一種鑒別栽培柿品種SNP標(biāo)記的新方法

梁晉軍 朱溯遠(yuǎn) 張宇琴 張鵬飛 溫鵬飛 楊運(yùn)良

（1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，太谷 030801；2. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花研究所，運(yùn)城 044000）

柿（Diospyros kaki Thunb.）作為重要的落葉果樹，在我國栽培歷史悠久，絕大多數(shù)柿品種為六倍體（2n=6X=90）［1］。在長期的引種、雜交、嫁接等自然選擇及人工選擇過程中，產(chǎn)生了豐富的柿種質(zhì)資源，但也造成了“同物異名”或“同名異物”等種質(zhì)資源混雜不清的現(xiàn)象［2］。尤其利用主栽品種作為骨干親本在柿育種中應(yīng)用，使得栽培種內(nèi)柿品種間的遺傳差異越來越小［3］。然而當(dāng)前栽培柿種內(nèi)遺傳差異的鑒定比較復(fù)雜，缺少一種簡單高效快捷的方法。

DNA分子標(biāo)記的開發(fā)對(duì)植物分子遺傳育種具有重要意義，它具有穩(wěn)定遺傳、不受取材部位限制和不受環(huán)境影響等優(yōu)點(diǎn)［4］。前人也通過各種分子標(biāo)記對(duì)柿種內(nèi)進(jìn)行親緣關(guān)系分析，如SSR［5-8］、cpDNA［9-10］、ISSR［11］、SRAP［12-13］、RAPD［14］，但這些分子標(biāo)記全都比較復(fù)雜，需要大量篩選特異性高的引物，聚丙烯酰胺和瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果中可能出現(xiàn)由于距離較近無法分開，耗時(shí)、費(fèi)力、準(zhǔn)確性不高，未能簡單應(yīng)用于栽培柿種內(nèi)遺傳差異分析。目前柿屬植物中僅有針對(duì)二倍體柿近緣種油柿和君遷子基因組的報(bào)道［15-17］，而對(duì)六倍體柿基因組的研究缺乏，這在一定程度上限制了柿分子標(biāo)記技術(shù)的開發(fā)，影響了分子輔助育種進(jìn)程。

單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms, SNP）在基因組中數(shù)量多、分布廣、密度高、多態(tài)性豐富、檢測(cè)迅速易于高通量分析［18］，已在玉米（Zea mays L.）［19］、小麥（Triticum aestivum L.）［20］、水稻（Oryza sativa L.）［21］等作物遺傳研究中廣泛使用，目前在柿屬植物中應(yīng)用較少。有研究通過基因分型測(cè)序（genotyping by sequencing, GBS）分析鑒定柿的單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記，在篩選出的49個(gè)SNP位點(diǎn)中，有15個(gè)SNP被用于開發(fā)成競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR（kompetitive allele specific PCR,KASP），已分析鑒別了32份柿子品種［22］。杜改改等［23］和王藝儒等［24］分別以禪寺丸柿雌雄花芽和小果甜柿果實(shí)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)其SNP位點(diǎn)進(jìn)行分析，一定程度上豐富了柿的SNP引物來源。

核糖體nrDNA ITS（internal transcribed spacer）序列進(jìn)化速率較編碼區(qū)快，是植物基因中進(jìn)化較快的DNA片段，具有基因內(nèi)保守而基因間存在一定變異的特點(diǎn)，因此nrDNA ITS序列能提供豐富的信息位點(diǎn)［25］。隨著分子技術(shù)快速發(fā)展，ITS序列成為重要分子標(biāo)記，因此常被用于植物屬間及種間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和遺傳多樣性分析［26-28］。Qi等［29］分析了我國5種常見柴胡（Bupleurum L.）ITS的變異，基于ITS區(qū)域的單核苷酸多態(tài)性（SNP），設(shè)計(jì)了5對(duì)特異性引物，并將這些引物用于等位基因特異性PCR技術(shù)，建立了一種可靠的分子鑒定方法。Park等［30］通過ITS序列分析了中國水仙（Narcissus tazetta var. chinensis）和精選水仙品種的遺傳差異發(fā)現(xiàn)，從中國、韓國和日本采集的水仙，無論是單花還是重花，都具有非常密切的親緣關(guān)系。劉達(dá)等［31］對(duì)玄參屬（Scrophularia L.）種間ITS序列的遺傳多樣性進(jìn)行分析，將兩個(gè)不同組的玄參屬植物區(qū)分開來。朱玲等［32］利用ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，將90份新疆野蘋果（Malus sieversii（Ledeb.）M.Roem.）和外類群西洋李（Prunus domestica L.）基本分成了3個(gè)大分支。

