfactins肽部分的生物合成 通過(guò)對(duì)surfactin脂肽合成相關(guān)基因鑒定分析，證明surfactin的肽部分是由非核糖體肽合成酶（nonribosomal peptide synthetases, NRPSs）催化合成［23］，這種機(jī)制賦予surfactin家族成員的脂肽結(jié)構(gòu)及活性多樣化。非核糖體脂肽的生物合成主要分為兩部分進(jìn)行：（1）單體物質(zhì)（脂肪酸和氨基酸）的生物合成，屬于初級(jí)代謝；（2）組裝和釋放，屬于次級(jí)代謝（非核糖體肽的合成過(guò)程見(jiàn)圖2）。NRPS是一種由重復(fù)模塊組成的多模塊巨型酶復(fù)合體，模塊被定義為NRPS的一部分，其功能是將一個(gè)特定的氨基酸結(jié)合到肽骨架中。模塊的順序通常與產(chǎn)物肽序列共線性，每個(gè)模塊又可以分解為以下3個(gè)主要結(jié)構(gòu)域：腺苷酸（adenylation, A）結(jié)構(gòu)域、巰基化（thiolation, T）結(jié)構(gòu)域（又稱肽基載體蛋白（peptidyl carrier protein,PCP-））和縮合（condensation, C）結(jié)構(gòu)域［24］。A結(jié)構(gòu)域識(shí)別、選擇并激活特定氨基酸，通過(guò)與ATP的反應(yīng)催化特定氨基酸轉(zhuǎn)化為氨基?；佘账?。一些特異性低的A結(jié)構(gòu)域，可以激活結(jié)構(gòu)相似的氨基酸殘基，如Val、Leu和Ile等氨基酸，這種低特異性增加了同一NRPS合成的脂肽的結(jié)構(gòu)及活性多樣化?；罨陌被嵋粤蝓サ男问焦矁r(jià)結(jié)合到T結(jié)構(gòu)域的柔性輔基4'-磷酸泛酰巰基乙胺基（4'-Ppant）臂上，形成氨?；?S-載體復(fù)合物；4'-Ppant輔基的長(zhǎng)度為20 ?，可以在相鄰的催化中心之間擺動(dòng)，正是這種靈活性使活化的氨基酸底物能夠轉(zhuǎn)移到C結(jié)構(gòu)域［25］。C結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)催化（i）新生肽和相鄰模塊攜帶的氨基酸之間形成肽鍵，并允許隨后（ii）延伸鏈易位到下一個(gè)模塊。C結(jié)構(gòu)域分為幾種功能亞型，如LCL結(jié)構(gòu)域催化兩個(gè)L -氨基酸之間的肽鍵形成，而DCL結(jié)構(gòu)域則催化L -氨基酸與以D -氨基酸結(jié)尾的延伸肽之間的肽鍵形成。A-T模塊被認(rèn)為是起始模塊，C-A-T模塊被定義為延伸模塊，在幾個(gè)模塊介導(dǎo)的肽延伸循環(huán)之后，末端硫酯酶（thioesterase, TE）結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)釋放完整的線性中間肽，并催化其內(nèi)部環(huán)化［26］。除了上述結(jié)構(gòu)域，NRPS裝配線還進(jìn)一步包括其他修飾結(jié)構(gòu)域，如催化修飾氨基酸結(jié)構(gòu)的差向異構(gòu)化（epimerization, E）結(jié)構(gòu)域［27］。

