元蘑多糖的結構特征及其調節巨噬細胞免疫活性機制

王子璇 隋玉 尚學鈺 馬思嘉 吳天香 劉洋 王琦，3

（1. 吉林農業大學食藥用菌教育部工程研究中心，長春 130118；2. 吉林農業大學植物保護學院，長春 130118；3. 吉林農業大學中藥材學院，長春 130118）

元蘑（Sarcomyxa edulis）隸屬于擔子菌門（Basidiomycota）、蘑菇綱（Agaricomycetes）、蘑菇目（Agaricales）、小菇科（Mycenaceae）、美味扇菇屬（Sarcomyxa）［1］，又稱凍蘑、冬蘑等。中醫認為，元蘑味鮮，性質溫和，還具有除濕活血、舒緩經絡、祛風等作用［2］。元蘑營養美味，分布廣泛，且已實現人工栽培，具有重要的經濟和藥用價值。

巨噬細胞是機體重要的免疫細胞，具有分泌細胞因子、調控機體平衡以及保護機體免受外界病原體侵害等多種生物學功能［3］。多糖是真菌中重要的活性成分，大量研究表明，食藥用菌多糖如裂褶菌多糖［4］、羊肚菌多糖［5］等可調節免疫細胞，促進其細胞因子的產生，增強其吞噬功能，進而提高機體免疫能力［6］。

現已研究發現，元蘑多糖具有保護腸道健康［7］、抗氧化［8］、降血糖［9］、抗衰老［10］、抗疲勞［2］等多種生物活性，而其對巨噬細胞的免疫活性尚未見報道。本研究以元蘑多糖為研究對象，采用DEAE-52離子交換層析和Sephacryl S-400葡聚糖凝膠過濾層析對其進行分離純化，采用高效凝膠滲透色譜法、傅里葉變換紅外光譜分析等方法，明確其理化性質和結構特征，并系統考察了其對巨噬細胞免疫調節作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 元蘑（干品）由黑龍江省牡丹江市溫春農校提供，RAW264.7細胞由吉林農業大學食藥用菌教育部工程研究中心提供。DEAE-52纖維素、5%中性紅染液購自北京索萊寶科技有限公司；CCK-8購自Biosharp；Trizol、反轉錄試劑盒、qPCR試劑盒購自SparkJade；胎牛血清、胰酶購自Hyclone；RIPA裂解液、PMSF、BCA蛋白定量檢測試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、一抗（β-actin）、GAPDH、Histone H3、二抗均購自Servicebio。

1.1.2 儀器與設備 多功能酶標儀、ICS5000離子色譜儀（Thermo Fisher Scientific）；ST 16R高速冷凍離心機（日立）；BSZ-100自動部分收集器（上海青浦滬西儀器廠）；BPN-80CH CO2培養箱（上海恒一）；XD-101倒置生物顯微鏡（德國Zeiss）；D3024R臺式高速冷凍離心機（Dragonlab）；熒光定量PCR擴增儀（賽默飛）；MX-F渦旋混合器、BV-2垂直電泳儀、BT-2轉印電泳儀購于Servicebio。

1.2 方法

1.2.1 元蘑多糖的提取與分離純化 參照隋玉等［11］水提醇沉法提取多糖。精確稱取元蘑子實體干品500 g，粉碎后加入去離子水，料液比為1∶30（g/mL），提取溫度80℃，提取時間3 h，以8 000 r/min的速度離心12 min，收集上清液，將其濃縮至原體積的1/4，加入3倍體積無水乙醇，4℃靜置過夜后，離心15 min，轉速為6 000 r/min，收集的沉淀即為多糖粗品，干燥備用。使用Sevag法除蛋白后，選擇截留分子量為3 500 Da的透析袋流水透析48 h，凍干得到元蘑多糖SEP。

