定點(diǎn)飽和突變提高赭曲霉11α羥化酶的催化性能

史京輝 陳文慧 陸坤 鄭婷婷 任志遠(yuǎn) 鮑國(guó)慶 王敏 駱健美

（工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（天津科技大學(xué)），天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津市微生物代謝與發(fā)酵過(guò)程控制技術(shù)工程中心，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

11α,17α-雙羥基黃體酮（11α,17α-dihydroxy progesterone）俗稱脫溴物，是許多重要甾體藥物合成過(guò)程中的中間體［1］，如潑尼松龍、醋酸潑尼松龍、可的松、氫化可的松等［2］。這些藥物具有提高免疫力、抗炎、抗凝血等作用［3-6］。與化學(xué)合成法相比，微生物轉(zhuǎn)化法不僅具有合成步驟少、生產(chǎn)周期短、副產(chǎn)物少、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好等特點(diǎn)，而且具有高度的立體選擇性和區(qū)域選擇性，能對(duì)甾體藥物母核上化學(xué)合成法難以或無(wú)法實(shí)現(xiàn)的位點(diǎn)引入特定官能團(tuán)［7-10］。2022年，天津科技大學(xué)駱健美團(tuán)隊(duì)［11］考察了不同微生物對(duì)17α-羥基黃體酮轉(zhuǎn)化生成11α，17α-雙羥基黃體酮能力的影響，結(jié)果表明赭曲霉（Aspergillus ochraceus）、雅致小克銀漢霉（Cunningpamycetes elegans）、藍(lán)色犁頭霉（Absidia coerulea）、球孢白僵菌（Beauveria bassiana）、金龜子綠僵菌（Metarhizium anisopliae）和黑曲霉（Aspergillus niger）均具有良好的轉(zhuǎn)化能力，其中，赭曲霉的轉(zhuǎn)化效果最好。

甾體11α羥化酶（11α-hydroxylase）屬于細(xì)胞色素P450酶（CYP）超家族［12-13］，主要包括胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和輔基血紅素（heme）。其中，heme堆疊在I和L螺旋之間，位于相對(duì)較大的口袋中，通過(guò)與近端半胱氨酸殘基結(jié)合的硫醇鐵（Fe-thiolate）的配位結(jié)合連接到蛋白質(zhì)骨架上，周圍有疏水性氨基酸殘基以容納疏水性底物［14］。近年來(lái)，研究者將不同來(lái)源11α羥化酶基因在大腸桿菌（Escherichia coli）［15］、恥垢分枝桿菌（Mycolicibacterium smegmatis）［16］、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）［17］和畢赤酵母（Pichia pastoris）［18］中異源表達(dá)并進(jìn)行功能驗(yàn)證，但關(guān)于羥化酶關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)及其分子改造的報(bào)道較少。

