靈菊七蛋白提取及其降糖活性研究

馬 科,程源航,蘇澤宇

(鄭州輕工業大學 煙草科學與工程學院,河南 鄭州 450008)

隨著人們回歸自然和食療觀念的興起,糖尿病專屬特醫食品、功能食品、藥膳等的開發和利用得到了人們的認可和重視[1-5].利用這些新型食品輔助藥物治療,改善糖尿病與并發癥、減少病人對藥物的依賴,被認為是一種更安全可靠的糖尿病治療新方式.

靈菊七(Gynuramedica.Y.K.Yang)是我國學者發現并鑒定的菊三七屬新種[6],民間取其莖葉食用,對糖尿病顯示獨特療效.自被發現鑒定以來僅有我國學者對靈菊七降糖作用進行研究.劉瑩等[7-8]首次報道了靈菊七降糖和急性毒研究,證明其有較好降糖功效,且無毒性、安全性高.相關學者通過動物模型(包括鏈脲佐菌素誘導、高糖高脂飲食誘導、腎上腺素誘導、遺傳性等糖尿病模型)、細胞模型(MIN6 胰島細胞)驗證了靈菊七水提物具有確切的降糖作用.并且通過安全性研究證明,與同屬其他植物相比,其無毒性,安全性高,具有巨大的抗糖尿病藥食產品開發潛力[9-13].

α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性成分是2種重要的降糖活性成分[14-16],目前還沒有該植物中關于這兩類降糖活性成分的研究報道.為了闡明靈菊七降糖活性成分,本文從提取溶劑、加熱方式、提取時間、提取溫度、料液比5個方面對靈菊七活性蛋白提取工藝進行研究,并檢測不同方法獲得的提取物對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用.通過以上研究,期望為靈菊七降糖藥食產品的開發提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

靈菊七莖葉樣品：鄭州萬田生物科技公司提供,經河南中醫藥大學藥學院生藥教研室鑒定為菊科植物靈菊七(Gynuramedica.Y.K.Yang)的干燥莖葉;DNS試劑、蛋白檢測試劑盒、α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶：生工生物工程(上海)有限公司;石油醚、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈉、氯化鉀、吐溫20、吐溫80、十二烷基磺酸鈉(SDS)、可溶性淀粉、阿卡波糖、蕓豆蛋白提取物、對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷、二甲基亞砜：上海麥克林生化科技有限公司.

1.2 儀器與設備

DF-101S 水浴鍋：鞏義于華儀器公司;紅外輻射式烘箱：上海一恒科學儀器公司;超聲波提取器BCT-10L：上海利聞科學儀器有限公司;超聲波恒溫水浴提取器SCQ-HD300A：上海聲彥超聲波儀器有限公司;家用型微波爐：中國美的科技有限公司;紫外分光光度計UV-1800PC：梅特勒托利多科技(中國)有限公司;RE-100-S旋轉蒸發儀：德拉布科技有限公司;冷凍干燥機BILON-FD80AD：上海比朗儀器制造有限公司.

1.3 實驗方法

1.3.1 靈菊七樣品前處理

取 200 g 干燥的靈菊七根莖,粉碎過0.077 mm篩,加入20倍體積的I類石油醚,50 ℃ 下浸提 2 h,過濾后的到除去油脂的靈菊七殘渣,將殘渣在 40 ℃ 烘箱內干燥除去石油醚.得到干燥的靈菊七樣品備用.

1.3.2 靈菊七蛋白提取工藝研究

1) 提取溶劑

選取磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、水、3%吐溫20、3%吐溫80、5%SDS作為提取溶劑,提取條件為料液比30∶1、提取溫度 60 ℃、提取時間 3 h.根據蛋白提取率來判斷出最適的提取溶劑.

2) 提取方式

紅外輻射加熱法 將樣品置于紅外輻射式烘箱,在溫度 50 ℃ 下提取 30 min.

微波加熱法 將樣品置于微波爐中,在設置為中溫檔下提取 5 min.

