森林根際土壤細菌的分離、鑒定及生物活性篩選

馮路遙 趙江源 施竹鳳 莫艷芳，4 楊童雨，4 申云鑫，4 何飛飛李銘剛 楊佩文

（1. 云南大學資源植物研究院，昆明 650504；2. 云南省農業科學院農業環境資源研究所，昆明 650205；3. 云南大學云南省微生物研究所，昆明 650504；4. 云南農業大學植物保護學院，昆明 650201）

在集約化種植模式驅動下，常常通過施用過量的化學肥料來保持長時間的營養輸入，以達到供應植物快速生長并保證營養充足和作物產量的目的［1］。但人們逐漸意識到化學肥料的施用只是一種短期的農業生產方式，易造成包括土壤板結、鹽堿化、水分富營養化等在內的環境問題，迫切需要另一種營養供給方式來緩解并恢復常態化的、可持續的正常農作物生產環境［2］。而利用微生物的功能特性可實現促進土壤養分轉化、構建健康土壤環境等多種有益作用，是實現綠色、可持續的農業環境的正確方向［3］。

植物根際微生物（plant growth promoting rhizobacteria, PGPR）作為一類棲息于植物根際的特殊微生物類群，能夠通過解磷、固氮、解鉀、拮抗病原菌、產鐵載體、分泌IAA、ACC脫氨酶等多種生物機制直接或間接促進植物生長、提高植物的品質和產量［4］。Chouyia等［5］研究表明，用磷溶性微生物Streptomyces roseocinereus MS1B15接種大麥（Hordeum vulgare）能夠有效提高其地上部、麥穗長度、麥穗葉片和根際土壤的氮磷含量。Romano等［6］研究表明，分離得到的Kosakonia pseudosacchari TL13和TL3 具有多種PGPR性狀，還能夠拮抗多種土源性植物病原體，對于番茄（Solanum lycopersicum）的定植和改善植物的生長起到了有效作用。另外，Chopra等［7］相關研究發現，從茶（Camellia sinensis）根際土壤中得到的菌株Brevibacterium sediminis A6具有促生抗病活性，能夠生產生物表面活性劑，對水稻幼苗（Oryza sativa）的生長有著正向的影響。

目前微生物肥料依賴于核心微生物的功能，開發活性更強、針對性更強的微生物是發展生物肥料的重要需求［8］。在特殊的、多樣性豐富的生態環境中更容易獲得功能多樣的功能菌株。無量山保護區作為云南省國家級的自然保護區，具有獨一無二的森林生態環境，孕育了大量具有豐富多樣性的生物資源。植物根際土壤中蘊含種類豐富的微生物資源，它們與植物之間進行物質、能量的交換，能夠提高土壤中植物難以吸收利用物質的轉化率，還可以分泌多種次生代謝物，降解土壤中的有害成分等，有助于創造出更加有益于植物和微生物生長的有利環境，蘊含較強的潛在農用價值，無量山根際土壤的特殊生境更易于發現高活性的菌株。

本研究從含有豐富微生物資源的無量山原始森林根際土壤中分離鑒定得到204株細菌，并從功能菌株中篩選得到兩株功能多樣化的菌株，對其多項生物活性進行探究，并通過促種子發芽實驗和室內盆栽試驗驗證菌株對植株的促進生長能力，確定菌株的應用潛力。從獨特的森林根際土壤環境下，篩選得到高活性多功能的根際微生物，并利用生物特性應用于農業生產實踐中，有望取代化學肥料的營養支持作用，是一種生態友好、低消耗的替代措施，為可持續農業的發展提供有力的工具支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試土壤 土壤樣品采自云南省普洱市景東彝族自治縣無量山國家級自然保護區的25個地區的植株根際土壤，去除植株根際表面可見的雜物，挖取0-20 cm的土樣，裝入無菌袋中，于4℃冰箱中保存。