將元蘑多糖SEP進行DEAE-52離子交換層析。配制4 mg/mL的SEP溶液，緩慢沿DEAE-52纖維素凝膠柱（1.8 cm×25 cm）柱壁均勻上樣，依次用蒸餾水、0.1 mol/L、0.3 mol/L NaCl進行洗脫，流速1 mL/min，6 mL/管，不同洗脫梯度各收集50管。采用苯酚-硫酸法［12］對各管收集的洗脫液進行檢測，以管數為橫坐標，490 nm處吸光度值為縱坐標繪制洗脫曲線，并收集水洗多糖組分，命名為SEP-0。

進一步對SEP-0進行Sephacryl S-400葡聚糖凝膠過濾層析，配制10 mg/ mL SEP-0溶液，除雜除氣泡后緩慢推進上樣，用0.15 mol/L NaCl進行洗脫，流速0.5 mL/min，4 mL/管，收集40管。采用苯酚-硫酸法對每管收集的樣品進行多糖含量檢測，并繪制洗脫曲線。根據洗脫曲線收集單一峰作為多糖組分SEP-0a。

1.2.2 元蘑多糖理化性質檢測

1.2.2.1 多糖含量測定 采用苯酚-硫酸法對元蘑多糖SEP-0a進行多糖含量檢測。向含有200 μL濃度為0.25 mg/mL的元蘑多糖溶液中加入100 μL 5%苯酚溶液后，再加入500 μL 98%濃H2SO4，室溫條件下靜置20 min，490 nm處檢測吸光度值（OD值），根據葡萄糖標準曲線計算樣品多糖含量。

1.2.2.2 蛋白含量測定 采用考馬斯亮藍法［13］對蛋白含量進行測定。向含有1 mL濃度為1.0 mg/mL的元蘑多糖SEP-0a中加入5 mL考馬斯亮藍G250溶液，室溫靜置5 min，595 nm處檢測吸光度值（OD值），根據標準曲線計算樣品蛋白質含量。

1.2.2.3 均一性及分子量測定 采用高效凝膠滲透色譜法（High Performance Gel Permeation Chromatography Evaporative Light-scattering Detector，HPGPC-ELSD）對元蘑多糖SEP-0a進行均一性及分子量檢測。配制5 mg/mL SEP-0a溶液，過濾采用0.22 μm水系濾膜進行，進樣量為10 μL，按照色譜條件進行洗脫，記錄保存色譜圖，按照標準曲線方程計算樣品的分子量。

色譜條件：檢測器為RID-10A視差折光檢測器，TSK-gel G-3000PWXL色譜柱（7.8 mm×300 mm），柱溫：35℃，流動相：0.2 mol/L氯化鈉水溶液，流速：0.6 mL/min。

1.2.2.4 單糖組成檢測 采用離子交換色譜法（Ion Exchange Chromatography High Performance Liquid Chromatography，IEC-HPLC）對元蘑多糖SEP-0a進行單糖組成的分析。稱取5 mg（±0.05 mg）SEP-0a，加入5 mL三氟乙酸（2 mol/L），溫度121℃，加熱2 h，通入N2，加3 mL甲醇洗滌并吹干，重復上述步驟3次，加入無菌水溶解，用0.22 μm濾膜過濾，轉移至色譜瓶，上機檢測。

色譜條件：DionexTMCarboPacTMPA10液相色譜柱（4.0 mm×250 mm，10 μm），柱溫：30℃，電化學檢測器，流動相：A相：H2O；B相：100 mmol/L NaOH，進樣量：20 μL，流速：0.5 mL/min。

1.2.3 元蘑多糖的紅外光譜分析 稱取元蘑多糖SEP-0a 1.9 mg與KBr粉末190.0 mg，使其充分混勻后進行壓片，在傅里葉變換紅外光譜儀（Fourier transform infrared spectrometer, FT-IR）波長頻率為4 000-400 cm-1的范圍內掃描檢測，重復3次，取平均值。