圖2 非核糖體肽生物合成的原理Fig. 2 Principle of non-ribosomal peptide（NRP）biosynthesis

Surfactin的生物合成啟動(dòng)模塊采用C-A-T結(jié)構(gòu)，而不是經(jīng)典的A-T結(jié)構(gòu)，該模塊包含一個(gè)特殊的N-末端C-結(jié)構(gòu)域［28］，稱為C-起始（CS）結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)已活化β-羥基脂肪酸與第一個(gè)氨基酸殘基的連接，活性脂肪酸主要來(lái)源于初級(jí)代謝［29］。對(duì)于surfactins家族，催化合成surfactins的酶由srfA操縱子轉(zhuǎn)錄，有srfAA、srfAB、srfAC和srfAD四個(gè)結(jié)構(gòu)基因編碼7模塊NRPSs裝配線（圖3），通過(guò)這些基因獲得的7模塊NRPS裝配線中，srfAA編碼前3個(gè)模塊，其包含有CLP生物合成基因簇（biosynthetic gene clusters,BGCs）的N末端典型CS結(jié)構(gòu)域，將第一個(gè)氨基酸Glu1與初級(jí)代謝產(chǎn)生的β-羥基脂肪酸?；B接；srfAB編碼4、5和6三個(gè)模塊、srfAC編碼第7個(gè)模塊和末端TE；起始肽隨后通過(guò)SrfAA、SrfAB和SrfAC的延伸模塊以共線性方式延伸，產(chǎn)生線性七肽（FA-L-Glu1-L-Leu2-D-Leu3-L-Val4-L-Asp5-D-Leu6-L-Leu7），立體化學(xué)結(jié)構(gòu)可以很容易地分析出模塊M3和M6中存在E結(jié)構(gòu)域以及模塊M4和M7中存在DCL結(jié)構(gòu)域。SrfAA催化前3位氨基酸的組裝，SrfAB催化肽鏈4-6位氨基酸的組裝；SrfAC催化肽鏈第7位氨基酸的組裝，最后，SrfAC的TE結(jié)構(gòu)域催化釋放脂肽，并催化在Leu7與β-羥基脂肪酸的羥基之間形成內(nèi)脂鍵進(jìn)行大環(huán)化［30-31］。值得注意的是，srfAD編碼刺激surfactin生物合成起始的IITE/酰基轉(zhuǎn)移酶，屬于水解酶家族成員，該結(jié)構(gòu)域相當(dāng)于一種支持性修復(fù)酶，能夠在NRPS組裝過(guò)程中再生定位錯(cuò)誤的T結(jié)構(gòu)域［32-33］。

圖3 Surfactin合成基因簇組成Fig. 3 Composition of gene cluster of surfactin biosynthesis

除以上結(jié)構(gòu)基因外，surfactin生物合成基因簇（BGCs）還包括一些輔助基因，如編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和調(diào)控蛋白的基因ycxA、 krsE和yerP基因，以及與surfactin合成特別相關(guān)的基因或調(diào)控系統(tǒng)，如sfp、degU、codY基因及感受態(tài)調(diào)控系統(tǒng)ComQXPA等。

在B. subtilis中surfactin的生物合成受到感受態(tài)調(diào)控系統(tǒng)ComQXPA（Com是compotence的縮寫(xiě)）的調(diào)控，該系統(tǒng)由comX、comQ、comP和comA等4個(gè)結(jié)構(gòu)基因組成。相應(yīng)編碼產(chǎn)物為ComX信息素、群體信號(hào)傳感器ComP一種組氨酸激酶（histidine sensor kinase）和應(yīng)答調(diào)節(jié)因子（response regulor）ComA［34-35］。srfA-A與comA基因相隔，磷酸化的ComA（ComA-P）能促進(jìn)RNA聚合酶與srfA啟動(dòng)子的結(jié)合，激活srfA RNA聚合酶的起始轉(zhuǎn)錄［36］。全局調(diào)控因子CodY和天冬氨酰基磷酸酶Rap負(fù)調(diào)控surfactin的生物合成，天冬氨?；姿崦窻ap 使ComA-P脫磷酸化，阻止操縱子srfA轉(zhuǎn)錄［37］；過(guò)量CodY直接作用于srfA啟動(dòng)子，抑制其轉(zhuǎn)錄進(jìn)行；而全局調(diào)控因子DegU正調(diào)控surfactin的生物合成［38］。

芽孢桿菌sfp基因位于srfA下游約4 kb處（圖3-A），其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物Sfp為磷酸泛乙烯基轉(zhuǎn)移酶（PPTase）。NRPS的T結(jié)構(gòu)域是以無(wú)活性功能的apo形式新生存在，需在Sfp酶催化下T結(jié)構(gòu)域的柔性輔基4'-Ppant產(chǎn)生一個(gè)可與氨基酰-腺苷酸反應(yīng)的巰基，將T結(jié)構(gòu)域激活為其全活性holo形式，從而在T結(jié)構(gòu)域和氨基酸殘基的羧酸基團(tuán)之間形成硫酯鍵，氨?；?S-載體復(fù)合物形成。如在B. subtilis 168菌株中剪切部分sfp基因，導(dǎo)致其功能喪失，突變株不能合成surfactin；然而，通過(guò)轉(zhuǎn)移一個(gè)完整的sfp位點(diǎn)，其互補(bǔ)菌株恢復(fù)了合成surfactin的能力，這也證明Sfp對(duì)于surfactin的合成必不可少［39］。