恒溫水浴加熱法 將樣品置于水浴鍋中,在 50 ℃ 條件下水浴提取 30 min.

超聲提取法 將樣品置于超聲波恒溫水浴,功率 100 W、室溫條件下超聲 30 min.

超聲輔助水浴加熱法 將樣品置于超聲波恒溫水浴,在設置功率 100 W、50 ℃ 條件下超聲水浴 30 min.其它條件與1)一致.

表1 3因素4水平的 BoxBehnken 試驗設計(BBD)

1.3.3 靈菊七蛋白提取單因素

料液比 選取10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1 5種料液比.其它條件與1)一致.

提取溫度 選取50、60、70、80和 90 ℃ 5個梯度.其它條件與1)一致.

提取時間 選取3、4、5、6和 7 h 5個梯度.其它條件與1)一致.

1.3.4 響應面實驗

本實驗以提取時間、提取溫度作為連續因子,提取方式作為類別因子,采用3因素4水平的BoxBehnken試驗設計(BBD)(表 1),對提取溫度(30、40、60、80 ℃);提取時間(1、3、5 h)和加熱方式(1水浴、2超聲水浴)進行優化.

1.3.5 靈菊七蛋白質測定方法

1) 蛋白標準曲線的繪制 以牛血清蛋白(BSA)為標準蛋白繪制標準曲線,準確稱取 1 mg 牛血清蛋白溶于 50 mL 蒸餾水中,即 10 mg/mL 原液,將原液梯度稀釋為1、2、3、4、5 mg/mL.測定方法參照BCA蛋白試劑盒檢測,取適量的A液和B液按照50∶1體積比充分混勻,配置適量BCA工作液,取 20 μL 標準蛋白和 200 μL BCA工作液混勻后,在 37 ℃ 條件下溫水浴 1 h 后于波長 595 nm 下檢測吸光度.通過Origin繪制蛋白含量標準曲線.

2) 樣品測定 根據相關文獻[19]報道,提取結束后,對提取液抽濾,取 20 μL 上清液,加入 200 μL BCA工作液,在 37 ℃ 條件下溫水浴 1 h 后于波長 595 nm 下檢測吸光度,考慮到靈菊七浸提液顏色較重,以不加顯色劑的浸提液為空白對照組排除干擾.將樣品組吸光度減去空白對照組吸光度后,帶入到上述蛋白含量標準曲線中計算出蛋白濃度.

1.3.6 靈菊七浸提液對α-淀粉酶抑制率測定方法

將 0.5 g 可溶性淀粉溶解到 100 mL 去離子水中,配置成 0.5 g/mL 溶液,并在 100 ℃ 條件下讓淀粉充分溶解,待到溶液澄清后,室溫冷卻降溫待用;取 0.05 gα-淀粉酶加入到 50 mL 磷酸鹽緩沖溶液中,充分溶解,配置成 0.05 g/50 mL 酶溶液,將 50 μL 酶液與 50 μL 分離組分在 40 ℃ 條件下相互作用 1 h,取 100 μL 混合液加入到 1 mL 淀粉溶液中,混勻后于 40 ℃ 恒溫反應 15 min,取 100 μL 反應液加入 200 μL 的DNS試劑,反應液于沸水浴中加熱 5 min 后取出,并于冰水浴中迅速冷卻,取出 100 μL 加入 900 μL 水稀釋,于波長 540 nm 處測定吸光度.按下式計算：

(1)

式中,A樣品為樣品反應液吸光度;A空白為以磷酸鹽緩沖液代替酶的吸光度;A對照為以磷酸鹽緩沖液代替樣品的吸光度.

1.3.7 靈菊七浸提液對α-糖苷酶抑制率測定方法

將 10 mg 對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷溶于 100 μL 二甲基亞砜中,取 10 μL 上述溶液溶解在 990 μL 磷酸緩沖鹽溶液(0.1 mol/L,pH 6.8)中.取α-糖苷酶稀釋為0.4單位/mL.取 80 μL 酶液和靈菊七浸提液混合在 37 ℃ 條件下預培養 15 min,添加 40 μL 底物開始酶促反應,進一步溫育 30 min.通過加入 1 mL 0.1 mol/L 的碳酸鈉中止酶活,在 405 nm 下測定吸光度.