1.2.4 SEP-0a對巨噬細胞存活率的影響 采用CCK-8法［14］檢測SEP-0a對巨噬細胞存活率的影響。取濃度為2.5×104個/mL的RAW264.7細胞接種于96孔板，在含有5%二氧化碳恒溫（37℃）培養箱中培養12 h，棄上清，設置6個實驗組，分別為空白對照組（DMEM基礎培養液）、SEP-0a不同濃度給藥組（50、100、500、1 500 μg/mL）、陽性對照組（LPS 1 μg/mL），繼續培養24 h，吸掉培養液，加入CCK-8（CCK-8∶DMEM基礎培養液=1∶10）100 μL，避光培養45 min，450 nm處檢測吸光度值，計算細胞存活率。

1.2.5 SEP-0a對巨噬細胞吞噬作用的影響 采用中性紅法［15］檢測SEP-0a對巨噬細胞吞噬作用的影響。將RAW264.7細胞（5 000個/孔）接種于96孔板，在含有5%二氧化碳恒溫（37℃）培養箱中培養24 h，棄去上清，設置6個實驗組，分別為空白對照組（DMEM基礎培養液）、SEP-0a不同濃度給藥組（50、100、500、1 500 μg/mL）、陽性對照組（LPS 1 μg/mL），繼續培養24 h，吸掉培養液。配制0.1%中性紅染液，加入100 μL，在含有5%二氧化碳恒溫（37℃）培養箱中避光培養60 min，棄上清，用PBS（200 μL/孔）進行清洗，重復3次，加入細胞裂解液（100 μL/孔）裂解2 h，此操作避光進行，在540 nm處檢測吸光度值。

1.2.6 SEP-0a對巨噬細胞產生ROS的影響 采用2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA）熒光探針法［16］檢測SEP-0a對巨噬細胞產生ROS的影響。取濃度為5×104個/mL的RAW264.7細胞接種于96孔板，在含有5%二氧化碳恒溫（37℃）培養箱中培養12 h，棄去上清，設置6個實驗組，分別為空白對照組（DMEM基礎培養液）、SEP-0a不同濃度給藥組（50、100、500、1 500 μg/mL）、陽性對照組（LPS 1 μg/mL），繼續培養24 h，將培養液吸出，每孔加入DCFH-DA 200 μL，培養箱培養20 min，用不含血清的基礎培養液洗滌3次后再加入200 μL基礎培養液，在激發波長為488 nm，發射波長為525 nm的條件下檢測熒光強度。

1.2.7 SEP-0a對巨噬細胞分泌NO影響 采用一氧化氮法［17］檢測SEP-0a對RAW264.7細胞分泌NO影響。取濃度為2.5×105個/mL的RAW264.7細胞接種于96孔板，在含有5%二氧化碳恒溫（37℃）培養箱中培養12 h，棄上清，設置6個實驗組，分別為空白對照組（DMEM基礎培養液）、SEP-0a不同濃度給藥組（50、100、500、1 500 μg/mL）、陽性對照組（LPS 1 μg/mL），繼續培養24 h，吸取上清，在新的96孔板中，加入50 μL的細胞上清與稀釋后的標準品，每組4個復孔，先分別加入Griess Reagent I（50 μL/孔），然后立即加入Griess Reagent II（50 μL/孔），在540 nm處檢測吸光度值。

1.2.8 SEP-0a對巨噬細胞分泌TNF-α、IL-1β以及IL-6的影響 采用ELISA法［18］檢測SEP-0a對RAW264.7細胞分泌TNF-α、IL-1β以及IL-6的影響。將RAW264.7細胞（5 000個/孔）接種于96孔板，在含有5%二氧化碳恒溫（37℃）培養箱中培養24 h，棄去上清，設置6個實驗組，分別為空白對照組（DMEM基礎培養液）、SEP-0a不同濃度給藥組（50、100、500、1 500 μg/mL）、陽性對照組（LPS 1 μg/mL），繼續培養24 h，吸取上清，并將其轉移至新的無菌離心管中，2 500 r/min離心20 min，取上清待測。使用ELISA試劑盒根據說明對TNF-α、IL-1β以及IL-6進行測定，在450 nm處檢測吸光度值。