在合成surfactin的背景下，編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因（如ycxA，位點(diǎn)見(jiàn)圖3-A）也是其生物合成的重要基因，這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白類似外排泵，從生理學(xué)角度來(lái)看，外排泵可避免細(xì)胞內(nèi)surfactin的大量積聚，并構(gòu)成一種基本的自我保護(hù)機(jī)制［40］，特別是由于surfactin具有插入生物膜和在較高濃度導(dǎo)致膜破壞的能力，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的生態(tài)學(xué)原理是使surfactin處于細(xì)胞外可能是其正確的位置，在胞外它可以發(fā)揮有益的生物活性。到目前為止，已在芽孢桿菌中鑒定出3種參與surfactin外排的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，即YcxA、KrsE和YerP。已經(jīng)證明，相應(yīng)基因的單獨(dú)過(guò)表達(dá)分別使surfactin的外排釋放率提高了89%、52%和145%［41］。

1.2.2 Surfactins脂肪酸鏈的生物合成 由于脂肪酸生物合成在surfactin生產(chǎn)中起著關(guān)鍵作用，并強(qiáng)烈決定了其生物活性和性質(zhì)，因此對(duì)這一中心代謝途徑以及導(dǎo)致脂酰-CoA前體修飾和激活的后續(xù)步驟進(jìn)行總結(jié)。脂肪酸的合成在細(xì)胞溶膠中進(jìn)行，包括脂肪酸鏈自乙酰-CoA獲得兩個(gè)碳原子單元，從而增長(zhǎng)鏈長(zhǎng)的若干步驟。第一輪回的產(chǎn)物是丁酰-ACP，丁酰-ACP可以進(jìn)入第二輪回的碳鏈延伸。如此下去，每一循環(huán)碳鏈即延伸兩個(gè)碳原子單元［42］。乙酰-CoA被用作合成直鏈脂肪酸的底物，而支鏈脂肪酸（branch chain fatty acid, BCFA）的合成由異丁?；?CoA、異戊?；?CoA和甲基丁?；?CoA作為底物，這些前體分別來(lái)源于Val、Leu和Ile等支鏈氨基酸的分解代謝。碳鏈延伸至終產(chǎn)物形成，終產(chǎn)物脂酰-ACP在脂酰-ACP硫酯酶催化作用下FA被釋放，游離出來(lái)。

長(zhǎng)鏈FA被合成后，surfactin生物合成所需的下一個(gè)步驟是對(duì)底物長(zhǎng)鏈FA的活化，即β-羥基酰基-CoA的生成。Youssef等［43］基于體外測(cè)定，研究表明?；u基化發(fā)生在與輔酶A（CoA）連接之前，催化FA前體羥基化的YbdT是一種細(xì)胞色素P450酶。枯草芽孢桿菌基因組包含8個(gè)編碼細(xì)胞色素P450酶的基因，B. subtilis OKB105菌株的ybdT突變菌株產(chǎn)生的surfactin中只有2.2%的β-羥基化C14的FA，而菌株的97.8% surfactin為含有鏈長(zhǎng)C12和C14-C18的非羥基化FA［44］。羥基化FA和CoA通過(guò)脂酰-CoA連接酶（FACS）催化，生成相應(yīng)的β-羥基?；?CoA衍生物，至此FA被活化完成。在B.subtilis基因組同源性搜索中確定4個(gè)FACS（LcfA、YhfL、YhfT和YngI），其中LcfA和YhfL在體外鑒定中參與了surfactin的合成，利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（high performance liquid chromatography- mass spectrometry,HPLC-MS）對(duì)FACS的活性分析表明，LcfA和YhfL可催化CoA和各種羥基化FA底物（β-OH C8、β-OH C10、C12和C14）形成β-羥基酰基-CoA。最后，surfactin合成酶NRPSs裝配線可以在β-羥基?；?CoA衍生物存在的情況下啟動(dòng)，在由N-末端縮合（CS）結(jié)構(gòu)域進(jìn)行催化的反應(yīng)中，活化的FA最終轉(zhuǎn)移到surfactin合成酶NRPSs裝配線上，并與第一個(gè)氨基酸相連接。如上所述，該反應(yīng)負(fù)責(zé)啟動(dòng)脂肽的初始合成［45］。

