沉香葉的鎮痛抗炎作用研究

王三煒,謝言青,金 葉,周志宏,劉 錄

(云南中醫藥大學 云南云中營養與健康研究院,云南 昆明 650500)

《中國藥典》中記載,沉香為瑞香科植物白木香Aquilariasinensis(Lour.)Gilg含有樹脂的木材,具有溫中止嘔,納氣平喘,行氣止痛的功效,多用于胃寒嘔吐呃逆,胸腹脹悶疼痛,腎虛氣逆喘急[1].沉香葉可一年采收兩季,已有研究表明沉香葉也具有抗炎、鎮痛、鎮靜、促進腸推進等生物活性[2],被廣泛用于中醫治療中.市面上也有許多與沉香葉相關的保健茶：沉香葉腎茶,沉香葉保健品等.

據文獻[3-4]報道沉香葉提取物具有顯著的抗炎鎮痛活性,但研究不夠深入,所以本實驗通過痛刺激(熱板法、醋酸扭體)模型和小鼠耳廓腫脹抗炎模型綜合評價沉香葉醇提物的抗炎鎮痛效果,并且初步探討沉香葉鎮痛抗炎的作用機制,為沉香葉的臨床應用提供理論基礎,為沉香葉的產品開發奠定了基礎.

1 材料

沉香葉由云南中醫藥大學楊竹雅教授鑒定為瑞香科沉香屬的白木香 (Aquilariasinensis(Lour.)Gilg)的葉;另取沉香葉粉末 550 g,用12倍量(6 600 mL)的75%乙醇回流提取3次,每次 2 h,合并提取液、減壓蒸餾、真空干燥得到沉香葉醇提物粉末,加生理鹽水配制成低(0.2 g 生藥/mL)、中 (0.4 g 生藥/mL)、高劑量 (0.8 g 生藥/mL).

購買斯貝福(北京)生物科技有限公司提供的SPF昆明級小鼠180只,體重18～22 g,雌雄各半,實驗動物生產許可證號SCXK(京)2019-0010;飼養于云南中醫藥大學動物中心,使用普通小鼠飼料喂養,自由飲水,溫度20～25 ℃,濕度40%～70%.

熱板儀(成都泰盟科技有限公司);電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司);真空干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司);超純水(成都優譜,UPTL-1-20T);氯化鈉注射液(雙鶴藥業批號：210630);雙氯芬酸鈉(Macklin生產,批號：D829756,純度≥99.0%);冰醋酸(風船化學試劑有限公司,批號：20110103);二甲苯(天津化學公司,批號：20080613).小鼠體內藥理實驗所用到的試劑盒：小鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)/48T、小鼠白細胞介素10(IL-10)/48T、小鼠白細胞介素4(IL-4)/48T、小鼠白細胞介素1β(IL-1β)/48T、小鼠前列腺素E2(PGE2)/48T、小鼠β-內啡肽(β-EP)/48T、小鼠緩激肽(BK)/48T均為江蘇酶免實業有限公司.

2 實驗方法

2.1 觀察沉香葉醇提物對小鼠耳腫脹的影響

取體重18～22 g 的健康小鼠50只,雌雄各25只,隨機分組為5組(模型對照組M、陽性對照組Y和沉香葉醇提物低 D、中Z、高劑量組G)每組10只.按模型對照組M(生理鹽水)、沉香葉醇提物低D、中Z、高劑量組G、陽性組(雙氯芬酸鈉/Y)灌胃給藥(體積為 10 mL/kg).末次給藥 1 h 后,給每只小鼠右耳的正反兩面涂抹二甲苯約 20 μL 致炎,左耳作為空白對照,致炎15～20 min 后拖頸處死,用直徑 8 mm 打孔器剪下左右兩圓耳,分別稱重.

左右耳重量之差即為腫脹度.將每組取下的右耳放入EP管中,用ELISA法檢測制備的組織勻漿上清液中的 TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-4 含量.

2.2 觀察沉香葉醇提物對小鼠醋酸扭體的影響

按上述方法與劑量分組、適應給藥、飼養,于末次給藥后 1 h,腹腔注射0.6%冰醋酸生理鹽水(10 mL/kg).注射醋酸后觀察記錄 20 min 內小鼠扭體次數,并計算抑制率[(空白組扭體次數-給藥組扭體次數)/空白組扭體次數×100%].

扭體反應觀察結束后迅速摘取小鼠眼球取血,分離血清,用ELISA法檢測小鼠血清中PGE2、β-EP、BK的含量.

2.3 觀察沉香葉醇提物對小鼠熱板的影響

在(50～55)℃的熱板預選出痛閾值在10～25 s 的雌性小鼠50只,間隔 10 min 重新測定1次,取2次平均痛閾值作為給藥前小鼠的痛閾值.按上述方法與劑量分組、適應給藥、飼養,于末次給藥后測定0.5、1、1.5、2和 2.5 h 的痛閾,記錄并比較各組結果.