1.2.9 SEP-0a對巨噬細胞中TNF-α、IL-1β以及IL-6基因表達的影響 采用qPCR法［19］檢測SEP-0a對RAW264.7細胞中TNF-α、IL-1β以及IL-6基因表達的影響。取濃度為1×106個/mL的RAW264.7細胞接種于6孔板，在含有5%二氧化碳恒溫（37℃）培養箱中培養24 h，棄去上清，設置6個實驗組，分別為空白對照組（DMEM基礎培養液）、SEP-0a不同濃度給藥組（50、100、500、1 500 μg/mL）、陽性對照組（LPS 1 μg/mL），繼續培養24 h，吸取細胞懸液至新的無菌管中，離心收集細胞，每管加1 mL RNA提取液（Trizol），吹打細胞至完全裂解后靜置5 min。按照5∶1的比例加入200 μL氯仿后混勻靜置3 min，4℃ 12 000 r/min離心15 min，取上層無色水相并加入等體積的異丙醇，顛倒混勻沉淀15 min，離心棄上清。加入1 mL 75%乙醇洗滌，4℃ 12 000 r/min離心5 min，棄上清后離心管倒置晾干，加入20 μL無菌水使其充分溶解得到總RNA。按照反轉錄試劑盒說明書，將總RNA反轉錄成cDNA，進行qPCR檢測，根據2-△△Ct相對定量法計算目的基因的相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.10 SEP-0a對巨噬細胞NF-κB信號通路相關蛋白表達的影響 采用Western blot法［20］檢測SEP-0a對巨噬細胞NF-κB通路蛋白表達的影響。將RAW264.7細胞（1×106個/孔）接種于6孔板，在含有5%二氧化碳恒溫（37℃）培養箱中培養23 h，棄去上清，按要求加入BAY11-7082和DMEM基礎培養液后培養1 h，棄去上清，設置8個實驗組，其中分別為空白對照組（DMEM基礎培養液）、陽性對照組（LPS 1 μg/mL）、SEP-0a不同濃度給藥組（50、100、500、1 500 μg/mL）、500 μg/mL SEP-0a（加入10 μmol/L BAY11-7082孵育過的一組）、抑制劑組（10 μmol/L BAY11-7082孵育過的另一組與DMEM基礎培養液），繼續培養24 h，棄上清，PBS重復洗滌兩次，將細胞懸液轉移至離心管中，離心5 min，4℃ 1 200 r/min，棄去PBS，向離心管內加入RIPA裂解液3-5 min。裂解時間為30 min，此操作在冰上進行，離心10 min，條件為4℃ 12 000 r/min，上清為總蛋白溶液。

BCA法定量蛋白，加入5×上樣緩沖液，進行15 min沸水浴，-20℃保存備用。蛋白樣品進行SDSPAGE電泳，電轉移至PVDF膜。加入5%脫脂牛奶后將其室溫封閉30 min，加入一抗（1∶1 000），4℃孵育搖床過夜。TBST中脫色搖床快速洗脫5 min，一共洗脫3次，加入二抗（1∶5 000），室溫慢搖30 min，TBST中脫色搖床快速洗脫5 min，一共洗脫3次。采用ECL化學發光法檢測目的條帶的信號強度，曝光條件要根據不同的發光強度進行調整，保存成像。