2 Surfactin家族結(jié)構(gòu)多樣性

枯草芽孢桿菌（B. subtilis）、貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensi）、解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）、地衣芽孢桿菌（B. licheniformis）和短小芽孢桿菌（B.pumillus）等多種芽孢桿菌能合成surfactin（美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心）。Surfactin是由多種結(jié)構(gòu)相似同系物組成的混合物，統(tǒng)稱為surfactin家族，其結(jié)構(gòu)上的差別主要在于脂肪酸鏈的長(zhǎng)度以及肽環(huán)特定氨基酸種類的不同。根據(jù)多肽第7位氨基酸的不同，將surfactin的同系物分為A、B、C三類：Surfactin A類的第7位氨基酸為L(zhǎng)-Leu7，其結(jié)構(gòu)是由一個(gè)手性序列七肽（L-Glu1-L-Leu2-D-Leu3-L-Val4-L-Asp5-DLeu6-L-Leu7）與一個(gè)有12-17個(gè)碳原子的β-羥基脂肪酸相連［46-48］。Surfactin B類肽鏈上第7位氨基酸為L(zhǎng)-Val7，其同系物與標(biāo)準(zhǔn)surfactin A的結(jié)構(gòu)不同，命名為Val7 surfactin同系物［49］。Surfactin C類肽鏈的第7位氨基酸為L(zhǎng)-Ile7，被命名為Ile7 surfactin同系物［50］。此外，由 B. licheniformis菌生物合成的脂肽地衣素（lichenysin）也隸屬surfactins家族，理化性質(zhì)與surfactin極為相似的脂肽類表面活性劑。然而，lichenysin與 surfactin A不同在于，前者第一位氨基酸殘基是Gln而不是Glu，該類脂肽表面活性更高，還是很好的螯合劑［51］。由B. pumillus生物合成的脂肽短小酸素（pumilacidins）也隸屬surfactins家族，Pumilacidins與surfactins A的不同之處在于第4位的Leu4取代Val4，第7位的Val或Ile取代Leu［52］。此外，還觀察到surfactins不同程度的其他結(jié)構(gòu)多樣性，如對(duì)于同一菌株，所產(chǎn)生脂肽的一個(gè)氨基酸殘基發(fā)生變化，從而形成不同的肽鏈，這種變化的起源是由于NRPS中A結(jié)構(gòu)域的低特異性，對(duì)于2、4和7位置的氨基酸存在更大的可變性，接受的氨基酸屬于脂肪族氨基酸（Leu、Val、Ile和Ala）；對(duì)于其他位置1、3、5和6的氨基酸缺乏可變性，可能是由于氨基酸的類型（Glu1和Asp5帶負(fù)電荷）和差向異構(gòu)（位置3和6處為D-Leu）原因。但是，位置5的親水性殘基Asp5可以被修飾，它被甲基化并轉(zhuǎn)化為相對(duì)疏水的Asp-4-甲基酯［53］。

對(duì)于surfactins家族，除了肽鏈的變化外，F(xiàn)A鏈的結(jié)構(gòu)也會(huì)發(fā)生變化，如FA鏈會(huì)發(fā)生長(zhǎng)度、飽和度和異構(gòu)等結(jié)構(gòu)變化。FA鏈的長(zhǎng)度從C12-C17個(gè)碳原子不等，主要是具有14和15個(gè)碳原子長(zhǎng)度的異構(gòu)體。并且有直鏈、支鏈、異構(gòu)（Iso）鏈或反異構(gòu)（anteiso）鏈等結(jié)構(gòu)形式，從而增加surfactin類生物分子的數(shù)量［54］。脂肪酸的Iso形式存在于所有碳鏈長(zhǎng)度中，而anteiso形式存在于不均勻碳鏈長(zhǎng)度中。在研究中還發(fā)現(xiàn)生物合成酯化的surfactin，如由B. subtilis HSO121菌株產(chǎn)生的單甲基酯-surfactin和B. licheniformis HSN221菌株可產(chǎn)生兩種單甲基酯-surfactin和一種單甲基酯-lichenysin，具有抗癌細(xì)胞活性［55-56］。