1.1.2 培養基的配置 參照引用文獻配置的培養基包括無機磷培養基［9］、有機磷培養基［9］、固氮培養基［10］、無鐵察氏（CAS）培養基［11］、DF（Dworkin and Foster）培養基［12］、溶鋅培養基［13］。平板計數瓊脂培養基（plate count agar, PCA）（g/L）：胰蛋白胨5.0，酵母浸粉2.5，葡萄糖1.0，瓊脂15.0，pH值7.0±0.2。生長素檢測培養基［14］：蛋白胨20 g/L，甘油15 mL/L，K2HPO41.5 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，色氨酸0.1 g/L，pH 7.2±0.2。1-氨基環丙烷-1-羧酸篩選（ADF）培養基［12］：將DF培養基中的硫酸銨替換為1-氨基環丙烷-1-羧酸（ACC）。

1.1.3 供試病原菌 煙草疫霉（Phytophthora parasitica var.nicotianae）、莖點霉（Phoma matteuciicola）、木賊鐮刀菌（Fusarium equiseti）。由云南省農業科學院農業環境資源研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 分離根際微生物的分離 采集云南省無量山國家級自然保護區的25個不同地區和植物的根際土壤，于無菌袋中4℃保存。取新鮮采集的土壤樣品2 g于裝有200 mL無菌水的500 mL錐形瓶中，放入適量玻璃珠，于30℃恒溫搖床進行振蕩培養4-6 h，吸取200 μL溶液以10-4、10-5濃度于PCA培養基上進行稀釋涂板，挑選出活力較好的菌株。

1.2.2 菌株鑒定

（1）形態學和生理生化鑒定。觀察菌株在PCA培養基上的生長形態和光學顯微鏡下的細胞形態，并參考《伯杰細菌鑒定手冊》及《常見細菌系統鑒定手冊》對菌株的生理生化包括革蘭氏染色、過氧化氫酶、氧化酶、蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、生長pH范圍、生長鹽濃度范圍、生長溫度范圍進行鑒定。

（2）分子學鑒定。采用chelex-100法提取細菌DNA［15］，并將提取的DNA作為模板，使用通用引物PA（5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3'）和PB（5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'）進行16S rDNA序列的PCR擴增。PCR反應體系（25 μL）為基因組DNA 1 μL、PA（10 μmol/L）0.5 μL、PB（10 μmol/L）0.5 μL、Taq PCR Master mix 11 μL、ddH2O 12 μL。反應程序為95℃ 5 min，然后30-35個循環（95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 90 s），72℃ 10 min。將得到的PCR產物送往北京擎科生物科技股份有限公司測序，并在Ez biocloud（https://www.ezbiocloud.net/）上進行同源性比對，利用MEGA7.0構建系統發育樹，并通過Bootstrap進行1 000次重復測試，結合生理生化結果，確定菌株分類地位。

1.2.3 根際微生物的功能篩選

（1）磷酸鹽溶解功能篩選。將得到的菌株接種于無機磷和有機磷培養基，培養3 d后，挑取產生透明圈的菌株，并以十字交叉法測量透明圈直徑（D）及菌落直徑（d），以D/d來初步評估菌株的解磷強度。將篩選出的高活性菌株劃線純化后，以20%的甘油制成甘油管后于-80℃保藏。將純化后的菌株接入300 mL的LB液體培養基中，以30℃、180 r/min振蕩培養1 d后，制成種子液。將種子液以1%的量接種于100 mL無機磷液體培養基中，重復3次，在150 r/min、30℃環境下培養5 d。每隔24 h使用鉬銻抗比色法測量可溶性磷的含量，并使用pH儀測量菌液上清液的pH值。

（2）固氮功能活性篩選。將待測菌株接入固氮培養基，于30℃恒溫培養箱中倒置培養5 d后，若菌株產生透明圈，若出現，則證明菌株具有固氮功能，測量透明圈直徑（D）及菌落直徑（d），以D/d來初步評估菌株的固氮強度。