1.4 浸提液的凍干、復溶與純化

將 1 L 浸提液放 -20 ℃ 冷凍 10 h,然后將樣品置冷凍干燥機中冷凍干燥,獲得凍干物.

取凍干物加入到 10 mL 超純水中溶解.依次加質量分數為20%、40%、60%的硫酸銨,使溶液產生沉淀,沉淀離心并冷凍干燥,獲得凍干物.

1.5 數據處理與分析

本次試驗中α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制率數據均重復6次,結果表示均以實驗數據的平均值±標準偏差的形式呈現.采用Design-Expert 8.0.6、Minitab進行數據處理;采用Origin 2021 進行圖表繪制.

2 結果與討論

2.1 提取方法對靈菊七蛋白提取的影響

加熱為活性蛋白從植物細胞內擴散到胞外提供能量,促進蛋白的浸出,增加溶出速率和浸出率,并且不同加熱方式對提取的影響不同[17].本文研究了烘箱、微波、水浴、超聲、超聲水浴5種加熱方式對提取的影響,結果如圖1A所示,超聲輔助水浴和烘箱的蛋白提取率高于其它.因為在超聲的過程中超聲產生的空壓可以破壞植物細胞膜,利于胞內溶質擴散,從而導致更多的活性蛋白從植物細胞中釋放出來[18];烘箱加熱法通過紅外線輻射加熱使細胞內部的水分快速氣化導致細胞破裂,從而促使蛋白從細胞內釋放出來[19],但是對溫度需求較高,容易破壞蛋白的結果而導致其失去活性,因此超聲輔助水浴是最適的加熱方式.

提取溶劑作為蛋白的溶出的媒介對蛋白提取影響較大,不同溶劑對蛋白的溶解能力不同,提取效果差異較大[20].本文研究了磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、水、3%吐溫20、3%吐溫80、5%SDS 5種溶劑對靈菊七蛋白的提取率的影響.結果如圖1B所示,吐溫80提取靈菊七蛋白效率最高,其次為PBS.這是由于吐溫80作為表明活性劑,使細胞表面張力增大,蛋白更易從細胞中釋放出來[21],但是吐溫80提取物顏色較深,表明含有較多雜質,且考慮到PBS對與活性蛋白有保護作用,因此選用PBS作為最適的提取溶劑.

2.2靈菊七蛋白提取單因素研究

結果如圖2A所示,隨著料液比的增大蛋白提取率逐步增大,料液比達到30∶1、40∶1、50∶1后,蛋白提取率緩慢增長,因此選擇30∶1的料液比對最為合適.

如圖2B所示,40～60 ℃ 時候隨著溫度的增加,蛋白提取率增加,因為溫度增加時,有利于蛋白質分子和水分子的運動,增加其溶解度,60 ℃ 以后隨著溫度的增加蛋白提取率在降低,高溫導致蛋白質結構發生改變,蛋白內部的非極性基團暴漏到表面,減少了蛋白的溶解度,隨著溫度的升高,對于蛋白質活性的破壞程度也在不斷提升,很可能影響靈菊七浸提液對與α-淀粉酶與α-葡萄糖苷酶活性的影響,因此50～60 ℃ 為最適的提取溫度.

結果如圖2C所示,在1～3 h 內靈菊七蛋白的提取率隨著時間的增加明顯升高,3 h 后蛋白提取率增加不明顯,考慮到過長時間在高溫水浴條件下對蛋白活性的影響,因此選擇 3 h 作為最適的提取時間.