3 基因工程提高surfactin產(chǎn)量及其衍生物開(kāi)發(fā)

3.1 提高surfactin產(chǎn)量

利用基因工程技術(shù)開(kāi)發(fā)基因修飾的突變菌株，以解除surfactins生物合成中的反饋調(diào)節(jié)作用，提高surfactin產(chǎn)量，如對(duì)非核糖體肽合成酶（NRPS）的調(diào)控基因進(jìn)行修飾，促進(jìn)信號(hào)肽、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或輔助蛋白的過(guò)表達(dá)等作用。劉皓等［57］通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析鑒定B. subtilis THY-7菌株中surfactin合成酶原啟動(dòng)子PsrfA的局限性，設(shè)計(jì)人工強(qiáng)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Pg3替換基因組中原啟動(dòng)子PsrfA，增強(qiáng)surfactin合成酶表達(dá)；又通過(guò)強(qiáng)化脂肪酸生物合成關(guān)鍵基因，并優(yōu)化surfactin發(fā)酵條件，使突變菌株surfactin產(chǎn)量比野生型提高了75%。Wang等［58］在B. subtilis菌株中發(fā)現(xiàn)bkd操縱子的bkdAA和bkdAB基因負(fù)調(diào)控surfactin的生物合成，利用CRISPR（clustered regularly interspacedshort palindromic repeats）干擾技術(shù)抑制該操縱子的bkdAA和bkdAB基因表達(dá)，使surfactin產(chǎn)量增加5.8倍。周澤宇等［59］利用基因工程方法，切斷支路代謝途徑策略，敲除B. amyloliquefaciens NK-△LP 菌株中Iturin和Fengycin合成酶基因簇，強(qiáng)化合成surfactin的脂肪酸前體供應(yīng)，并分別過(guò)表達(dá)了與swarming相關(guān)的SwrC蛋白、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白YbfB和4'-磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶Sfp等酶，使surfactin產(chǎn)量顯著提高到50.17 mg/L。Klausmann等［60］對(duì)不產(chǎn)surfactin的B. subtilis 168菌株進(jìn)行基因突變，得到sfp+突變菌株JABs32，該菌株spo0A位點(diǎn)和abrB（其基因產(chǎn)物從96個(gè)氨基酸延長(zhǎng)到107個(gè)氨基酸）位點(diǎn)的突變與高細(xì)胞密度補(bǔ)料間歇工藝相結(jié)合，致使surfactin的產(chǎn)量提高21倍。

3.2 Surfactin新衍生物開(kāi)發(fā)

Hu等［61］研究發(fā)現(xiàn)隨著Arg、Gln或Val的添加，增加了B. subtilisTD7中偶數(shù)β-羥基脂肪酸組分的C14和C16的surfactin的比例增加，而Cys、His、Ile、Leu、Met和Ser的添加增加了B. subtilis TD7中奇數(shù)β-羥基脂酸的比例；通過(guò)敲除位于bkd操縱子（包括lpdV、bkdAA、bkdAB和bkdB基因）的lpdV基因，nC14surfactin的比例增加了2.5倍，該基因負(fù)責(zé)acyl-CoA中支鏈氨基酸（branch chain amino acid,BCAA）降解的最后一步，脂肪酸前體供應(yīng)對(duì)修飾surfactin的脂酰部分的重要性被證明。B. subtilis PB2-L1為產(chǎn)生surfactin菌株，Jiang等［62］采用同源重組方法成功敲除了B. subtilis BP2-L1菌株中NRPSs合成酶的SrfA-A-Leu、SrfA-B-Asp和SrfA-B-Leu模塊，結(jié)果產(chǎn)生了3種新的surfactin脂肽產(chǎn)品，分別缺乏氨基酸Leu-3、Asp-5或Leu-6；與野生菌株產(chǎn)的天然surfactin相比，ΔLeu-3和ΔLeu-6 surfactin表現(xiàn)出毒性變低，而ΔAsp-5 surfactin對(duì)短小芽孢桿菌（B.pumilus）和黃體微球菌（Micrococcus luteus）的抑制作用強(qiáng)于天然surfactin。Eppelmann等［63］開(kāi)發(fā)非核糖體肽合成酶選擇性編碼，為合理設(shè)計(jì)新型脂肽抗生素提供可能。Mootz等［64］利用一種新的基因工程技術(shù)，通過(guò)交換催化亞基來(lái)重新編輯NRPS的模塊化結(jié)構(gòu)，得到雜交的NRPS，在NRPS裝配線中刪除整個(gè)模塊，獲得了預(yù)測(cè)的環(huán)尺寸減小的脂肽抗生素變體。

