銅綠假單胞菌適配體的獲得及應(yīng)用

劉星雨 李潔 朱龍佼 李相陽(yáng) 許文濤

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2. 北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院, 北京 102206；3. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)營(yíng)養(yǎng)與健康系，北京 100083）

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一種適應(yīng)性和多樣性極高的微生物，能夠定植廣泛的生態(tài)位，是引起人類機(jī)會(huì)性感染最主要的條件致病菌［1-2］。銅綠假單胞菌是囊性纖維化、慢性阻塞性肺病、支氣管擴(kuò)張等基礎(chǔ)呼吸道病患病情加速加重的主要因素，可引起術(shù)后創(chuàng)口感染、燒傷創(chuàng)面感染，菌體通過(guò)血液散播并產(chǎn)生毒素，引發(fā)菌血癥、敗血癥而造成死亡，目前已經(jīng)成為重癥監(jiān)護(hù)病房感染的第二大致死病原菌［3-5］。銅綠假單胞菌的致病性主要是由于其大量的毒力因子和抗生素耐藥性造成的，其毒力因子主要包括脂多糖、外膜蛋白、多種分泌物等。作為常見(jiàn)的致病菌，銅綠假單胞菌即使是在低濃度下也會(huì)引起嚴(yán)重的感染，其生物膜的形成和外膜的低滲透性，使其對(duì)抗生素和抗菌劑具有良好的抗性［6］。作為一種具有強(qiáng)抗藥性的條件致病菌，銅綠假單胞菌在2017年被列為世界衛(wèi)生組織抗藥性細(xì)菌名單中的第二大威脅，并進(jìn)入高優(yōu)先級(jí)病原體名單，而感染的患者本身抵抗力低下，用藥情況復(fù)雜，使得抗菌藥物的選擇更加局限，一旦感染，臨床治療十分困難。鑒于其嚴(yán)重的危害，針對(duì)銅綠假單胞菌的疫苗已經(jīng)進(jìn)行了50多年的研究，但仍然缺少可用的產(chǎn)品［7］。因此早期檢測(cè)診斷在銅綠假單胞的防治中十分重要，這就需要快速、高效、高特異性地對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，并且持續(xù)不斷的對(duì)其感染后的治療進(jìn)行研究。適配體作為一種新型的靶向識(shí)別元件，在銅綠假單胞菌的檢測(cè)和防治方面得到了許多研究者的關(guān)注。

適配體是通過(guò)指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX）得到的具有特異性識(shí)別能力的人工合成寡核苷酸序列，1990年首次通過(guò)體外篩選被開(kāi)發(fā)［8］。適配體一般為幾十個(gè)堿基構(gòu)成的DNA或者RNA序列，目前已經(jīng)有超過(guò)千項(xiàng)的適配體篩選研究被報(bào)道［9］。適配體的可識(shí)別靶標(biāo)十分豐富，包括重金屬、細(xì)胞、蛋白質(zhì)等多種物質(zhì)［10］。由于其具有高親和力、高特異性且易于合成和修飾等特點(diǎn)，得到了廣泛的研究。

本文總結(jié)了目前銅綠假單胞菌適配體的篩選和裁剪，并從銅綠假單胞菌的檢測(cè)和防治兩個(gè)方面對(duì)其適配體的應(yīng)用進(jìn)行了介紹，以期為銅綠假單胞菌適配體的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供參考。