3 實驗結果

3.1 沉香葉醇提物對小鼠耳廓腫脹的影響

見表2及圖1,各組涂抹二甲苯之后均會出現紅腫,其中沉香葉醇提物低劑量組(D)、中劑量組(Z)、高劑量組(G)與模型組(M)相比小鼠耳腫脹程度可見明顯減輕,其腫脹度具有統計學意義(P<0.05).

表2 沉香葉醇提物對小鼠二甲苯耳廓腫脹的影響

圖1 小鼠耳廓腫脹度

表3及圖2、3、4、5示,沉香葉醇提物中劑量組(Z)、高劑量組(G)與模型組(M)相比較均能降低小鼠耳組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β的含量,能提高IL-10、IL-4的含量,其中除沉香葉低劑量組(D)與模型組(M)相比,小鼠耳組織中TNF-α的含量差異無統計學意義外,其余所有含量差異具有統計學意義(P<0.05).

表3 沉香葉醇提物對小鼠耳組織中TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-4的含量

圖2 小鼠耳組織中TNF-α含量

圖3 小鼠耳組織中IL-1β含量

圖4 小鼠耳組織中IL-4含量

圖5 小鼠耳組織中IL-10含量

3.2 沉香葉醇提物對小鼠醋酸扭體的影響

0.6%冰醋酸生理鹽水經腹腔注射后,沉香葉醇提物低劑量組(D)、中劑量組(Z)、高劑量組(G)與模型組(M)相比出現扭體反應的時間有一定的延長,且扭體次數也隨著劑量增加而減少,高劑量組的扭體抑制率可達到61.32%.見表3及圖6.

表3 沉香葉醇提物對小鼠醋酸致痛扭體的影響

圖6 小鼠醋酸扭體致痛反應

表4及圖7、8、9示,沉香葉醇提物低劑量組(D)、中劑量組(Z)、高劑量組(G)與模型組(M)相比能降低小鼠血清中PGE2和BK含量和提高β-EP含量,差異具有統計學意義(P<0.05).

表4 沉香葉醇提物對小鼠扭體血清中PGE2、β-EP、BK的含量

圖7 小鼠血清中PGE2的含量

圖8 小鼠血清中β-EP的含量

圖9 小鼠血清中BK的含量

3.3 沉香葉醇提物對小鼠熱板的影響

表5及圖10、11、12、13、14示,沉香葉醇提物低劑量組(D)與模型組(M)比較在 2 h 以前無顯著性差異.沉香葉醇提物中劑量組(Z)、高劑量組(G)都在給藥 1 h 后痛閾值提高,與模型組(M)相比具有統計學意義(P<0.01).

表5 沉香葉醇提物對小鼠熱板痛閾的影響

圖10 小鼠熱板致痛30 min反應

圖11 小鼠熱板致痛60min反應

圖12 小鼠熱板致痛90 min反應

圖13 小鼠熱板致痛120 min反應

圖14 小鼠熱板致痛150 min反應

4 結語

本實驗利用經典痛刺激(熱板法、醋酸扭體)模型和小鼠耳廓腫脹抗炎模型,通過體內實驗對沉香葉的抗炎鎮痛活性進行研究.通過二甲苯致小鼠耳腫脹抗炎模型表明沉香葉醇提物中劑量、高劑量組具有抗炎作用,與模型對照組比,沉香葉醇提物低、中、高劑量對小鼠耳腫脹具有抑制作用,可不同程度的減少小鼠耳組織中的小鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)和小鼠白細胞介素1β(IL-β)的含量(P<0.05),提高小鼠白細胞介素4(IL-4)和小鼠白細胞介素10(IL-10)的含量(P<0.05),推測其作用機制是通過抑制耳組織中的致炎因子TNF-α、IL-1β的生成和通過提高抗炎因子IL-10、IL-4的含量來抑制炎癥的發生,說明沉香葉是通過正負反饋雙向調節起到抗炎作用的[5-6].通過醋酸扭體模型和熱板模型實驗表明,沉香葉醇提物具有一定的鎮痛作用,低、中、高劑量均能抑制小鼠扭體次數,通過小鼠血清中研究發現,沉香葉醇提物各劑量組能降低醋酸扭體小鼠的扭體次數和血清中小鼠前列腺素E2(PGE2)和小鼠緩激肽(BK)的含量(P<0.05),也均能提高小鼠血清中小鼠β-內啡肽(β-EP)的含量,結果表明其鎮痛作用機制可能與抑制血清中的致痛物質PGE2、BK的含量和促進鎮痛物質β-EP的釋放有關[7].