（3）溶鋅功能活性篩選。將菌株接種于溶鋅培養基，于30℃恒溫培養箱中倒置培養5 d后，若菌株產生透明圈，則證明菌株具有溶鋅功能，測量透明圈直徑（D）及菌落直徑（d），以D/d來初步評估菌株的溶鋅強度［16］。

（4）分泌鐵載體功能活性篩選。將待測菌株接種于CAS培養基中倒置30℃培養3 d，若出現明顯的顯色暈圈，則菌株具有分泌鐵載體活性，測量透明圈直徑（D）及菌落直徑（d），以D/d來初步評估菌株的分泌鐵載體強度。為確定菌株的產鐵載體能力，將活性菌株接入100 mL CAS液體培養基，在30℃、160 r/min條件下振蕩培養2 d，吸取2 mL菌液過0.22 μm無菌濾膜后加入2 mL CAS檢測液，靜置1 h后測定菌液OD630值（記作“As”），將空白CAS液體培養基的OD630值作為參比值（記作“Ar”）。鐵載體的濃度用鐵載體活性單位（siderophoreunit,SU）表示，計算方式如下公式所示［11］。

SU/%=（Ar-As/Ar）=×100%

（5）分泌吲哚乙酸功能篩選。菌株在NB培養基中培養24 h后，取1%接入KB培養基中，以30℃ 180 r/min振蕩培養24 h后，吸取1 mL與4 mL Sackowcki’s顯色劑混合，用分光光度計測定其OD535值，重復3次，以空白比色液OD535為零值，帶入標準曲線，測得菌株的IAA產量［17］。

（6）分泌ACC脫氨酶功能篩選。采用ACC唯一氮源法，將活化菌株接種于以(NH4)2SO4為氮源的DF培養基上3-4 d后，將菌株轉接到以ACC為氮源的ADF培養基上，重復接種于ADF培養基上，菌株若能夠存活，則菌株具有分泌ACC脫氨酶功能。除此之外，還使用聚合酶鏈式反應檢測菌株是否具有分泌ACC脫氨酶的關鍵基因acdS基因。使用簡并引物acdSf3（5'-ATCGGCGGCATCCAGWSNAAYCANAC-3'）和acdSr4（5'-GGCACGCCGCCCARRTGNRCRTA-3'）進行acdS基因的PCR擴增。PCR反應體系（50 μL）為基因組DNA 2 μL、acdSf3（10 μmol/L）0.5 μL、acdSr4（10 μmol/L）0.5 μL、Taq PCR Master mix 25 μL、ddH2O 22 μL。反應程序為94℃ 4 min；94℃45 s，53℃ 45 s，72℃ 1 min，35個循環；72℃ 10 min［18］。將得到的PCR產物送往北京擎科生物科技股份有限公司測序，在DNA star軟件上將序列翻譯成蛋白質，并使用MEGA7.0進行多序列比對，使用Gene Doc美化序列比對結果，確認菌株具有分泌ACC脫氨酶的功能。

（7）拮抗病原菌功能篩選。采用平板對峙法，接種待測菌株于PDA平板兩側，病原菌菌餅倒置接種于平板中央，將只接種病原菌菌餅的平板設置為對照組。

真菌抑制率/%=（對照菌落直徑-實驗組菌落直徑/對照組菌落直徑-菌餅直徑）×100%

1.2.4 菌株促生功能的驗證 （1）菌株的促番茄種子發芽實驗。本實驗共設置2個對照組（CK1：施加無菌水，CK2：施加營養肉湯培養基）和4個處理組（T1：1 d菌株發酵上清液，T2：稀釋10倍的發酵液上清液，T3：稀釋102倍的發酵上清液，T4：稀釋103倍的發酵上清液）。將較多的番茄種子放入水中，取沉淀到水下的種子在水中常溫浸泡12 h后，取各組種子置于鋪墊2-3層滅菌濾紙的9 cm透明培養皿中。每個處理每皿15粒種子，重復3次。對應處理的液體約2 mL將培養皿中的濾紙潤濕后，于28℃人工氣候箱培養7 d，每隔24 h需要加入無菌水將濾紙潤濕。7 d后測得番茄種子萌發的個數和萌發種子的苗長度。