1 銅綠假單胞菌的篩選和裁剪

高性能適配體的獲得是實(shí)現(xiàn)多領(lǐng)域應(yīng)用的基礎(chǔ)，為了獲得更好的適配體，往往需要進(jìn)行篩選和裁剪。在適配體的篩選中，首先對(duì)寡核苷酸文庫(kù)進(jìn)行制備，并將含有隨機(jī)寡核苷酸數(shù)量超過(guò)1014以上的RNA或者DNA文庫(kù)與靶標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行孵育，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的反應(yīng)后，將可以與靶標(biāo)結(jié)合的核酸序列與未結(jié)合的核酸序列進(jìn)行分離，對(duì)于可結(jié)合靶標(biāo)的核酸，通過(guò)PCR等方式對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，以生成新的寡核苷酸庫(kù)。重復(fù)以上步驟5-15次后對(duì)富集文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，并通過(guò)多種技術(shù)對(duì)測(cè)序得到的序列進(jìn)行親和力和特異性分析，最終從數(shù)量龐大的文庫(kù)中得到具有優(yōu)越性能的適配體序列用于下一步的傳感器開(kāi)發(fā)（圖1）［11-13］。盡管通過(guò)幾輪甚至十幾輪的篩選，可以從中獲得較好的核酸序列，但是由于隨機(jī)文庫(kù)篩選中固有的局限性，即使隨機(jī)文庫(kù)中已經(jīng)具有相當(dāng)多數(shù)量的核酸序列，篩選獲得適配體序列依然可能存在部分堿基在特異性的識(shí)別中不能發(fā)揮積極的作用，因此通過(guò)裁剪對(duì)這些冗余的堿基進(jìn)行去除或?qū)τ行A基進(jìn)行重復(fù)有助于獲得性能更優(yōu)的適配體。目前，針對(duì)銅綠假單胞菌已有多種適配體得到了開(kāi)發(fā)和應(yīng)用，除了以微生物適配體篩選中常見(jiàn)的全細(xì)胞作為篩選靶標(biāo)外，銅綠假單胞菌的外毒素A和脂多糖也被用作靶標(biāo)進(jìn)行相關(guān)適配體的篩選（表1），多種銅綠假單胞菌靶標(biāo)適配體的篩選為其檢測(cè)提供了更加廣泛的可能性。此外，在已經(jīng)篩選的銅綠假單胞菌適配體中，既包括DNA適配體，也包括RNA適配體。

表1 銅綠假單胞菌適配體的篩選Table 1 SELEX of Pseudomonas aeruginosa aptamers

圖1 SELEX 流程圖Fig. 1 Flowchart diagram of SELEX

全菌是微生物適配體篩選中最常見(jiàn)的靶標(biāo)，利用菌體較大的特點(diǎn)，通過(guò)離心操作可以有效的分離結(jié)合序列和未結(jié)合序列，在銅綠假單胞菌的適配體篩選中，既包括了以死菌為靶標(biāo)的適配體篩選，也包括了以活菌作為靶標(biāo)的篩選。2011年，Wang等［14］首次對(duì)銅綠假單胞菌的適配體進(jìn)行了篩選，經(jīng)過(guò)15輪的篩選，文庫(kù)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定的結(jié)合能力不再繼續(xù)增加，因此結(jié)束篩選進(jìn)行核酸測(cè)序，經(jīng)過(guò)測(cè)序得到了親和力為（17.27 ± 5.00）nmol/L的適配體序列。2017年，Soundy等［15］首次針對(duì)活的銅綠假單胞菌開(kāi)展了適配體的篩選。經(jīng)過(guò)7輪的全細(xì)胞篩選，對(duì)熒光標(biāo)記的適配體進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，第7輪文庫(kù)與靶標(biāo)的結(jié)合效果與初始文庫(kù)相比有了顯著的增強(qiáng)，經(jīng)過(guò)測(cè)序得到了適配體序列JN08和JN27，經(jīng)過(guò)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，JN27中單個(gè)莖環(huán)為唯一顯著的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。因此對(duì)該莖環(huán)部分單獨(dú)進(jìn)行序列合成，并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行結(jié)合效果的評(píng)估，結(jié)果驗(yàn)證具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的適配體序列具有較好的結(jié)合效果，是篩選得到的長(zhǎng)適配體序列的核心結(jié)合區(qū)域。