1.2.11 SEP-0a對巨噬細胞在使用NF-κB特異阻斷劑后的促進作用 取濃度為2.5×105個/mL的RAW264.7細胞接種于96孔板，在含有5%二氧化碳恒溫（37℃）培養箱中培養12 h，棄去上清，設置4個實驗組，其中兩組加入用基礎培養液稀釋為10 μmol/L的BAY11-7082 100 μL，剩余兩組分別加入100 mL DMEM基礎培養，在含有5%二氧化碳恒溫（37℃）培養箱中孵育培養1 h，取出后棄去上清，其中加入BAY11-7082組在棄去上清以后，一組加入SEP-0a 500 μg/mL，一組加入DMEM基礎培養液，剩余兩組也分別加入DMEM基礎培養液與500 μg/mL SEP-0a，放回培養箱繼續培養24 h后，吸取上清于無菌離心管中，在2 500 r/min下離心20 min。NO檢測方法同1.2.7，細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的檢測方法同1.2.8，NO、TNF-α、IL-1β、IL-6基因檢測方法同1.2.9，引物序列見表2。

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

2 結果

2.1 元蘑多糖分離純化

采用DEAE-52離子交換層析對元蘑多糖SEP進行分離純化。如圖1-A所示，經過蒸餾水、0.1 mol/L NaCl、0.3 mol/L NaCl洗脫后，得到3個多糖組分，收集含量最高的水洗多糖組分并命名為SEP-0。

圖1 元蘑多糖洗脫曲線Fig. 1 Elution curve of S. edulis polysaccharide

進一步利用Sephacryl S-400葡聚糖凝膠過濾層析對元蘑多糖SEP-0進一步純化得到多糖組分SEP-0a，洗脫曲線如圖1-B所示，SEP-0a為單一對稱峰。

2.2 理化性質測定

成分測定結果表明，元蘑多糖SEP-0a中總糖含量為81.67%，未檢測到蛋白質含量。

采用HPGPC-ELSD法對元蘑多糖SEP-0a的分子量進行檢測。如圖2所示，SEP-0a分子量洗脫峰為單一對稱峰，表明其為均一多糖組分。按照標準曲線（y=-0.162 6x+7.407 9，R2=0.995 9）計算得到SEP-0a的相對分子量為4.23×104Da。

圖2 SEP-0a高效凝膠滲透色譜洗脫曲線Fig. 2 Elution curve of SEP-0a high performance gel permeation chromatography

采用IEC-HPLC法對元蘑多糖SEP-0a的單糖組成進行檢測。結果如圖3所示，元蘑多糖SEP-0a主要由半乳糖（Gal）、甘露糖（Man）、葡萄糖（Glc）和巖藻糖（Fuc）組成，其摩爾百分比為48.27∶26.02∶16.26∶9.03。

圖3 SEP-0a離子色譜圖Fig. 3 SEP-0a ion chromatogram

2.3 傅里葉變換紅外光譜分析

進一步采用傅里葉變換紅外光譜檢測元蘑多糖SEP-0a的結構，結果如圖4所示，3 388 cm-1處有信號峰的出現，這是因為O-H的伸縮振動；在2 929 cm-1周圍的吸收峰是C-H的伸縮振動；吸收峰出現在1 353 cm-1、1 147 cm-1和1 074 cm-1，這意味著SEP-0a含有吡喃糖環；β-D-吡喃糖的特征吸收峰在872 cm-1處表示；因為802 cm-1和附近存在吸收峰，所以還證明了α構型的存在。

圖4 SEP-0a紅外光譜圖Fig. 4 Infrared spectrum of SEP-0a

2.4 SEP-0a對巨噬細胞增殖的影響

采用CCK-8法檢測SEP-0a對RAW264.7細胞增殖的影響，結果如圖5所示，隨著SEP-0a濃度不斷增加，其細胞增殖率也逐漸提高，并且具有一定的濃度依賴性。當SEP-0a濃度在100-1 500 μg/mL的范圍時，與空白組相比差異極顯著（P＜0.01），說明SEP-0a可以增強巨噬細胞的增殖能力。

圖5 不同濃度SEP-0a對RAW264.7細胞增殖的影響Fig. 5 Effects of SEP-0a at different concentrations on the proliferation of RAW264.7 cells