（2）番茄植株盆栽實驗。本實驗共設置2個對照組（CK1：施加無菌水，CK2：施加營養肉湯培養基）和3個處理組（T1：3 d發酵液，T2：稀釋10倍的發酵液，T3：稀釋102倍的發酵液）。番茄幼苗栽種后定植3 d后，對T1、T2、T3處理的每個盆栽添加200 mL的菌株發酵液，CK1的每個盆栽添加200 mL的無菌水，CK2的每個盆栽添加200 mL的無菌NB液體培養基。生長期間每3 d澆水1次，每隔7 d測量番茄植株的莖粗和地上部分高度，35 d測量所有實驗組的植株地上部分長度、鮮重、干重、莖粗和地下部分的根長、根鮮重、干重。

（3）番茄植株根際土壤理化指標測定。測定種植35 d后的番茄根際土壤的常規8項理化指標，包括pH、有機質、全氮、全磷、全鉀、堿解氮、速效磷、有效鉀。參照魯如坤等［19］《土壤農業化學分析方法》的方法進行測定。

1.2.5 數據處理 使用Mega7.0進行序列的同源性比對，DNA star軟件進行核酸序列的翻譯，Gene Doc軟件進行多序列比對的可視化分析。對實驗得到的數據使用SPSS 18.0軟件的單因素方差分析（ANOVA）尋求不同處理組之間是否存在差異，并使用origin 2018進行圖表繪制。

2 結果

2.1 根際菌株的分離鑒定

采用PCA培養基從無量山根際土壤中分離得到共204株。對分離菌株的16S rDNA基因序列進行比對發現，屬于厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）3門32屬，門水平和屬水平的菌株分布如圖1所示。屬水平的優勢類群為芽孢桿菌（Bacillus）、假單胞菌（Pseudomonas）、馬賽菌屬（Massilia）、普里斯特氏菌屬（Priestia）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus），其中芽孢桿菌占分離菌株占比最大為37.56%。從中選取32屬的代表菌株構建的16S rDNA基因系統發育樹如圖2所示，代表菌株穩定分布于3門中的不同屬內。

圖1 無量山根際土壤可培養微生物門水平（A）和屬水平（B）分布特征Fig. 1 Distribution characteristics of cultivable microbial phylum level（A）and genus level（B）of Wuliangshan mountain rhizosphere soil

圖2 無量山根際土壤中32屬代表菌株基于16S rDNA基因構建的鄰接法系統發育樹Fig. 2 Phylogenetic tree of 32 genera representative strains in the Wuliangshan rhizosphere soil , constructed by neighbor-joining tree based on 16S rDNA gene

2.2 菌株功能篩選

從解磷、固氮、解鉀、拮抗鐮刀菌4個方面對分離得到的菌株進行活性檢測。其中，解磷菌共有70株，固氮菌共有27株，解鉀菌共有8株，拮抗鐮刀菌的菌株共有51株，部分活性菌株具體功能活性見表1。其中芽孢桿菌屬、假單胞菌屬在上述4種功能都占據多數。挑選功能較多活性較強的菌株進行分泌鐵載體、分泌吲哚乙酸、拮抗病原菌實驗，成功選出兩株具有上述功能的菌株YIM B08401和YIM B08402。

表1 部分活性菌株促生特性Table 1 Growth-promoting and disease-resistant properties of some active strains

2.3 功能菌株的鑒定

菌株YIM B08401和菌株YIM B08402分別從無量山的華山松（Pinus armandii）根際土壤（100°49'25″N，24°27'00″E）和酸模（Rumex acetosa）根際土壤（100°22'56″N，24°44'30″E）中，利用稀釋涂布法從PCA培養基上成功分離得到。