4 Surfactins對(duì)植物病害的生防特性及作用機(jī)制

4.1 Surfactins對(duì)植物病害的生防特性

4.1.1 抑制病原體 Surfactin的生物活性與其特定的化學(xué)鍵和親水親油基團(tuán)獨(dú)特的性質(zhì)相關(guān)，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，surfactin對(duì)細(xì)菌、真菌及病毒都有一定抑制作用，可以作為生防制劑，其在菌體生物膜形成、葉面或根際定殖和抑制或殺死病原菌等生防方面都發(fā)揮重要作用（圖4）。如生防菌株B. subtilis VD18R19產(chǎn)生的surfactin類產(chǎn)物對(duì)胡椒花葉病具有顯著的生防效果，防效達(dá)87.18%［65］；不產(chǎn)生surfactin的B. subtilis 168菌株，其重組菌株B168S具有產(chǎn)surfactin能力；利用兩菌株處理黃瓜種子，重組菌株在黃瓜根部的定殖量相對(duì)提高，同時(shí)，對(duì)尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporumf. sp. cucumerinum，F(xiàn)oc）侵染引起的黃瓜枯萎病防效相對(duì)增強(qiáng)。研究結(jié)果說(shuō)明surfactin可明顯促進(jìn)菌體在黃瓜根部的定殖，并通過(guò)抑制Foc的侵染增強(qiáng)對(duì)黃瓜枯萎病的防治效果［66］。香蕉內(nèi)生細(xì)菌B. amyloliquefaciens G9R-3菌株對(duì)香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4, Foc4）具有較強(qiáng)抑制活性，體外檢測(cè)其產(chǎn)生的surfactin類化合物能抑制病原菌Foc4菌絲的生長(zhǎng)和孢子的萌發(fā)［67］。生防芽孢桿菌SPB菌株產(chǎn)生的surfactin A對(duì)Fusarium oxysporum、F. moniliforme、F.solani、Trichoderma atroviride和T. reesei均有較強(qiáng)的抑制活性，surfactin A能顯著降低水稻惡苗病發(fā)病率達(dá)80%［68］。Laird等［69］研究發(fā)現(xiàn)番茄細(xì)菌性潰瘍病生防菌株B. velezensis 1B-23和Bacillus spp. 1D-12產(chǎn)生的脂肽C13-surfactins A、C14-surfactins A和C15-surfactins A均能抑制病原菌Clavibactermichigan sub（Cmm98-1）的生長(zhǎng)。生防菌株B. subtilis 9407對(duì)果斑病菌（Acidovoraxcitrulli）的體外抑菌活性較強(qiáng)，活體檢測(cè)對(duì)甜瓜幼苗果斑病的生防效果達(dá)61.7%，經(jīng)檢測(cè)該菌株的主要抗菌物質(zhì)是C13-C16的surfactins，其在菌體生物膜形成、聚集運(yùn)動(dòng)、葉面定殖和抑制A. citrulli生長(zhǎng)等方面都發(fā)揮重要作用［70］。

圖4 Surfactin的生防作用示意圖Fig. 4 Schematic representation of biocontrol effects of surfactin