六倍體栽培柿品種由于其雜交親本的差異，SNP雜合位點(diǎn)處可能存在5∶1、4∶2、3∶3、2∶4和1∶5五種情況。前人對(duì)六倍體栽培柿這一特性的研究還較少。本研究以18份主要栽培柿為試材，利用柿種內(nèi)ITS雜合位點(diǎn)不同堿基峰圖面積比例分析其在遺傳上的差異性和相似性，以期總結(jié)出一種應(yīng)用于栽培柿種內(nèi)簡單有效的SNP分子標(biāo)記新方法，為六倍體栽培柿的鑒定提供新技術(shù)，同時(shí)為該種質(zhì)的收集、利用及推廣應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料包括18個(gè)栽培柿品種（包括中國澀柿和日本甜柿），均于2022年采集自山西省運(yùn)城市（表1）。采集新鮮嫩葉，經(jīng)液氮速凍后，-80℃保存，用于后續(xù)試驗(yàn)。

表1 試驗(yàn)材料Table 1 Materials in the experiment

1.2 方法

1.2.1 PCR擴(kuò)增、測(cè)序 采用改良的CTAB法［33］從柿葉中提取植物總DNA。反應(yīng)總體積為40 μL，包括2×PFU PCR MasterMix 20 μL（中科瑞泰生物科技有限公司）、引物ITS-F（ITS 5）（5'-GGAAG-TAAAAGTCGTAACAAGG-3'）1.6 μL、ITS-R（ITS 4）（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）1.6 μL（由上海生工生物有限公司合成）、模板DNA 1.6 μL和ddH2O 15.2 μL。

PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃ 5 min；94℃ 30 s，53℃30 s，40個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min，4℃保溫。

PCR產(chǎn)物通過Gillgreen（北京華越洋生物科技有限公司）染色的2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（天根生化科技有限公司）回收純化擴(kuò)增產(chǎn)物，所得產(chǎn)物送上海生物工程有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.2.2 酶切驗(yàn)證試驗(yàn) 應(yīng)用Sau96 I限制性內(nèi)切酶（NEB公司，馬薩諸塞州伊普斯威奇，美國）對(duì)擴(kuò)增出的ITS區(qū)進(jìn)行特異酶切。酶切反應(yīng)體積為15 μL，內(nèi)含6 μL PCR產(chǎn)物，2 U Sau96 I和2 U rCutSmartTMBuffer，酶切時(shí)間為4 h，反應(yīng)溫度為37℃。酶切產(chǎn)物通過Gillgreen染色的2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用DNAMAN軟件［34］對(duì)所獲得的ITS序列進(jìn)行序列手工校對(duì)，并依據(jù)NCBI上已有的ITS序列（KU378723.1）確定邊界，用Chromas軟件［35］觀測(cè)峰圖，ImageJ軟件測(cè)定測(cè)序峰圖面積和酶切電泳圖亮度［36］。