菌株YIM B08401在PCA培養基上菌落呈現為近圓形，邊緣不整齊，中間黃色邊緣白色，濕潤、有光澤。經光學顯微鏡鑒定為桿狀菌。是革蘭氏陰性菌，能在0-4%（體積質量分數）鹽濃度、pH為4-8、10-40℃環境下生長，過氧化氫酶、氧化酶、蛋白酶陽性，淀粉酶、纖維素酶陰性。菌株YIM B08402在PCA培養基上菌落呈現為近圓形，邊緣不整齊，黃色，濕潤、有光澤。經光學顯微鏡鑒定為桿狀菌。是革蘭氏陰性菌，能在0-6%（體積質量分數）鹽濃度、pH為6-8、4-40℃環境下生長，過氧化氫酶、氧化酶陽性，蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶陰性。

將測序得到的16S rDNA基因在EZ biocloud數據庫（https://www.ezbiocloud.net/）中進行比對，構建系統發育樹（圖3），結合形態學觀察和生理生化實驗，確認菌株YIM B08401是白色伯克霍爾德氏菌（Burkholderia alba），GenBank登錄號為OR398962，菌株YIM B08402是青島假單胞菌（Pseudomonas qingdaonensis），登錄號為OR398963。

圖3 菌株YIM B08401（A）和菌株YIM B08402（B）基于16S rDNA基因構建的鄰接法系統發育樹Fig. 3 Neighbor-joining trees of the strain YIM B08401（A）and YIM B08402（B）based on 16S rDNA gene

2.4 功能菌株促生抗病功能

對兩個菌株進行功能篩選后發現，菌株YIM B08401具有磷酸鹽溶解、固氮、溶鋅、分泌鐵載體和ACC脫氨酶、拮抗病原菌（煙草疫霉、木賊鐮刀菌、莖點霉）的活性。菌株YIM B08402具有磷酸鹽溶解、固氮、溶鋅、分泌鐵載體和吲哚乙酸的活性。

2.4.1 菌株營養轉化活性分析 將待試菌株接種于無機磷培養基、有機磷培養基、固氮培養基、溶鋅培養基，于30℃恒溫培養箱中倒置培養3 d后，所有培養基均出現明顯的透明暈圈（圖4），并以D/d值判斷菌株的營養轉化能力（表2）。

表2 菌株的營養轉化指數Table 2 Nutrient transformation indexes of the strain

圖4 菌株YIM B08401的溶磷（A）、解磷（B）、固氮（C）、溶鋅（D）和YIM B08402的溶磷（E）、解磷（F）、固氮（G）、溶鋅（H）效果圖Fig. 4 Effect diagram of dissolved phosphorus（A）, phosphorus solution（B）, nitrogen fixation（C）, zinc dissolution（D）of YIM B08401 and phosphorus dissolution（E）, phosphorus solution（F）, nitrogen fixation（G）, and zinc dissolution（H）of YIM B08402

使用鉬銻抗比色法定量測定5 d菌株的溶磷能力和pH值變化，結果如圖5所示。菌株YIM B08401發酵液在第2天的可溶性磷含量達到最大為（455.63±59.65）mg/L，而pH值在第1天從7.00快速下降到（4.94±0.13）后一直上升。而菌株YIM B08402發酵液在第1天的可溶性磷含量達到最大為（878.95±64.78）mg/L，而pH值在第1天從7.00快速下降到4.50后一直上升，在第4天發酵液中不含有可溶性磷。

圖5 菌株YIM B08401（A）和YIM B08402（B）發酵液可溶性磷含量及pH變化Fig. 5 Soluble phosphorus content and pH in the fermentation broth of the strain YIM B08401（A）and YIM B08402（B）