除了對(duì)全菌進(jìn)行篩選，銅綠假單胞菌的毒力因子也已經(jīng)作為靶標(biāo)物質(zhì)開(kāi)展了適配體的篩選。外毒素A是銅綠假單胞菌重要的毒力因子，也是其感染的重要標(biāo)志物。Hong等［16］利用誘餌SELEX（Decoy-SELEX）對(duì)外毒素A的適配體進(jìn)行篩選。在篩選中牛血清白蛋白和霍亂毒素作為負(fù)篩靶標(biāo)使用，經(jīng)過(guò)14輪的篩選對(duì)測(cè)序得到的適配體序列，利用表面等離子共振進(jìn)行親和力的檢測(cè)，得到Kd值為4.2-4.5 μmol/L。此外，Ye等［17］基于Capture-SELEX技術(shù)篩選得到了適用于包括銅綠假單胞菌在內(nèi)的多種菌脂多糖檢測(cè)的適配體，其長(zhǎng)度為80 nt，由于較長(zhǎng)的核酸序列難以從石墨烯表面進(jìn)行釋放，進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行裁剪，并利用等溫量熱滴定法對(duì)其親和力進(jìn)行評(píng)估，最終確定了27 nt的最佳適配體，該適配體可以對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌、銅綠假單胞菌和大腸桿菌的脂多糖進(jìn)行識(shí)別和結(jié)合，并且在裁剪中親和力從（102±17）nmol/L上升至（46.2±9.5）nmol/L。

除了這些DNA適配體，銅綠假單胞菌的RNA適配體也得到了開(kāi)發(fā)。與DNA適配體相比，RNA適配體盡管穩(wěn)定性稍差但在內(nèi)化至細(xì)胞方面更具優(yōu)勢(shì)。利用氟修飾的RNA文庫(kù)，Davydova等［18］篩選得到了可以內(nèi)化到細(xì)菌細(xì)胞中的適配體，測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，該適配體與銅綠假單胞菌rRNA片段相同，進(jìn)一步佐證了該適配體可以內(nèi)化至細(xì)菌細(xì)胞的可能性。

2 銅綠假單胞菌適配體的應(yīng)用

作為一種具有嚴(yán)重危害的安全風(fēng)險(xiǎn)因子，如何進(jìn)行快速檢測(cè)和防治十分關(guān)鍵。經(jīng)過(guò)篩選和裁剪得到的適配體作為一種高親和力、高特異性的識(shí)別元件可以在檢測(cè)和治療上進(jìn)行應(yīng)用。目前基于適配體的銅綠假單胞菌檢測(cè)及其引起的疾病治療，引起了研究者的廣泛關(guān)注。

2.1 適配體在銅綠假單胞菌檢測(cè)中的應(yīng)用

作為一種亟待檢測(cè)的致病微生物，許多用于銅綠假單胞菌檢測(cè)的方法已經(jīng)得到了開(kāi)發(fā)，包括傳統(tǒng)檢測(cè)中常見(jiàn)的微生物分離培養(yǎng)與鑒定，以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)為主的分子生物學(xué)方法和以酶聯(lián)免疫分析為主的免疫學(xué)技術(shù)［22-23］。盡管已有的檢測(cè)方法十分多樣，但是這些方法往往受到成本、檢測(cè)時(shí)間和檢測(cè)性能不佳的制約。因此，適配體因其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)得到了研究者的青睞。