大量研究表明，關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)對(duì)甾體羥化酶的選擇性和活性產(chǎn)生顯著的影響。2022年，天津科技大學(xué)劉曉光團(tuán)隊(duì)［19］通過(guò)敲除實(shí)驗(yàn)證明，赭曲霉CICC 41473的11α羥化酶CYP68J5是負(fù)責(zé)催化黃體酮和左旋乙基甾烯二酮發(fā)生11α羥化反應(yīng)的關(guān)鍵酶。之后，基于CYP68J5與睡蓮炭疽病菌（Colletotrichum nymphaeae）和西蒙氏炭疽病菌（Colletotrichum simmondsii）來(lái)源的CYP的序列一致性比對(duì)（分別為52.01%和50.91%），對(duì)3個(gè)氨基酸保守位點(diǎn)V64、E65和N66進(jìn)行定點(diǎn)飽和突變。結(jié)果表明，突變體V64K對(duì)黃體酮的11α羥基化選擇性達(dá)高達(dá)90.6%，而對(duì)左旋乙基甾烯二酮的11α羥基化選擇性幾乎完全喪失，說(shuō)明CYP68J5的V64位點(diǎn)在兩種底物的11α羥基化反應(yīng)選擇性上發(fā)揮著完全不同的作用［20］。2023年，沈陽(yáng)藥科大學(xué)田威團(tuán)隊(duì)［21］通過(guò)分子對(duì)接，確定了球黑孢霉（Nigrospora sphaerica）羥化酶CYP-N2中與底物結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)分別為F120、A124、T128、S140、V312和T316，對(duì)其進(jìn)行丙氨酸掃描發(fā)現(xiàn)，突變體T316A對(duì)甲地孕酮、黃體酮、可的松和去氫表雄酮幾乎沒(méi)有活性，說(shuō)明T316位點(diǎn)是CYP-N2催化4種底物的關(guān)鍵位點(diǎn)。而突變體T128A對(duì)甲地孕酮和可的松的活性分別提升了19.3%和10.4%，對(duì)去氫表雄酮的活性幾乎不變，對(duì)黃體酮的活性降低了15.1%，突變體F120A、S140A和V312A對(duì)上述4種底物的活性均有不同程度的改變。這些結(jié)果說(shuō)明，對(duì)于CYP-N2，同一個(gè)位點(diǎn)對(duì)不同底物表現(xiàn)出不同的活性。

課題組前期通過(guò)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、分子對(duì)接以及丙氨酸掃描等手段，確定了赭曲霉CICC 41473的11α羥化酶CYP68J5的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)為D118、F216、M488［11］。本研究在此基礎(chǔ)上對(duì)3個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)飽和突變，篩選出催化性能優(yōu)良的突變體，并通過(guò)分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬闡明其活性提高的分子機(jī)制。研究結(jié)果對(duì)羥化酶CYP68J5的遺傳改造和11α,17α-雙羥基黃體酮的生產(chǎn)具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒 菌株：赭曲霉CICC 41473、大腸桿菌DH5α、釀酒酵母INVSc1。質(zhì)粒：pYES2-cyp68j5。以上材料均由實(shí)驗(yàn)室自主保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉10，pH 7.5，ddH2O定容至1 L。固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉20。YEPD培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨20，酵母提取物10，ddH2O定容至900 mL。121℃，20 min滅菌后補(bǔ)加20%葡萄糖100 mL，固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉20。Ura營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基（g/L）：YNB 6.7，加入ddH2O定容至900 mL。121℃，20 min滅菌后補(bǔ)加20%葡萄糖100 mL、DO Supplement-Ura 1.29，固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉20。

1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)材料 本實(shí)驗(yàn)所用引物（表1），蘇州金唯智生物科技有限公司。DNA瓊脂糖凝膠回試劑盒、細(xì)菌質(zhì)粒提取試劑盒、酵母質(zhì)粒提取試劑盒，天根（北京）生化科技有限公司。核酸限制性內(nèi)切酶、T4連接酶，大連TaKaRa公司。KOD-Plus-Neo突變?cè)噭┖校瑬|洋紡（上海）生物科技有限公司。17α-羥基黃體酮、11α，17α-雙羥基黃體酮，天津市津津藥業(yè)有限公司（中國(guó)）。一次性無(wú)菌接種環(huán)，湖南比曼克生物科技有限公司。

表1 飽和突變的PCR引物Table 1 PCR primers for the saturated mutation

1.1.4 主要儀器設(shè)備 PCR基因擴(kuò)增儀、小型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司。電泳儀，北京市六一儀器廠。紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，島津儀器（蘇州）有限公司。電熱恒溫水浴桶，河北黃華市航空儀器廠。Agilent高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent公司。