2.4.2 菌株分泌鐵載體活性分析 接種于CAS培養基后出現明顯紅色暈圈（圖6），證明菌株具有分泌鐵載體的功能，經過定量實驗確認菌株YIM B08401其鐵載體含量為67.12%，菌株YIM B08402其鐵載體含量為32.41%。

圖6 菌株YIM B08401（A）和YIM B08402（B）的分泌鐵載體效果圖Fig. 6 Secretory siderophores of strain YIM B08401（A）and YIM B08402（B）

2.4.3 菌株分泌吲哚乙酸活性分析 經過定性實驗（圖7），菌株YIM B08401無分泌吲哚乙酸的功能，菌株YIM B08402能夠分泌吲哚乙酸，其菌株發酵液通過與Sackowcki’s顯色劑比色得到OD535，代入標準曲線算出其在第2天分泌的吲哚乙酸含量最高為（24.57±0.14）μg/mL。

圖7 菌株YIM B08402的分泌生長素活性測定Fig. 7 Determination of IAA activity of strain YIM B08402

2.4.4 菌株分泌ACC脫氨酶活性分析 菌株YIM B08401能夠在多次轉接種到ADF平板上仍然能夠存活，使用引物acdSf3和acdSr4進行PCR擴增后成功得到acdS基因片段，使用DNA star軟件的Editseq應用將核酸序列翻譯為蛋白質序列，并與具有ACC脫氨酶功能的菌株acdS基因的蛋白序列進行多序列比對及可視化（圖8）。E（谷氨酸）295和L（亮氨酸）322是ACC脫氨酶所特有的，經過比對發現菌株YIM B08401同樣在295和322位置上具有E和L，證明菌株YIM B08401具有分泌ACC脫氨酶的功能。菌株YIM B08402不具有分泌ACC脫氨酶的能力。

圖8 菌株YIM B08401與具有ACC脫氨酶的菌株蛋白質序列的多序列比對Fig. 8 Multiple sequence alignment of proteins in strain YIM B08401 and strain with ACC deaminase

2.4.5 菌株拮抗病原菌活性分析 經過平板對峙實驗，證明菌株YIM B08402不具有拮抗病原菌功能，而菌株YIM B08401可以有效拮抗病原菌（煙草疫霉、莖點霉、木賊鐮刀菌），針對煙草疫霉的拮抗率達到了52.55%，對莖點霉的拮抗率達到76.68%，對木賊鐮刀菌的拮抗率達到了69.84%（圖9）。

圖9 菌株YIM B08401對煙草疫霉（A）、莖點霉（B）、木賊鐮刀菌（C）的拮抗效果Fig. 9 Antagonistic effects of strain YIM B08401 against Phytophthora parasitica var. nicotianae（A）, Phoma matteuciicola（B）and Fusarium equiseti（C）

2.5 菌株促生功能驗證結果

2.5.1 菌株對番茄種子的促發芽效果 在發芽率方面，兩個菌株施加了NB培養基的CK2都是發芽率最低的實驗組，且明顯低于施加清水的CK1。T1、T2、T3、T4均高于兩個對照組的發芽，且稀釋了1 000倍的T4處理均是萌發率最高的處理組。在苗長度方面，兩個菌株的T1相較于CK1對照組存在明顯抑制作用，施加稀釋10倍的T2處理的苗長度顯著高于其他處理組。其他處理組促進作用相近或弱于無菌水對照組，但均明顯高于NB對照組。與CK1相比較，施加NB培養基的CK2對種子的萌發存在顯著抑制作用（圖10-11）。

圖10 菌株YIM B08401（A）和YIM B08402（B）的各處理番茄苗Fig. 10 Tomato seedlings under each treatment by strain YIM B08401（A）and YIM B08402（B）

圖11 菌株YIM B08401（A、B）和YIM B08402（C、D）的各處理番茄種子發芽長度和發芽率Fig. 11 Germination lengths and germination rates of tomato seeds of strain YIM B08401（A, B）and YIM B08402（C, D）