由于可以直接地肉眼對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行觀察，且檢測(cè)簡(jiǎn)單快速，因此比色法是常見(jiàn)的生物傳感器。如圖2-A所示，Schmitz等［24］基于帶負(fù)電荷的核酸可以非特異性地與金納米顆粒進(jìn)行結(jié)合，并因此阻礙其聚集變色的原理，開(kāi)發(fā)了一種無(wú)需對(duì)納米顆粒進(jìn)行表面改性的適配體生物傳感器，用于銅綠假單胞菌的檢測(cè)。這種比色的檢測(cè)方法簡(jiǎn)單快速，但由于缺少信號(hào)放大和更靈敏的信號(hào)讀取，檢測(cè)限往往不足以滿足檢測(cè)的需求。因此，基于適配體和納米酶的電化學(xué)方法應(yīng)運(yùn)而生。電化學(xué)傳感器是以工作電極作為固定生物識(shí)別分子和電化學(xué)活性分子的平臺(tái)，靶標(biāo)導(dǎo)致電極表面發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，而后被轉(zhuǎn)換為安培、阻抗等不同形式的電化學(xué)信號(hào)。同樣是基于核酸適配體對(duì)金納米顆粒的非特異性吸附，Das等［25］利用金納米顆粒固有的過(guò)氧化物酶活性，開(kāi)發(fā)了一種超靈敏的電化學(xué)適配體傳感器，金納米顆粒催化3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（3,3',5,5'-tetramethyl benzidine, TMB），可以產(chǎn)生具有電活性的產(chǎn)物二亞胺，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為電信號(hào)輸出，該傳感器可以在10 min內(nèi)完成對(duì)銅綠假單胞菌的檢測(cè)，檢測(cè)限約為10 CFU/mL（圖2-B）。相似地，Abedi等［26］開(kāi)發(fā)了一種夾心型的電化學(xué)適配體傳感器，利用雙信號(hào)放大的策略實(shí)現(xiàn)了銅綠假單胞菌的高靈敏檢測(cè)。如圖2-C所示，適配體分別固定在具有銀納米粒子的二維石墨氮化碳和經(jīng)過(guò)修飾的碳絲網(wǎng)印刷電極上，當(dāng)銅綠假單胞菌存在時(shí)電極上的適配體對(duì)其進(jìn)行捕獲，隨后加入具有銀納米粒子的二維石墨氮化碳，其上的適配體同樣與銅綠假單胞菌進(jìn)行結(jié)合，從而形成三明治夾心結(jié)構(gòu)，銀納米粒子作為一種報(bào)告信號(hào)實(shí)現(xiàn)電信號(hào)的增強(qiáng)，該傳感器可以實(shí)現(xiàn)1 CFU/mL的檢測(cè)限，并且可以實(shí)現(xiàn)活死菌的區(qū)分。Roushani等［27］以六氰亞鐵酸鹽為電化學(xué)指示劑，搭建銀納米粒子-玻碳電極傳感器，對(duì)血清樣本中的銅綠假單胞菌進(jìn)行了檢測(cè)，檢測(cè)限為33 CFU/mL。

圖2 用于銅綠假單胞菌檢測(cè)的適配體傳感器Fig. 2 Aptamer sensor for P. aeruginosa detection

除了比色法和電化學(xué)方法，熒光生物傳感器也常見(jiàn)于各種微生物檢測(cè)中。適配體熒光傳感器是通過(guò)熒光信號(hào)標(biāo)記的適配體與靶物質(zhì)相互作用，引發(fā)熒光強(qiáng)度變化或偏振來(lái)實(shí)現(xiàn)檢測(cè)，適配體熒光傳感器具有操作快速、成本低、儀器簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)，是一種常用的檢測(cè)方案。Xie等［28］認(rèn)為雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和DNA酶的聯(lián)合使用有助于更低檢測(cè)限的實(shí)現(xiàn)，因此開(kāi)發(fā)了一種基于雙鏈DNA分支遷移誘導(dǎo)的HCR和DNA酶反饋電路的熒光生物傳感器，用于銅綠假單胞菌的靈敏檢測(cè)。如圖2-D所示，當(dāng)靶標(biāo)存在時(shí)，雙鏈DNA分支遷移產(chǎn)生了兩個(gè)“Y”型的DNA結(jié)構(gòu)，同時(shí)觸發(fā)了HCR和DNA酶的反應(yīng)，促進(jìn)信號(hào)的放大，實(shí)現(xiàn)了無(wú)蛋白酶和復(fù)雜擴(kuò)增的檢測(cè)，檢測(cè)限為37 CFU/mL。基于光學(xué)的適配體傳感器用于銅綠假單胞菌檢測(cè)的研究還有很多。Hu等［29］在金納米三角陣列表面搭建局域SPR傳感芯片，通過(guò)連接在芯片上的適配體捕獲銅綠假單胞菌，檢測(cè)限低至10 CFU/mL。Zhong等［30］構(gòu)建了一種磁納米顆粒（magnetic nanoparticles, MNPs）-apt-cDNA結(jié)構(gòu)，對(duì)銅綠假單胞菌進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)限低至1 CFU/mL，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程可在1.5 h內(nèi)完成。