4.1.2 誘導(dǎo)植株產(chǎn)生系統(tǒng)抗性 Surfactin還具有能夠刺激宿主組織產(chǎn)生免疫相關(guān)反應(yīng)的生物學(xué)功能，這有助于增強(qiáng)植株對(duì)病原體的抵抗作用（圖4）。B.subtilis GLB191是一株防治葡萄霜霉病的有效生防菌，其產(chǎn)生的脂肽surfactin和fengycin對(duì)葡萄霜霉病都具有顯著的防效，經(jīng)檢測(cè)脂肽的這種生防作用既來(lái)自對(duì)病原菌的直接抑制作用，也來(lái)自對(duì)植株的防御刺激（誘導(dǎo)植株防御基因表達(dá)），即誘導(dǎo)植株產(chǎn)生系統(tǒng)抗性（induced systemic resistance, ISR）［71］。任鵬舉等［72］將生防菌株B. subtilis OKB105產(chǎn)生的脂肽surfactin配成溶液，處理感染煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus,TMV）的煙草，結(jié)果顯示surfactin對(duì)TMV病防治效果顯著，并誘導(dǎo)煙草植株的系統(tǒng)抗性。B. velezensisMS20菌株產(chǎn)生的surfactin具有抑制立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）菌絲生長(zhǎng)的特性，用surfactin處理感染了R. solani的玉米植株，能有效降低玉米紋枯病的發(fā)病率，經(jīng)檢測(cè)抗性玉米植株細(xì)胞產(chǎn)生的防御酶量相對(duì)提高，說(shuō)明surfactin誘導(dǎo)了玉米植株的系統(tǒng)性抗性［73］。生防菌B. amyloliquefaciens S499產(chǎn)生的surfactin，溫室試驗(yàn)其對(duì)小麥葉枯病的防效達(dá)70%；體外抑菌試驗(yàn)表明，surfactin對(duì)小麥葉枯病原菌Zymoseptoriatritici無(wú)抑制作用，而surfactin通過(guò)刺激小麥細(xì)胞水楊酸和茉莉酸依賴的信號(hào)通路，誘導(dǎo)小麥植株系統(tǒng)抗性防御小麥葉枯病［74］。Rodrguez等［75］研究顯示，施用由B.subtilis菌株產(chǎn)生的surfactin處理花生植株，顯著降低了齊整小核菌（Sclerotium rolfsii）感染引起的花生白絹病的發(fā)病率，受感染植株的過(guò)氧化物酶活性和酚類化合物在真菌感染區(qū)下方的沉積量明顯增加，證明surfactin誘導(dǎo)了花生植株對(duì)S. rolfsii的系統(tǒng)抗性的能力。Cawoy等［76］通過(guò)對(duì)特定菌株的研究，建立了一項(xiàng)涉及一系列天然菌株的比較研究。首先測(cè)試它們的分泌物用于誘導(dǎo)在培養(yǎng)煙草細(xì)胞的早期防御情況，確定surfactin是刺激植物免疫相關(guān)反應(yīng)的主要化合物。基于宏觀的病情減輕和作為防御機(jī)制的Oxylipin途徑的刺激，評(píng)估了6個(gè)野生分離株對(duì)植株系統(tǒng)抗性的誘導(dǎo)能力。研究發(fā)現(xiàn)，菌株的防御誘導(dǎo)活性與其產(chǎn)生的surfactin的量有較強(qiáng)的正相關(guān)性。