2.5.2 菌株對番茄植株盆栽促生效果 35 d的番茄盆栽實驗結果（圖12-13）表明，第35天施加了發酵液的處理相較于CK1和CK2具有顯著差異（P＜0.05）。其中菌株YIM B08401的T1處理組相較于對照組CK1，株高凈增長量提高了89%，莖直徑提高了62%，地上部分鮮重提高了495%，地上部分干重提高了268%，根長提高了53%，根鮮重提高了385%，根干重提高了469%，處理組和對照處理間具有顯著差異（P＜0.05）。而菌株YIM B08402的T1處理組的農藝指標方面相較于CK1株高凈增長量提高了118%，莖直徑提高了32%，地上部分鮮重提高了528%，地上部分干重提高了477%，根長提高了37%，根鮮重提高了413%，根干重提高了747%。施菌處理和對照處理間具有顯著差異（P＜0.05）。

圖12 菌株YIM B08401（A）和YIM B08402（B）的各處理番茄植株Fig. 12 Tomato plants treated with strain YIM B08401（A）and YIM B08402（B）

圖13 菌株YIM B08401和YIM B08402各處理對番茄植株地上部鮮重（A）、地上部干重（B）、地上部長度（C）、根鮮重（D）、根干重（E）、根長（F）、莖粗（G）的影響Fig. 13 Effects on the fresh weight of above ground part（A）, dry weight of above ground part（B）, length of above ground part（C）, fresh weight of root（D）, dry weight of root（E）, root length（F）,stem diameter（G）of tomato plants under each treatment of strain YIM B08401 and YIM B08402

2.5.3 促生盆栽根際土壤理化指標 測定第35天兩個菌株處理的根際土壤常規8項，結果（表3）表明，兩個菌株的數據差異不大，處理組之間的pH值、全磷差異不大，T1的全鉀、速效鉀含量均高于兩個對照組，而有機質、全氮、全磷、水解性氮、水解性氮的含量均低于對照組。

表3 番茄根際土壤理化指標Table 3 Physicochemical indexes in the rhizosphere soil of tomato plants

3 討論

可持續發展一直是農業生產中追求的目標，通過微生物肥料來取代化學肥料是近年來受到廣泛關注的話題，尋求功能豐富的菌株資源是開發新型生物肥料過程中的關鍵問題［20］。根際微生物作為一類生活在植物根際環境，與植物相互作用進行物質交換、能量流動的微生物類型，符合功能豐富菌株資源的要求。目前，促生微生物的分離主要以作物根際、內生環境等居多，森林根際土壤較少被采集用于促生微生物的分離，森林具有獨特的生態環境，蘊育了豐富的微生物菌種資源，挖掘森林根際土壤可培養功能微生物是農用微生物資源開發的新方向。因此，本研究采集具有豐富生物多樣性的云南省無量山國家級自然保護區的根際土壤，成功分離鑒定了204株細菌，從屬于厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門3門32屬，功能篩選出88株潛在活性的菌株，活性菌株的比例占據總分離的43.13%，功能微生物在森林根際土壤中含量較多。并選擇兩株功能更強更多樣的白色伯克霍爾德氏菌YIM B08401和青島假單胞菌YIM B08402作為主要的研究對象。