(A)加熱方法對靈菊七蛋白提取的影響 (B)提取溶劑對靈菊七蛋白提取的影響圖1 提取方法對靈菊七蛋白提取率的影響

(A)不同料液比對靈菊七蛋白 (B)不同提取溫度對于靈菊七蛋白 (C)不同提取時間對靈菊七蛋白 提取率的影響 提取率的影響 提取率的影響圖2 提取條件單因素研究

2.3 響應面實驗

本文選取提取時間、提取溫度作為連續因子,提取方式作為類別因子,以總蛋白提取率和浸提液分別對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制率作為結果,做了3組響應面實驗.

2.3.1 總蛋白提取率

由表2可知,通過Minitab軟件對統計結果進行方差分析,模型p值<0.001,模型極顯著,失擬項p值0.609>0.05,模型的失擬項不顯著,表明該模型具有統計學意義.回歸分析結果顯示,在蛋白提取過程中的影響因素中,A2項極顯著,A、C項顯著,說明提取溫度、提取方式對靈菊七蛋白提取率有顯著影響.各因素對蛋白提取率的影響程度A>C>B, 運用Minitab軟件進行分析,得到二次多項式回歸方程：

蛋白提取率C1=-15.97+0.773 9A+1.800B-0.005 900A2-0.112 0B2-0.015 66AB

蛋白提取率C2=-17.27+0.796 1A+1.469B-0.005 900A2-0.112 0B2-0.015 66AB

表2 蛋白提取率回歸分析

續表2

由圖3可以得出,提取時間和提取溫度交互面的坡面較為陡峭,等高線呈現橢圓形,交互作用明顯,與方差分析結果一致.圖3a和圖3b對比得出,相對與水浴提取法而言,超聲輔助熱提取法蛋白的最大提取率從10.2%提高到了10.9%,有一定地提升效果.經Minitab軟件進一步優化,最終得到靈菊七蛋白的最適提取條件為：超聲輔助熱提取法、提取溫度 62 ℃、提取時間 3 h、料液比1∶30、提取溶劑PBS,靈菊七蛋白的最大提取率可達到10.8%.

(a) (b)圖3 蛋白提取率響應面曲線

2.3.2α-淀粉酶抑制率

由表3可知,通過Minitab軟件對統計結果進行方差分析,模型p值<0.05,模型顯著,失擬項p值0.954>0.05,模型的失擬項不顯著,表明該模型具有統計學意義.回歸分析結果顯示,在蛋白提取過程中的因素中,A2,A項顯著,說明提取溫度對靈菊七浸提液對α-淀粉酶抑制率有顯著影響.各因素對蛋白提取率的影響程度A>B>C, 運用Minitab軟件進行分析,得到二次多項式回歸方程：

α-淀粉酶抑制率C1=-30.4+1.664A+0.51B-0.0159 7A2+0.498B2-0.003 5AB

α-淀粉酶抑制率C2=-24.9+1.644A-1.56B-0.015 97A2+0.498B2-0.003 5AB

表3 浸提液對α-淀粉酶抑制率回歸分析

由圖4可以得出,提取時間和提取溫度交互等高線不是橢圓形,兩者交互作用不明顯,提取時間等高線更為陡峭,該條件對靈菊七對α-淀粉酶抑制率作用更大,與回歸分析結果一致.由圖4a和圖4b對比得出,超聲輔助熱提取法相對于熱提取法,抑制率從24.20%提升到了31.80%,提升非常明顯,經Minitab軟件進一步優化,得出靈菊七浸提液對α-淀粉酶抑制最適提取條件：超聲輔助熱提取法、提取溫度 59 ℃、提取時間 3 h、料液比1∶30、提取溶劑PBS,靈菊七浸提液對α-淀粉酶的最大抑制率達到31.8%.