2.5 SEP-0a對巨噬細胞吞噬作用的影響

采用中性紅法檢測SEP-0a對RAW264.7細胞吞噬作用的影響，結果如圖6所示，隨著SEP-0a濃度的增加，其吸光度值也逐漸增強，并且具有一定的濃度依賴性。當SEP-0a濃度為500-1 500 μg/mL時，與空白組相比有極顯著差異（P＜0.01）。這表明SEP-0a可以增強巨噬細胞的吞噬能力。

圖6 不同濃度SEP-0a對RAW264.7細胞吞噬作用的影響Fig. 6 Effects of SEP-0a at different concentrations on the phagocytosis of RAW264.7 cells

2.6 SEP-0a對巨噬細胞產生ROS的影響

采用2',7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA）熒光探針法檢測SEP-0a對RAW264.7巨噬細胞產生ROS的影響，結果如圖7所示，隨著SEP-0a濃度的不斷升高，熒光強度逐漸增強，且具有一定的濃度依賴性，當SEP-0a濃度范圍在500-1 500 μg/mL時，與空白組相比有極顯著差異（P＜0.01），說明其可促進RAW264.7細胞產生ROS。

圖7 不同濃度SEP-0a對RAW264.7細胞分泌ROS的影響Fig. 7 Effects of SEP-0a at different concentrations on the ROS secretion of RAW264.7 cells

2.7 SEP-0a對巨噬細胞分泌NO影響

采用一氧化氮法檢測SEP-0a對RAW264.7細胞分泌NO影響。結果如圖8所示，NO的含量隨著SEP-0a濃度的增加而提高，并與空白組相比，差異極顯著（P＜0.01），具有一定的濃度依賴性，這表明SEP-0a能提高RAW264.7細胞分泌NO的能力。

圖8 不同濃度SEP-0a對RAW264.7細胞分泌NO的影響Fig. 8 Effects of SEP-0a at different concentrations on NO secretion by RAW264.7 cells

2.8 SEP-0a對巨噬細胞分泌TNF-α、IL-1β以及IL-6的影響

采用ELISA法檢測SEP-0a對RAW264.7細胞分泌TNF-α、IL-1β以及IL-6的影響。結果如圖9所示，隨著SEP-0a濃度梯度不斷增加，TNF-α、IL-1β和IL-6的含量也逐漸提高，有一定的濃度依賴性。當濃度為100-1 500 μg/mL時，與空白組相比TNF-α與IL-6含量顯著增加（P＜0.01）；而當濃度為500-1 500 μg/mL時，與空白組相比IL-1β含量顯著提高，具有極顯著性差異（P＜0.01），說明SEP-0a可促進RAW264.7細胞分泌TNF-α、IL-1β和IL-6。

圖9 不同濃度SEP-0a對RAW264.7細胞分泌TNF-α（A）、IL-1β（B）、IL-6（C）的影響Fig. 9 Effects of SEP-0a at different concentrations on TNF-α（A）, IL-1β（B）and IL-6（C）secretion by RAW264.7 cells

2.9 SEP-0a對巨噬細胞中TNF-α、IL-1β以及IL-6基因表達的影響

采用qPCR法檢測SEP-0a對RAW264.7細胞TNF-α、IL-1β以及IL-6基因表達的影響。結果如圖10所示，隨著SEP-0a濃度梯度不斷增加，TNF-α、IL-1β和IL-6的基因表達量也顯著增高，與空白組相比，差異極顯著（P＜0.01）,有一定的濃度依賴性。說明SEP-0a可以促進巨噬細胞內TNF-α、IL-1β和IL-6基因的表達，與ELISA結果一致。