4.2 Surfactin對(duì)植物病害的生防機(jī)制

Surfactin在作物生防中的抑菌或殺菌作用機(jī)制較復(fù)雜，目前的研究發(fā)現(xiàn)主要有以下幾種生防作用機(jī)制：（1）阻礙DNA復(fù)制，抑制蛋白質(zhì)合成，阻止病原菌繁殖。如從B. brevis KN8菌株中提取的surfactin可防治病原菌F. moniliformme對(duì)玉米籽粒的感染，經(jīng)體外檢測(cè)顯示，該surfactin對(duì)F.moniliformme菌絲生長(zhǎng)有抑制和損傷作用，生化分析結(jié)果顯示，其破壞了病原菌F. moniliformme的DNA和部分蛋白質(zhì)，谷胱甘肽（glutathione, GSH）含量下降［77］。（2）誘導(dǎo)植株系統(tǒng)抗性，產(chǎn)生防御酶來(lái)抵御病原菌侵染。從B. pumilus W-7菌株發(fā)酵液提取的surfactins和fengycin B脂肽，通過(guò)協(xié)同作用可有效降低馬鈴薯晚疫病的發(fā)病率。Fengycin B通過(guò)誘導(dǎo)菌絲變形、氧化損傷和線粒體功能障礙抑制P. infestans菌絲體菌絲生長(zhǎng)；Surfactin通過(guò)加強(qiáng)植株防御基因（pod、pal和cat）表達(dá)，提高了（POD、PAL和CAT）酶活，誘導(dǎo)馬鈴薯的植株防御反應(yīng)以抵抗晚疫病的發(fā)生［78］。Henry等［79］研究植物細(xì)胞表面感知surfactin的機(jī)制，結(jié)合煙草細(xì)胞中的氧化誘導(dǎo)、結(jié)構(gòu)/活性關(guān)系、競(jìng)爭(zhēng)抑制、植物膜內(nèi)動(dòng)力學(xué)以及模型質(zhì)膜參數(shù)的熱力學(xué)測(cè)定數(shù)據(jù)表明，煙草細(xì)胞對(duì)surfactin的感知依賴于煙草細(xì)胞質(zhì)膜水平的脂質(zhì)驅(qū)動(dòng)過(guò)程，即脂質(zhì)雙分子層的傳感器作用。（3）損傷病原菌細(xì)胞膜，引起細(xì)胞膜裂解或滲透壓失衡。Carrillo等［80-81］利用傅里葉變換紅外光譜（fourier translation infrared spectroscopy, FTIR）跟蹤surfactin對(duì)細(xì)胞膜磷脂雙分子層不同組分的影響，對(duì)棕櫚酰油酰基磷脂酰膽堿（palmitoyl oleoyl phosphatidylcholine, POPC）振動(dòng)的CO拉伸模式的影響表明，surfactin脂肽引起了膜強(qiáng)烈的脫水；另一方面，CH拉伸帶表明surfactin與磷脂酰鏈相互作用，導(dǎo)致膜流態(tài)化；以上的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)有助于解釋surfactin誘導(dǎo)形成膜孔隙，最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物泄漏，菌體死亡。（4）促進(jìn)生防菌株的定殖或生物膜的形成，增強(qiáng)生防能力。如不合成surfactin的B. subtilis168菌株，其重組菌株B168S具有合成surfactin能力，利用兩菌株處理黃瓜種子，結(jié)果表明surfactin可促進(jìn)重組菌株B168S在黃瓜植株根部的定殖作用［66］。Surfactin在生防菌株B. subtilis 9407生物膜形成、聚集運(yùn)動(dòng)和葉面定殖等方面都發(fā)揮重要作用［70］。

5 總結(jié)與展望

通過(guò)對(duì)surfactin的生防特性及作用機(jī)制總結(jié)，在植物病害防治上，surfactin對(duì)黃瓜枯萎病、小麥紋枯病、水稻惡苗病、葡萄霜霉病、煙草花葉病毒病和花生白絹病等多種作物病害都有較好生防作用［66-71］。但是，surfactin的生防作用機(jī)制較復(fù)雜，對(duì)于surfactin抑制植物病原菌生長(zhǎng)的作用機(jī)制尚未完全闡明，其既有細(xì)胞膜靶點(diǎn)作用機(jī)制，如形成膜離子通道、跨膜孔隙或廣泛的膜破裂等方式導(dǎo)致微生物細(xì)胞的裂解；也有細(xì)胞內(nèi)非膜靶點(diǎn)作用機(jī)制，如DNA、RNA、蛋白質(zhì)或酶等；還有誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性、促進(jìn)生防菌的定殖和生物膜的形成等特性。Surfactin的抑菌活性可能是以上這些特性共同作用的結(jié)果，這表明surfactin的抑菌機(jī)理有待進(jìn)一步研究分析。

基于surfactin對(duì)多種作物病害有較好的生防效果，抑菌普廣泛，對(duì)多種作物有誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性作用，surfactin可作為生防制劑或植物生長(zhǎng)促進(jìn)劑進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用。Surfactin作為天然的生防制劑與化學(xué)農(nóng)藥相比有以下優(yōu)點(diǎn)：毒性相對(duì)低［82］、生物降解性高、更環(huán)保、極端條件（溫度、酸堿度和鹽離子濃度）比活性高，以及可以利用可再生原料生產(chǎn)的特性等［83-87］。因此，surfactin在農(nóng)業(yè)上可作為生防制劑或植物生長(zhǎng)促進(jìn)劑進(jìn)行重點(diǎn)研發(fā)應(yīng)用。

鑒于surfactin的抑菌殺菌方面的生防潛力及其多樣的生物活性，可以利用基因工程技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，探索和生產(chǎn)更多樣化碳骨架的surfactin。開(kāi)發(fā)新型的surfactin及其衍生物，不僅有重要應(yīng)用價(jià)值，而且有利于從分子水平上深入研究和闡明不同亞型surfactin的結(jié)構(gòu)、功能及作用機(jī)制等，對(duì)改進(jìn)surfactin的表面活性、穩(wěn)定性、抑菌譜和可溶性等具有理論意義。