1.2 方法

1.2.1 釀酒酵母的培養(yǎng) 單菌落培養(yǎng)：用一次性無(wú)菌接種環(huán)從YEPD平板上長(zhǎng)出的單菌落上挑取少量菌體，將其在新的YEPD固體平板上均勻涂成約1 cm2的方塊（patch），30℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)1-2 d，觀察方塊范圍內(nèi)涂抹的菌體生長(zhǎng)情況。過(guò)夜培養(yǎng)：用一次性無(wú)菌接種環(huán)從任意一個(gè)目的patch上挑取大頭針頭大小的菌體，將其接種在裝有5 mL的YEPD液體培養(yǎng)基的試管中，在30℃恒溫?fù)u床中220 r/min培養(yǎng)12-16 h。

1.2.2 羥化酶CYP68J5的飽和突變

1.2.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 以課題組前期構(gòu)建的pYES2-cyp68j5質(zhì)粒為模板，采用反向PCR進(jìn)行擴(kuò)增。采用簡(jiǎn)并密碼子NNK設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，如表1所示。所有引物均由金唯智生物技術(shù)服務(wù)公司合成并使用tPAGE純化方式純化。

反向PCR擴(kuò)增條件：94℃ 2 min，98℃ 10 s，Tm-5℃ 30 s，68℃ 7.4 min，共20個(gè)循環(huán)，4℃保溫。

PCR產(chǎn)物用Dpn I限制性內(nèi)切酶在37℃下酶切4 h以去除未突變的模板質(zhì)粒，參考KOD-Plus突變?cè)噭┖姓f(shuō)明書(shū)，使用T4多聚核苷酸激酶和連接酶對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行自身環(huán)化連接反應(yīng)（16℃，16 h）。連接后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，復(fù)蘇后的菌液均勻涂布于含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑選轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒送樣測(cè)序，將突變正確的質(zhì)粒保存并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2.2 重組菌株的構(gòu)建 將驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒通過(guò)醋酸鋰法導(dǎo)入釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞，具體構(gòu)建過(guò)程參照Invitrogen公司操作手冊(cè)。

1.2.3 底物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) 用一次性無(wú)菌接種環(huán)從做patch的YEPD平板上刮取一環(huán)菌體至裝有50 mL YEPD液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在30℃，200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24 h后分別加入0.5 g/L和2.0 g/L的底物17α-羥基黃體酮（甲醇助溶，底物∶甲醇=1∶20（mg∶μL）），并投加3.75 mL濃度為20%半乳糖溶液進(jìn)行誘導(dǎo)（終濃度為1.5%），每24 h補(bǔ)加1次。在30℃，220 r/min條件下轉(zhuǎn)化84 h，每12 h取樣檢測(cè)。取樣時(shí)，將1.0 mL的發(fā)酵液加至2 mL離心管中，加入1.0 mL乙酸乙酯終止轉(zhuǎn)化反應(yīng)。用超聲清洗儀超聲萃取20 min，吸取萃取后的上層溶液200 μL于1.5 mL離心管中，13 000 r/min離心10 min后的上清液用于后續(xù)定量檢測(cè)。

1.2.4 甾體化合物的檢測(cè)

1.2.4.1 薄層色譜法（TLC） 使用移液槍將上清液點(diǎn)在薄層硅膠GF254板上，點(diǎn)樣量為2 μL，點(diǎn)樣的直徑不能大于2 mm，點(diǎn)樣樣品間隔至少為0.6 cm，樣點(diǎn)與硅膠板邊沿間隔至少1 cm；再將硅膠板樣品放到盛有展開(kāi)劑的層析缸中進(jìn)行層析，展開(kāi)劑的配比為：正己烷∶丙酮∶乙酸乙酯=1.4∶1∶0.5（V/V/V）。待溶劑前沿與硅膠薄板上邊緣的距離約為1 cm時(shí)層析完畢，取出硅膠板揮干。最后將硅膠板放在254 nm紫外燈下觀察斑點(diǎn)。