2.10 SEP-0a對巨噬細胞NF-κB信號通路相關蛋白表達的影響

NF-κB是一種重要的核轉錄因子，可以快速激活巨噬細胞，刺激轉錄系統，導致主要趨化因子、細胞因子和炎癥介質的瞬時表達［21］。它是Rel家族中蛋白質異源或同源二聚化形成的重要轉錄因子之一，包括NF-εB1（也稱為p50）、NF-ωB2（也稱為p52）和RelA（也稱為p65），其中p65是最為常見的形式，p65蛋白表達上調證明NF-κB通路被激活［22-23］。本研究進一步采用Western blot法考察了SEP-0a對巨噬RAW264.7細胞NF-κB通路蛋白表達的影響，實驗結果如圖11所示，隨著SEP-0a濃度梯度增加，對RAW264.7細胞NF-κB信號通路p-p65蛋白表達上調越明顯，具有一定的濃度依賴性，差異極顯著（P＜0.01）。但是在加入BAY11-7082抑制劑后，p-p65蛋白表達則會明顯下調。該實驗結果進一步證實SEP-0a能夠通過NF-κB信號通路調控巨噬細胞免疫功能。

圖11 SEP-0a對RAW264.7細胞蛋白磷酸化的影響Fig. 11 Effects of SEP-0a on protein phosphorylation in RAW264.7 cells

2.11 SEP-0a對巨噬細胞在使用NF-κB特異阻斷劑后的促進作用

BAY11-7082是一種NF-κB的特異性阻斷劑，采用通路阻斷法初步研究SEP-0a對RAW264.7細胞的免疫調節作用。結果如圖12，RAW264.7細胞經BAY11-7082抑制劑與SEP-0a共同作用下，與SEP-0a組比，其NO、TNF-α、IL-1β和IL-6的表達量顯著下降（P＜0.01），這說明BAY11-7082抑制劑阻斷了SEP-0a刺激RAW264.7細胞NO、TNF-α、IL-1β和IL-6的表達。

圖12 NF-κB抑制劑對SEP-0a誘導RAW264.7分泌NO（A）、TNF-α（B）、IL-1β（C）和IL-6（D）的影響Fig. 12 Effects of NF-κB inhibitors on the secretions of NO（A）, TNF-α（B）, IL-1β（C）and IL-6（D）induced by SEP-0a in RAW264.7 cells

基因表達變化數據如圖13，RAW264.7細胞經BAY11-7082抑制劑與SEP-0a共同作用下，與SEP-0a組比，其NO、TNF-α、IL-1β和IL-6的基因表達明顯減弱（P＜0.01），與ELISA結果一致。進一步說明SEP-0a可以激活NF-κB信號通路從而發揮免疫調節作用。

圖13 NF-κB抑制劑對SEP-0a誘導RAW264.7中NO（A）、TNF-α（B）、IL-1β（C）和IL-6（D）基因表達的影響Fig. 13 Effects of NF-κB inhibitors on SEP-0a on the gene expressions of NO（A）, TNF-α（B）, IL-1β（C）and IL-6（D）by RAW264.7 cells

3 討論

多糖的相對分子質量、單糖組成等與它的生物活性緊密相關［24］。Li等［25］對元蘑多糖NTHSP進行分離純化，檢測其結構組成發現NTHSP是分子量為1.19×103-1.55×104Da，并且由阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成的一種具有高分支結構的葡聚糖。Li等［26］研究元蘑多糖結構，結果得到元蘑多糖HW-HSP分子量分布為3.87×104-4.62×106Da，并且由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖和核糖5種單糖組成，含有O-H、C-H以及吡喃糖環等。本研究獲得的元蘑多糖SEP-0a主要由半乳糖、甘露糖、葡萄糖和巖藻糖組成，相對分子量為4.23×104Da，并且具有α構型與β構型，與其他元蘑多糖相比，其單糖組成及分子量分布均不相同，因此，推測本研究發現的SEP-0a可能是一種新的元蘑多糖。