目前適配體傳感器已經(jīng)可以實(shí)現(xiàn)快速和靈敏的銅綠假單胞菌檢測(cè)，未來(lái)如何將技術(shù)整合至一體化的檢測(cè)裝置，實(shí)現(xiàn)更加方便快捷的應(yīng)用和長(zhǎng)期穩(wěn)定的信號(hào)輸出方面還應(yīng)當(dāng)進(jìn)行進(jìn)一步的探索。

2.2 適配體在銅綠假單胞菌防治中的應(yīng)用

2017年，銅綠假單胞菌的碳青霉烯類耐藥菌株被世界衛(wèi)生組織認(rèn)定為最具有威脅性的病原體之一，亟需新興抗生素的開(kāi)發(fā)，但是由于在感染早期無(wú)法快速識(shí)別病原體，往往造成患者不能被及時(shí)治療［31］。經(jīng)過(guò)篩選和裁剪得到的適配體作為一種高親和力、高特異性的識(shí)別元件，可以在檢測(cè)和治療上進(jìn)行使用。

基于適配體的納米材料已經(jīng)開(kāi)展了多項(xiàng)研究［32］，其中以適配體為靶向元件，以納米材料實(shí)現(xiàn)抑菌作用的適配體功能化納米材料，在靶標(biāo)抑菌方面也得到較多關(guān)注［33-34］。利用適配體和二硫化鉬納米片包覆的金納米棒靶向多重耐藥的銅綠假單胞菌，Lv等［35］開(kāi)發(fā)了一種可以精準(zhǔn)損傷銅綠假單胞菌的新材料，如圖3-A所示，適配體使材料具有靶向銅綠假單胞菌脂多糖的能力，納米棒則在近紅外激光下溫度提升，這種溫度的提升對(duì)細(xì)菌的細(xì)胞壁造成更加顯著的損傷，研究表明這種新材料可以對(duì)靶標(biāo)產(chǎn)生精準(zhǔn)的物理?yè)p傷，有效減少過(guò)量的炎性巨噬細(xì)胞，加速感染傷口的愈合。除了利用這種抑菌材料與適配體進(jìn)行偶聯(lián)，利用核酸作為模板進(jìn)行金屬納米簇的開(kāi)發(fā)也是一種常見(jiàn)的靶向抑菌劑開(kāi)發(fā)途徑。相似地，Kraemer等［36］制備了一種傷口敷料材料，這種材料基于膠原蛋白凝膠形成類似新鮮傷口細(xì)胞外基質(zhì)的狀態(tài)，并利用適配體進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)形成銅綠假單胞菌的捕獲網(wǎng)絡(luò)，當(dāng)靶標(biāo)存在時(shí)實(shí)現(xiàn)抗菌肽的釋放，最終達(dá)成了對(duì)銅綠假單胞菌的靶向殺滅。Soundy等［37］開(kāi)發(fā)了一種使用適配體作為銀納米簇合成支架的抗銅綠假單胞菌劑，碘化丙啶染色顯示這種抑菌劑可以在10 min內(nèi)迅速殺死50%的靶標(biāo)菌。