1.2.4.2 高效液相色譜法（HPLC） 吸取200 μL上清液于離心管中，放在通風(fēng)櫥中自然揮干，然后加入1 mL流動(dòng)相進(jìn)行復(fù)溶［22］。超聲清洗儀超聲20 min，13 000 r/min離心10 min后取上清液300 μL用于HPLC檢測(cè)。具體條件為：Agela C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇∶水=80∶20（V/V），流速為1 mL/min。檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。柱溫為35℃。通過(guò)比較標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中底物和目標(biāo)產(chǎn)物的保留時(shí)間和峰面積進(jìn)行定性和定量分析，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用峰面積計(jì)算樣品中底物和產(chǎn)物的濃度。

生產(chǎn)強(qiáng)度是指一定時(shí)間內(nèi)單位發(fā)酵罐容積所產(chǎn)生的產(chǎn)物量。根據(jù)HPLC檢測(cè)結(jié)果，按照公式（式1和式2）計(jì)算摩爾產(chǎn)率和生產(chǎn)強(qiáng)度。

1.2.5 分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬

使用AlphaFold 2對(duì)CYP68J5進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，ChemDraw軟件畫(huà)出底物17α-羥基黃體酮的結(jié)構(gòu)式，通過(guò)AutoDock Tools軟件（http://autodock.scripps.edu/resources/adt）對(duì)CYP68J5及其突變體與底物17α-羥基黃體酮進(jìn)行分子對(duì)接。結(jié)合PyMOL（https://www.pymol.org）生成詳細(xì)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)圖。采用GROMACS 5.0.2軟件和AMBE99SB力場(chǎng)進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬（molecular dynamic simulation，MD）。具體方法如下：將底物17α-羥基黃體酮與羥化酶CYP68J5和最優(yōu)突變體的復(fù)合物分別放入一個(gè)10 nm3的立方體盒子中，采用TIP3P水模型，設(shè)置溶質(zhì)-盒子的距離為10 ?，為了平衡系統(tǒng)中的電荷，一部分水分子被相同數(shù)量的負(fù)離子（Cl-）和正離子（Na+）取代，根據(jù)pH 7.0設(shè)置殘基的質(zhì)子化狀態(tài)，使用最速下降算法執(zhí)行10 000步的能量最小化步驟，通過(guò)指定模擬系統(tǒng)中每個(gè)原子的初始速度不同，在溫度（300 K）和大氣壓（1.01 bar）等參數(shù)下進(jìn)行50 ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬，基于GROMACS的MM/PBSA算法對(duì)分子動(dòng)力學(xué)模擬軌跡，按照公式（式3）［23］計(jì)算結(jié)合自由能，并進(jìn)行能量拆解分析。

2 結(jié)果

2.1 優(yōu)良突變體的篩選

課題組前期借助結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、分子對(duì)接和丙氨酸掃描等手段確定了CYP68J5的3個(gè)關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)分別是第118位的天冬氨酸、第216位的苯丙氨酸和第488位的甲硫氨酸（圖1）。因此，本文選擇上述3個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)飽和突變。

圖1 CYP68J5與底物對(duì)接結(jié)構(gòu)中D118V、F216和M488三個(gè)位點(diǎn)的分布情況Fig. 1 Distribution of the D118V, F216 and M488 in the docking structure of CYP68J5 with substrate

通過(guò)定點(diǎn)飽和突變共獲得54個(gè)CYP68J5的突變體。通過(guò)底物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，考察不同突變體對(duì)17α-羥基黃體酮的轉(zhuǎn)化性能，由TLC結(jié)果可知，突變體D118V的轉(zhuǎn)化性能最好，M488W次之，而突變體F216W、M488L的轉(zhuǎn)化能力較弱，其余突變體的轉(zhuǎn)化性能顯著降低甚至完全喪失（圖2）。