2 結(jié)果

2.1 基于ITS序列雜合位點(diǎn)堿基峰圖面積差異進(jìn)行栽培柿種內(nèi)聚類分析

通過對(duì)柿種內(nèi)ITS區(qū)進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果表明，柿種內(nèi)無任何長度差異，均為730 bp。18個(gè)栽培柿品種相似性99.26%，栽培柿種內(nèi)的差異位點(diǎn)僅有6個(gè)，且6處位點(diǎn)均存在雜合現(xiàn)象（雙峰），即在同一位點(diǎn)處同時(shí)存在峰圖面積不同比例的2個(gè)堿基。六倍體栽培柿品種由于其雜交親本的差異，SNP雜合位點(diǎn)處雜合子堿基比例存在差異，本試驗(yàn)測(cè)序結(jié)果在雜合位點(diǎn)處的2個(gè)堿基峰圖面積比例出現(xiàn)2∶1、1∶1和1∶2三種情況。

利用Chromas軟件對(duì)ITS區(qū)測(cè)序峰圖觀察發(fā)現(xiàn)，18個(gè)栽培柿品種在ITS區(qū)出現(xiàn)雜合現(xiàn)象的6個(gè)位點(diǎn)分別在151、168、205、278、279和622位點(diǎn)，且同一位點(diǎn)的雜合情況也存在差異，在151和278位點(diǎn)處，堿基C和T的雜合現(xiàn)象有2∶1、1∶1、1∶2三種，在168和205位點(diǎn)處堿基C和T的雜合現(xiàn)象只有1∶1，在279位點(diǎn)處堿基C和T的雜合現(xiàn)象只有1∶2，622位點(diǎn)處則是堿基A和G的雜合現(xiàn)象，雜合情況為1∶2。

利用柿種內(nèi)ITS區(qū)的雜合位點(diǎn)現(xiàn)象可將18個(gè)栽培柿品種分為11類，將分出的類別用“D”來表示（表2）。D1、D2和D3沒有雜合位點(diǎn)出現(xiàn)（圖1-A）。D4和D5在279位點(diǎn)都出現(xiàn)雜合現(xiàn)象，D4只有一個(gè)雜合位點(diǎn)，即在279位點(diǎn)C∶T=1∶2；D5在278、279位點(diǎn)分別出現(xiàn)C∶T=1∶1和C∶T=1∶2的雜合情況（圖1-B）。D6、D7在151位點(diǎn)都出現(xiàn)C∶T=2∶1的雜合現(xiàn)象（圖1-C）。除151位點(diǎn)外，D6還在168位點(diǎn)出現(xiàn)C∶T=2∶1的雜合現(xiàn)象，D7在205、279和622位點(diǎn)處出現(xiàn)C∶T=2∶1、C∶T=1∶1和A∶G=1∶2的雜合現(xiàn)象（圖1-C）。D8、D9、D10和D11只在151和278位點(diǎn)處出現(xiàn)雜合現(xiàn)象（圖1-D）。D8的雜合現(xiàn)象分別為C∶T=2∶1和C∶T=1∶2；D9都為C∶T=1∶1；D10為C∶T=1∶2和C∶T=2∶1；D11為C∶T=1∶2和C∶T=1∶1（圖1-D）。

圖1 D1-D11類ITS序列峰圖Fig. 1 ITS sequence peak of class D1-D11

表2 基于柿種內(nèi)ITS區(qū)的雜合位點(diǎn)現(xiàn)象聚類Table 2 Clustering of heterozygous sites based on ITS region in persimmon species

2.2 酶切驗(yàn)證試驗(yàn)

針對(duì)柿種內(nèi)雜合位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，在151位點(diǎn)處存在C和T堿基，因?yàn)槠洳煌姆鍒D面積比例，所以18個(gè)栽培柿在151位點(diǎn)共存在5種情況，分別選擇‘陽豐’（C∶T＝1∶2）、‘興津-20’（C∶T＝2∶1）、‘早秋’（C∶T＝1∶1）、‘晚御所’（C）、‘黑柿’（T）進(jìn)行151位點(diǎn)處的酶切驗(yàn)證試驗(yàn)。