(a) (b)圖4 α-淀粉酶抑制率響應面

2.3.3α-葡萄糖苷酶抑制率

由表4可知,通過Minitab軟件對統計結果進行方差分析,模型p值<0.05,模型顯著,失擬項p值0.853>0.05,模型的失擬項不顯著,表明該模型具有統計學意義.回歸分析結果顯示,在蛋白提取過程中的因素中,B項顯著,說明提取時間對靈菊七浸提液對α-淀粉酶抑制率有顯著影響.各因素對蛋白提取率的影響程度B>A>C, 運用Minitab軟件進行分析,得到二次多項式回歸方程：

蛋白提取率C=-4.2+0.484A-2.15B-0.004 69A2+0.526B2

表4 浸提液對α-糖苷酶抑制率回歸分析

由圖5可以得出,提取時間和提取溫度交互等高線不是橢圓形,兩者交互作用不明顯,提取溫度等高線更為陡峭,該條件對靈菊七浸提液對α-糖苷酶抑制率作用更大,與回歸分析結果一致.經Minitab軟件進一步優化,得出靈菊七浸提液對α-糖苷酶抑制最適提取條件：超聲輔助熱提取法、提取溫度 52 ℃、提取時間 5 h、料液比1∶30、提取溶劑PBS,靈菊七浸提液對α-淀粉酶的最大抑制率達到13.60%.

圖5 α-葡萄糖苷酶抑制率響應面

2.4 提取液蛋白含量、純度檢測及其α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性分析

上述研究通過以提取時間、提取溫度作為連續因子,提取方式作為類別因子,采用3因素4水平的BoxBehnken試驗設計(BBD),獲得了26組不同提取工藝的靈菊七蛋白提取液蛋白含量,并檢測了其α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性.通過蛋白含量與其對酶的抑制活性相關性分析研究(圖5),可以發現靈菊七蛋白浸提液對α-淀粉酶抑制率隨著蛋白含量的增加而升高,即提取液蛋白含量與α-淀粉酶抑制率呈正相關,而與α-葡萄糖苷酶抑制率關系不大.另外,進一步對蛋白含量最高、抑制率最大的提取液樣品中蛋白含量和純度進行了研究.結果表明,1 L 該提取液蛋白含量為 20.8 mg,提取液凍干物質量為 80.3 mg,蛋白純度為25.9%.為了進一步排除干擾,對浸提液凍干物進行復溶,然后依次加質量分數為20%、40%、60%的硫酸銨,其中加40%和60%硫酸銨獲得沉淀,分別離心并冷凍干燥后分別獲得16.1和 4.2 mg 凍干物.最后2種凍干物配置成 100 mg/L 的溶液并檢測α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性,其中,40%硫酸銨沉淀物的α-淀粉酶抑制率最大,可達90.2%,2種凍干物對α-葡萄糖苷酶抑制作用很微弱,僅1.8%和1.1%.綜上所述,可以推斷靈菊七PBS浸提液中含有對α-淀粉酶具有較好抑制作用的活性蛋白.通過文獻調研,可以發現已有關于靈菊七同屬植物降糖活性成分的研究主要集中在小分子天然產物上,對于具有α-淀粉酶抑制活性的蛋白和多肽還沒有研究報道.

圖6 蛋白含量與抑制率相關性

3 結語

本文確定了靈菊七蛋白最佳提取方式為以PBS為溶劑,超聲輔助水浴加熱法提取.通過響應面法優化了提取工藝條件,最佳條件下總蛋白提取率最高可達10.8%,提取物對α-淀粉酶最大抑制率為34.49%,提取物對α-葡萄糖苷酶最大抑制率為13.6%,并且浸提液對α-淀粉酶抑制率隨著蛋白含量的增加而升高,結合浸提液凍干物的40%硫酸銨沉淀物對α-淀粉酶抑制率可達90.2%,可以推測提取液含有對α-淀粉酶具有較好抑制作用的活性蛋白.以上研究結果表明,靈菊七莖葉中可能含有新型α-淀粉酶抑制活性蛋白,具有開發為α-淀粉酶抑制活性藥食產品的巨大潛力.但是,本文僅對靈菊七粗提物和硫酸銨沉淀物進行了研究,雖然蛋白純度高,但并沒有完全排除干擾.后續可以根據該提取條件,大批量提取靈菊七,以分離高純度活性蛋白,完全排除小分子干擾,進一步明確靈菊七含有α-淀粉酶抑制活性蛋白,并解析蛋白結構及構效關系.