對(duì)上述4個(gè)突變體D118V、F216W、M488L和M488W的轉(zhuǎn)化液進(jìn)行HPLC分析。如圖3-A所示，底物濃度為0.5 g/L時(shí)，CYP68J5的產(chǎn)物濃度在72 h達(dá)到最大值，為434.50 mg/L。而突變體D118V的產(chǎn)物濃度在24 h達(dá)到最大值，為452.56 mg/L。該水平較野生型CYP68J5有所提升，且達(dá)到的時(shí)間縮短了66.70%。如圖3-B可知，突變體D118V的生產(chǎn)強(qiáng)度為431.66 mg/（L·d），較野生型CYP68J5（138.15 mg/（L·d））提高了2.12倍。而其他3個(gè)突變體M488W、F216W和M488L的產(chǎn)物濃度和生長(zhǎng)強(qiáng)度均低于野生型CYP68J5。

圖3 表達(dá)CYP68J5及其突變體D118V、F216W、M488L和M488W的釀酒酵母在0.5 g/L底物濃度（A, B）和2.0 g/L底物濃度（C, D）的產(chǎn)物生成曲線和生產(chǎn)強(qiáng)度Fig. 3 S. cerevisiae expressing CYP68J5 and its mutants D118V, F216W, M488L, and M488W at 0.5 g/L substrate concentration product formation curves and production intensities（A, B）and 2.0 g/L substrate concentration（C, D）

對(duì)于在底物濃度為0.5 g/L時(shí)轉(zhuǎn)化性能最優(yōu)的突變體，進(jìn)一步探究其在底物濃度為2.0 g/L時(shí)的轉(zhuǎn)化性能。如圖3-C所示，底物濃度的增加使產(chǎn)物達(dá)到峰值的時(shí)間往后推遲了12 h，但產(chǎn)物的最大生成量提高了1.63倍。其中，突變體D118V產(chǎn)物濃度在36 h達(dá)到最大值，為1.19 g/L，而野生型CYP68J5的產(chǎn)物濃度在84 h達(dá)到最大值，為1.02 g/L。突變體D118V的生產(chǎn)強(qiáng)度（758.15 mg/（L·d））比野生型CYP68J5（277.94 mg/（L·d））提高了1.72倍（圖3-D）。

2.2 CYP68J5及突變體與底物的分子對(duì)接分析

使用AutoDock對(duì)CYP68J5及突變體D118V、F216W、M488L和M488W與底物進(jìn)行分子對(duì)接，并通過(guò)Discovery Studio軟件展示了分子對(duì)接獲得的復(fù)合物的分子間相互作用力。

如圖4所示，CYP68J5和最優(yōu)突變體D118V的V304位點(diǎn)與底物之間具有C-H鍵，R223位點(diǎn)和heme與底物之間形成氫鍵，W89、F111、L368和heme與底物之間具有疏水作用力。但值得注意的是，D118V還存在V118與底物之間的疏水作用，這是由于第118位的極性的天冬氨酸突變?yōu)榉菢O性的疏水性纈氨酸，使得底物結(jié)合口袋的整體疏水作用增強(qiáng)，可以更好地結(jié)合和穩(wěn)定疏水性的底物，導(dǎo)致酶的催化性能顯著提高。

圖4 使用Discovery Studio繪制的CYP68J5及其突變體D118V、F216W、M488L和M488W殘基和血紅素（heme）與底物的分子間相互作用2D圖Fig. 4 2D plot of the intermolecular interactions of CYP68J5 and its the mutant D118V, F216W, M488L,and M488W residues and heme with substrates using Discovery Studio

與CYP68J5相比，突變體M488W和M488L的活性下降，這可能是因?yàn)槎咧淮嬖趆eme與底物之間的疏水作用，而heme與底物之間的氫鍵作用力消失。突變體M488L的V304位點(diǎn)與底物之間沒(méi)有形成C-H鍵，這可能是其催化性能更低的主要原因。相較于CYP68J5和其他突變體，突變體F216W的heme與底物之間沒(méi)有任何作用力，且V304位點(diǎn)與底物之間也沒(méi)有形成C-H鍵，推測(cè)這些分子間作用力的消失是F216W轉(zhuǎn)化性能最低的主要原因。