‘晚御所’ITS序列151處位點(diǎn)為C堿基（GGCCC）能被Sau96 I特異完全酶切，在375 bp處存在1條條帶（圖2-d）。‘黑柿’ITS序列151處位點(diǎn)為T堿基（GGCCT）不能被Sau96 I特異酶切，在450 bp處存在1條條帶（圖2-e）。其他3個(gè)品種ITS序列151處位點(diǎn)為C和T堿基同時(shí)存在能被Sau96 I不完全特異酶切，在450和375 bp處各出現(xiàn)1條條帶。‘陽豐’（C∶T＝1∶2）450 bp處條帶會(huì)比375 bp處更亮（圖2-a），即堿基T的峰圖面積大于C（圖1-D）；‘興津-20’（C∶T＝2∶1）375 bp處條帶會(huì)比450 bp處更亮（圖2-b），即堿基C的峰圖面積大于T（圖1-C）；‘早秋’（C∶T＝1∶1）450和375 bp處2條帶會(huì)一樣亮（圖2-c），即堿基C的峰圖面積等于T（圖1-D）。

圖2 151位點(diǎn)處特異酶切圖Fig. 2 151 specific enzyme cut at sites

3 討論

ITS序列主要用于植物屬間、種間親緣關(guān)系鑒定，本研究基于栽培柿的六倍體特性通過ITS區(qū)的SNP位點(diǎn)和觀測(cè)雜合位點(diǎn)及其峰圖面積比例構(gòu)建了一種簡單的鑒別栽培柿品種間差異的新方法。Ma等［37］對(duì)95個(gè)栽培柿品種使用GBS分析，構(gòu)建了GBS文庫鑒定了大量SNP位點(diǎn)，有15個(gè)成功用于KASP檢測(cè)的引物和探針，應(yīng)用KASP分子標(biāo)記可以明顯區(qū)分純合型和雜合型，鑒定了32個(gè)柿子品種，與傳統(tǒng)的SNP分子標(biāo)記相比，本研究在ITS序列發(fā)現(xiàn)的SNP位點(diǎn)同樣可以明顯區(qū)分純合型和雜合型，并通過堿基峰圖面積比例進(jìn)一步對(duì)雜合類型進(jìn)行分類，大大降低了成本，節(jié)省了時(shí)間。

本方法與SSR、ISSR、SRAP、RAPD等方法相比最大的優(yōu)勢(shì)在于步驟簡單、操作方便，可以在短時(shí)間內(nèi)有效的區(qū)分出大量栽培柿品種間的遺傳差異，只需對(duì)栽培柿品種的ITS區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序，并通過觀測(cè)峰圖對(duì)ITS區(qū)的雜合位點(diǎn)及其峰圖面積比例進(jìn)行分類即可，無須進(jìn)行大量的引物篩選以及統(tǒng)計(jì)凝膠電泳特征性譜帶，對(duì)栽培柿種質(zhì)資源評(píng)價(jià)和遺傳育種研究具有一定指導(dǎo)作用。在鑒別能力方面，18種栽培柿品種有8個(gè)品種能夠完全區(qū)分，分別為D1、D3、D4、D5、D6、D7和D11，在D2中‘駿和’‘晚御所’‘花御所’被聚為一類，這與郭大龍［38］的研究一致。本方法可以為解決栽培柿品種“同物異名”和“同名異物”的情況奠定基礎(chǔ)。

本研究基于ITS序列發(fā)現(xiàn)的SNP位點(diǎn)為151、168、205、278和279位點(diǎn)，與梁晉軍［39］研究基本一致，622位點(diǎn)為新發(fā)現(xiàn)的雜合位點(diǎn)，96和474位點(diǎn)處為未發(fā)現(xiàn)的雜合位點(diǎn)現(xiàn)象，可能是由于樣本數(shù)量少導(dǎo)致，隨著樣本數(shù)量的增加可能還會(huì)發(fā)現(xiàn)更多新的雜合位點(diǎn)和雜合類型。

4 結(jié)論

發(fā)現(xiàn)一種新的基于六倍體栽培柿nrDNA ITS序列的SNP分子標(biāo)記，這種新方法可以將18份栽培柿品種分成11類。