伯克霍爾德氏菌和假單胞菌是廣泛報道的典型促生菌，伯克霍爾德氏菌中存在一類對植物或環境有益的物種，這類物種常常可以在根際土壤環境中被分離出來，究其原因可能是該類物種具有多種營養轉化、分解代謝等功能，能夠將植物根際分泌的產物進行轉化分解，并提供植物其分泌的代謝產物，形成植物-微生物的循環共生生態環境［21-23］，如Bhakat等［24］分離的越南伯克霍爾德氏菌（B.vietnamiensis）EIKU14可以轉化不溶的氧化鋅為植物所吸收，Zhang等［25］從茶葉（Camellia sinensis）根際土壤中分離得到的伯克霍爾德氏菌能夠將不溶性鉀轉化為可溶性鉀，提高了多項茶樹農藝數據，增加了葉片多酚含量。參照多個伯克霍爾德氏菌的研究指向，探究本研究是否存在同樣的功能作用，結果發現，本研究的白色伯克霍爾德氏菌YIM B08401磷酸鹽溶解、固氮、溶鋅、分泌鐵載體、分泌ACC脫氨酶方面都有著較高的活性，應用于番茄種子和植物后都有顯著的促進效果，相較于其他伯克霍爾德氏菌促生功能更加全面。此外，菌株YIM B08401還具有拮抗病原菌的功能活性，在促進植物生長的同時還可以起到抵御病原菌侵襲的作用，是值得更進一步發掘的微生物資源。

根際土壤中存在的假單胞菌為了更好在根際范圍爭奪養分，會趨向于通過抗菌、刺激植物防御機制和爭奪生態位和養分，或利用磷酸鹽和鐵的溶解、固氮、植物激素調節和增加非生物脅迫耐受性等機制在根際環境生存且與植物互利共生，因此假單胞菌屬在根際環境中會顯示出更豐富的多樣性［26］。Mohapatra等［27］發現Pseudomonas bharatica CSV86可以代謝芳香代謝物、分泌鐵載體和吲哚乙酸。參照其他研究者的針對這兩個屬的功能研究方向，有助于發現新的功能［28］。本研究的青島假單胞菌YIM B08402分別在解磷、固氮、溶鋅、分泌鐵載體、分泌吲哚乙酸方面都有著較高的活性，是值得應用于農業生產的具有較大應用潛力的活性菌株。

截至2023年，已有10 175個農業農村部正式登記的微生物肥料產品，采用的菌株多為芽孢桿菌、木霉等常見的功能菌株，使用伯克霍爾德氏菌和假單胞菌作為菌種的產品分別僅有3種和64種，且都未查到有以白色伯克霍爾德氏菌和青島假單胞菌為菌種的正式登記微生物肥料［29］，依靠本研究中的功能探究結果，菌株YIM B08401和YIM B08402是具有開發成為微生物肥料的潛力菌株。但本研究只涉及功能研究，并未對菌株的安全性進行驗證，對于菌株是否能夠開發成為正式登記的微生物肥料還有待后續的實驗補充及大田驗證。

后續還將對兩個菌株進行全基因組的測序，利用目前發展迅速的生物信息工具對菌株的隱藏潛力進行挖掘，包括分析其是否能夠耐受重金屬［30-32］；是否具有分泌胞外多糖和生物膜等與定植根際環境相關的潛力，并結合熒光定量方法探索菌株在植物根際環境的定植能力強弱［33］；以及通過antiSMASH、PRISM 4和BAGEL 4等數據庫揭示細菌中可能存在的天然次生代謝產物［34-36］。除此之外，還將實驗驗證兩個菌株之間的生物相容性，了解菌株復合之后是否能夠具有與單個菌株相同或更好的生物活性，輔以其他成分，以復合菌株體系的形式應用于實驗中，探索其是否具有開發成微生物肥料的應用潛力，為菌株的開發應用提供較為廣闊的發展方向。

4 結論

從無量山根際土壤篩選得到88株活性菌株，其中兩株高活性菌株B. alba YIM B08401和P.qingdaonensis YIM B08402，均能溶解磷酸鹽、固氮、溶鋅、分泌鐵載體，YIM B08401還具有拮抗病原菌和分泌ACC脫氨酶的功能，YIM B08402還能分泌IAA。菌液處理后發芽率和發芽長度分別提高了33%-44%和4.67-8.05 cm，并使得番茄植株的農藝性狀數據增加了37%-747%，其根際土壤的理化指標間接證明菌株的促生能力顯著，為微生物肥料的制備提供了潛在的優良菌株資源。