綜上所述，V118位點(diǎn)與底物之間形成新的疏水作用力，導(dǎo)致了酶的底物結(jié)合口袋的整體疏水性增強(qiáng)，有利于底物的結(jié)合，是該突變體催化性能提升的主要原因。對(duì)于突變體M488W、M488L和F216W，分子間相互作用力的減少（如heme與底物之間的氫鍵和疏水作用力；V304位點(diǎn)與底物之間的C-H鍵）是酶催化性能降低的主要原因。

2.3 CYP68J5及突變體D118V的分子動(dòng)力學(xué)模擬分析

對(duì)CYP68J5和優(yōu)良突變體D118V分別進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，進(jìn)一步分析催化性能提高的原因。均方根偏差（root-mean-square deviation，RMSD）是蛋白質(zhì)構(gòu)象與原始結(jié)構(gòu)之間的平均偏差，RMSD值越低，說(shuō)明MD模擬過(guò)程中，蛋白結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定。由圖5-A可知，CYP68J5的RMSD在10 ns后基本趨于穩(wěn)定，而突變體D118V的RMSD在15 ns后基本趨于穩(wěn)定，二者的平均值分別為(0.74±0.02) nm和(0.60±0.01) nm。這說(shuō)明D118突變?yōu)閂118后，殘基的改變使整個(gè)11α羥化酶結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。均方根波動(dòng)（root-mean-square fluctuation，RMSF）可以反映模擬過(guò)程中每個(gè)殘基的波動(dòng)情況，表征蛋白質(zhì)的剛性和柔性，RMSF值越高，說(shuō)明殘基的波動(dòng)情況越大，蛋白質(zhì)的柔性越強(qiáng)。如圖5-B所示，CYP68J5和突變體D118V的RMSF平均值分別為(0.27±0.01)nm和(0.18±0.01) nm，突變體D118V大部分殘基的RMSF值低于CYP68J5，表明突變體D118V整體區(qū)域的剛性增強(qiáng)，這與RMSD的結(jié)果是一致的。其中，氨基酸99-103（α螺旋）、115-118（α螺旋）、119-127（loop區(qū)）和251-264（α螺旋）等多處位置表現(xiàn)出更低的RMSF值，這種變化有利于酶和底物的穩(wěn)定結(jié)合，降低底物“脫靶”的敏感性?；剞D(zhuǎn)半徑（radius of gyration，Rg）反映分子中心與原子質(zhì)量的關(guān)系，表征蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的緊密性，Rg值越小說(shuō)明蛋白結(jié)構(gòu)越緊密，反之結(jié)構(gòu)越疏松。如圖5-C所示，CYP68J5和D118V的Rg平均值分別為（2.60±0.01）nm和（2.47±0.01）nm，這表明D118突變?yōu)閂118后，11α羥化酶整體構(gòu)象更穩(wěn)定，這與RMSD和RMSF的結(jié)果是一致的。溶劑可及表面積（solvent-accessible surface area，SASA）是溶劑可接觸的分子表面積，是描述蛋白質(zhì)疏水性的重要參數(shù)，蛋白質(zhì)折疊后SASA值變小，疏水作用增強(qiáng)。如圖5-D所示，CYP68J5和突變體D118V在MD模擬過(guò)程中的SASA平均值分別為（267.02±2.95）nm2和（256.51±2.27）nm2，且在整個(gè)模擬過(guò)程中，D118V的SASA值始終小于CYP68J5，這說(shuō)明D118V比CYP68J5的疏水性更強(qiáng)，這與分子對(duì)接時(shí)發(fā)現(xiàn)突變后產(chǎn)生了新的疏水作用是一致的。氫鍵對(duì)于維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定具有重要作用，如圖5-E所示，突變體D118V氫鍵存在概率明顯大于CYP68J5。結(jié)合自由能（binding free energy）反映蛋白質(zhì)的能量，能量越低，蛋白質(zhì)越穩(wěn)定。采用MM/PBSA方法對(duì)分子動(dòng)力學(xué)模擬軌跡進(jìn)行結(jié)合自由能計(jì)算。如圖5-F所示，突變體D118V的結(jié)合自由能（-24.42±1.18 kcal/mol）低于CYP68J5（-19.81±1.22 kcal/mol），說(shuō)明突變體D118V和底物形成的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。其中，范德華力、靜電作用和非極性溶劑化自由能可以促進(jìn)酶和底物結(jié)合，極性溶劑化自由能對(duì)其具有抑制作用，范德華力、靜電作用和非極性溶劑化的總自由能可以抵消極性溶劑化自由能的不利影響，從而維持這些酶與底物的穩(wěn)定結(jié)合。