巨噬細胞對于機體免疫系統來說十分重要，可以分泌ROS、NO、TNF-α、IL-1β和IL-6等，具有調節免疫、抑制癌細胞增殖等作用［27］。ROS可以氧化細胞脂質，使蛋白質失活，并殺傷病原微生物及自身異常細胞［28］。NO是重要的活性介質，對病毒及癌細胞等的免疫應答有著抑制和殺傷作用，從而使免疫能力得到提高［29］。TNF-α可以激活中性粒細胞和淋巴細胞，并促進其他細胞因子的合成和釋放［30］；IL-1β常大量產生在炎癥初期階段，其可以對局部進行激活，同時也是繼發性炎癥介質產生的誘因之一［31］；IL-6作為十分重要的促炎細胞因子，可以誘導B細胞的分化以及T細胞增殖分化，影響抗體的產生，參與機體免疫應答［32］。研究發現，真菌多糖具有較好的免疫活性。苗月等［33］發現蛹蟲草多糖可以增強巨噬細胞的吞噬活性，促進NO和IL-1β的分泌，調節小鼠巨噬細胞RAW264.7免疫活性。Ren等［34］發現可以刺激RAW264.7產生NO、IL-6和TNF-α并且增強它們的活性從而調節其對RAW264.7巨噬細胞的潛在免疫活性。郝正祺等［35］發現繡球菌子實體多糖能夠提高巨噬細胞內TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-3、IL-10、IFN-β免疫因子mRNA的表達量。本研究考察了元蘑多糖組分SEP-0a對巨噬細胞RAW264.7的體外免疫調節活性，并發現經過元蘑多糖SEP-0a給藥后，RAW264.7細胞的增殖與吞噬能力顯著提高，并且可以增強ROS和NO的分泌，提高TNF-α、IL-1β和IL-6的表達，均具有劑量依賴性。說明本研究報道的元蘑多糖SEP-0a對巨噬細胞RAW264.7具有較強免疫調節活性。

NF-κB可以通過快速調節細胞內基因的表達來調節某些生理和病理過程，作為核轉錄因子，它很容易被激活，從而誘導信號級聯反應的發生，進行核轉位，啟動下游基因的轉錄，促進蛋白的表達及炎癥相關因子的合成與分泌［36-37］。其中p65是NF-κB信號通路中最常見的形式，它在NF-κB通路中的表達通常與局部或全身的細胞炎癥反應呈正相關，因此p65蛋白表達上調可以證明NF-κB信號通路被激活［38］。Liao等［39］發現竹蓀多糖可以通過MAPK/NF-κB信號通路來調節NO和TNF-α等活性因子的分泌，從而發揮免疫調節作用。Wang等［40］發現NF-κB通路參與了黑虎掌菌誘導的RAW264.7細胞活化，經過NF-κB信號通路的抑制劑BAY11-7082處理后，其誘導RAW264.7細胞所分泌NO和TNF-α的能力被有效抑制。本研究發現，SEP-0a可以使NF-κB信號通路中p65蛋白磷酸化的表達被明顯上調，但是在加入NF-κB特異阻斷劑BAY11-7082后，NF-κB信號通路中p65蛋白的高表達則被抑制。同時，使用BAY11-7082與SEP-0a共同處理后，與SEP-0a組比其NO、TNF-α、IL-1β以及IL-6的表達量均明顯降低。這些結果進一步證實，元蘑多糖SEP-0a能夠通過NF-κB信號通路發揮巨噬細胞的免疫調節功能。

4 結論

本研究通過分離純化從元蘑中獲得一種新的均一多糖組分SEP-0a，該多糖主要由半乳糖、甘露糖、葡萄糖和巖藻糖組成，相對分子量為4.23×104Da，并且具有α構型與β構型。體外細胞實驗證明SEP-0a可以通過NF-κB信號通路，提高巨噬細胞的增殖和吞噬能力，并增強ROS與NO的分泌，以及TNF-α、IL-1β和IL-6的表達，進而發揮免疫調節作用。