圖3 基于適配體的銅綠假單胞菌防治Fig. 3 Aptamer-based control of P. aeruginosa

除了與抑菌材料進(jìn)行結(jié)合，部分適配體由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和更加精確的靶標(biāo)可以實(shí)現(xiàn)獨(dú)立的抑菌作用。如圖3-B所示，Zhao等［21］篩選了針對(duì)丁酰基-高絲氨酸的適配體，實(shí)現(xiàn)了對(duì)銅綠假單胞菌生物膜形成的抑制。丁酰基-高絲氨酸是由銅綠假單胞菌的rhll基因編碼的酰基高絲氨酸內(nèi)酯合酶合成的rhl系統(tǒng)信號(hào)分子。該適配體篩選利用液相結(jié)構(gòu)切換的核酸適配體，經(jīng)過(guò)14輪的篩選，獲得親和力為28.47 nmol/L的適配體。適配體通過(guò)與丁酰基-高絲氨酸結(jié)合，可以導(dǎo)致該信號(hào)分子在培養(yǎng)物中保持低水平并阻斷其余rhlR蛋白之間的偶聯(lián)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)銅綠假單胞菌群體感應(yīng)的干擾，抑制生物膜的形成。未來(lái)，這種具有獨(dú)立抑菌能力的適配體由于其在使用中具有適配體納米材料抑菌無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)，將被更加廣泛地開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。

3 總結(jié)和展望

作為一種具有嚴(yán)重危害的致病菌，銅綠假單胞菌的檢測(cè)和防治一直是研究的重點(diǎn)，但是其復(fù)雜而多樣的毒力因子以及強(qiáng)大的生物膜形成，使其檢測(cè)和抑制的難度大大提升，適配體的出現(xiàn)為其靶向治療和早期檢測(cè)提供了有利的工具。目前關(guān)于銅綠假單胞菌適配體的開(kāi)發(fā)及其應(yīng)用已經(jīng)得到了一定程度的開(kāi)展，但是相較于其他具有嚴(yán)重危害的微生物來(lái)說(shuō)，銅綠假單胞菌在適配體篩選、裁剪和應(yīng)用方面的研究并不豐富，依然具有較大的開(kāi)發(fā)潛力。未來(lái)，在銅綠假單胞菌適配體的開(kāi)發(fā)方面，在計(jì)算機(jī)技術(shù)指導(dǎo)下的更理性的篩選和文庫(kù)設(shè)計(jì)工作將深入進(jìn)行，實(shí)現(xiàn)更加科學(xué)地適配體篩選，這些理性篩選工作的開(kāi)展將使現(xiàn)在適配體篩選周期長(zhǎng)、適配體候選庫(kù)分析工作量大的問(wèn)題得到進(jìn)一步的解決，有助于開(kāi)發(fā)出具有更好性能的適配體序列。對(duì)于已經(jīng)篩選得到的眾多適配體，通過(guò)裁剪以完成核心結(jié)合區(qū)域探究的工作，也將得到越來(lái)越多研究者的關(guān)注，這有利于目前大分子靶標(biāo)結(jié)合原因和結(jié)合區(qū)域不明現(xiàn)狀的解決，并且對(duì)銅綠假單胞菌上的適配體結(jié)合靶位點(diǎn)進(jìn)行確認(rèn)，也將大大推動(dòng)適配體在應(yīng)用方面的快速發(fā)展。在應(yīng)用方面，基于適配體的銅綠假單胞菌檢測(cè)將朝著一體化快速檢測(cè)設(shè)備開(kāi)發(fā)、現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)應(yīng)用的方向發(fā)展，隨著適配體性能的不斷提升，傳感器的檢測(cè)性能也有望進(jìn)一步提升，在特異性和靈敏度以及活死菌的區(qū)分等方面都將不斷發(fā)展。在基于適配體的銅綠假單胞菌防治方面，可以直接對(duì)菌體進(jìn)行損傷的適配體開(kāi)發(fā)是值得研究的方向，其應(yīng)用也將朝著更加有效和精準(zhǔn)的方向進(jìn)行。