圖5 CYP68J5和優(yōu)良突變體D118V的分子動(dòng)力學(xué)模擬Fig. 5 Molecular dynamics simulations of CYP68J5 and its elite mutant D118V

綜上所述，與野生型CYP68J5相比，突變體D118V的RMSD、RMSF和Rg值更低，氫鍵存在的概率增大，說(shuō)明11α羥化酶結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，整體結(jié)構(gòu)的剛性增強(qiáng)，構(gòu)象更加穩(wěn)定，SASA值降低，說(shuō)明突變體的疏水性增強(qiáng)，結(jié)合自由能降低，說(shuō)明突變體與底物形成的復(fù)合物結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，這些變化是酶的催化性能顯著提升的重要原因。

3 討論

目前常見(jiàn)酶的改造方法有定點(diǎn)突變（包括飽和突變）和隨機(jī)突變。其中，基于關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的定點(diǎn)飽和突變技術(shù)，可通過(guò)高質(zhì)量突變體文庫(kù)的構(gòu)建獲得優(yōu)良的突變體。相比于易錯(cuò)率高和突變位點(diǎn)不可控的隨機(jī)突變，具有成本低、效率高等優(yōu)點(diǎn)［24-25］。2020年，南京工業(yè)大學(xué)陳可泉團(tuán)隊(duì)［26］對(duì)赤紅球菌（Rhodococcus ruber）來(lái)源的羥化酶CYP116B3的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)E88、N199和Q209進(jìn)行定點(diǎn)飽和突變，篩選得到的優(yōu)良突變體E88C、N199Q和Q209A，三者轉(zhuǎn)化萘生成α-萘酚的產(chǎn)量比野生型分別提高了2.0、13.0和3.7倍。

本文針對(duì)課題組前期鑒定的3個(gè)關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行了定點(diǎn)飽和突變，結(jié)果表明，118位點(diǎn)極性的親水性天冬氨酸突變?yōu)榉菢O性的疏水性纈氨酸后，酶的催化性能顯著提升；216位點(diǎn)非極性的疏水性苯丙氨酸突變?yōu)榉菢O性的疏水性色氨酸后，酶的催化性能顯著降低；488位點(diǎn)非極性的疏水性甲硫氨酸突變?yōu)榉菢O性的疏水性色氨酸和異亮氨酸后，酶的催化性能發(fā)生不同程度的降低。而上述3個(gè)位點(diǎn)突變成極性氨基酸、酸性氨基酸和堿性氨基酸后，突變體的催化性能幾乎完全喪失。說(shuō)明3個(gè)位點(diǎn)上非極性的疏水性氨基酸（纈氨酸、色氨酸和亮氨酸）對(duì)于酶的催化活性非常重要。

值得注意的是，隨著轉(zhuǎn)化時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)CYP68J5及其突變體的釀酒酵母工程菌株轉(zhuǎn)化底物生成目標(biāo)產(chǎn)物的濃度逐漸下降，推測(cè)可能是目標(biāo)產(chǎn)物逐漸轉(zhuǎn)化為副產(chǎn)物或者分解。類似地，表達(dá)藍(lán)色犁頭霉（Absidia coerulea）來(lái)源的11β羥化酶CYP5311B2的釀酒酵母工程菌株，催化11-脫氧皮質(zhì)醇發(fā)生11β-羥化反應(yīng)的過(guò)程中，除了目標(biāo)產(chǎn)物氫化可的松之外，還會(huì)產(chǎn)生11β-和11α-羥基化衍生物的立體異構(gòu)體混合物，其比例達(dá)到20%［27］。

分子對(duì)接結(jié)果表明，D118V突變之后，疏水性的纈氨酸與底物之間產(chǎn)生疏水作用力，導(dǎo)致酶催化性能顯著提升。而突變體M488W、M488L和F216W的催化性能有不同程度的降低，原因可能是heme與底物之間的氫鍵、疏水作用力和V304位點(diǎn)與底物之間的C-H鍵等分子間相互作用力減少。類似的，古生菌酸熱硫化葉菌（Sulfolobus acidocaldarius）來(lái)源的羥化酶CYP119進(jìn)行改造發(fā)現(xiàn)，5個(gè)突變體由于缺少了heme和T257之間的氫鍵，導(dǎo)致酶的活性顯著降低［28］。

與野生型相比，突變體D118V的115-118（α螺旋）和119-127（loop區(qū)）區(qū)域的剛性顯著提升，蛋白質(zhì)整體結(jié)構(gòu)剛性增強(qiáng)，穩(wěn)定性提高，即纈氨酸可以降低主鏈的結(jié)合熵，導(dǎo)致酶的催化性能提升。2023年，浙江大學(xué)的王健波團(tuán)隊(duì)［29］將巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）來(lái)源的羥化酶P450-BM3位于底物入口通道的D68位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)飽和突變，當(dāng)極性的天冬氨酸突變?yōu)榉菢O性的疏水性纈氨酸后，底物入口通道的寬度由2.6 ?增大為5.3 ?，減小了底物進(jìn)入的空間位阻，從而顯著提升了酶的催化性能顯著提升。2020年，天津科技大學(xué)秦慧明團(tuán)隊(duì)［30］對(duì)賴氨酸羥化酶進(jìn)行改造，獲得的優(yōu)良突變體MT3催化性能顯著提升（kcat/Km值較WT提高了24.97倍），通過(guò)MD模擬發(fā)現(xiàn)，突變后的蛋白構(gòu)象更為開(kāi)放，在相同的模擬時(shí)間內(nèi)，底物可以更深入到結(jié)合口袋中。因此，我們推測(cè)，本文獲得的優(yōu)良突變體D118V催化性能提升也與突變后纈氨酸側(cè)鏈位阻較小，與底物能更深入酶的催化口袋有關(guān)。但是課題組前期研究［11］發(fā)現(xiàn)，突變體D118A不能轉(zhuǎn)化生成11α，17α-雙羥基黃體酮，這可能是突變后的丙氨酸的位阻更小，底物結(jié)合口袋過(guò)大，不能很好地與底物結(jié)合，造成了底物的“脫靶”現(xiàn)象，這些結(jié)果說(shuō)明合適尺寸的底物結(jié)合口袋對(duì)酶的催化性能具有重要作用。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)赭曲霉的羥化酶CYP68J5三個(gè)關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的定點(diǎn)飽和突變，獲得了催化活性提高的優(yōu)良突變體D118V。其在底物濃度為0.5 g/L和2.0 g/L時(shí)的生產(chǎn)強(qiáng)度較野生型分別提高了2.12和1.72倍。分子對(duì)接和分子動(dòng)力模擬發(fā)現(xiàn)，V118位點(diǎn)突變之后與底物之間產(chǎn)生了新的疏水相互作用，酶的整體構(gòu)象更穩(wěn)定以及酶與底物的結(jié)合更緊密，這些變化共同作用提高了酶的催化性能。