廣西芒果細(xì)菌性壞死病病原菌鑒定

陳小林 孫秋玲 黃穗萍 唐利華 郭堂勛 莫賤友 任惠 李其利

摘要

芒果Mangifera?indica?L.是我國著名的熱帶水果，近年來細(xì)菌性病害發(fā)生嚴(yán)重。2020年－2021年對廣西百色地區(qū)的芒果病害進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，一種細(xì)菌性壞死病與細(xì)菌性黑斑病混合發(fā)生，一般發(fā)病率30%～60%，嚴(yán)重可達(dá)90%以上。本研究先后從該地區(qū)不同芒果壞死病組織中分離得到泛菌屬的21株細(xì)菌。根據(jù)形態(tài)、生理生化特性、16S?rDNA、fusA、gyrB、leuS、pyrG、rlpB和rpoB的多基因系統(tǒng)發(fā)育分析、致病性測定等方法將21個(gè)菌株分別鑒定為Pantoea?vagans、P.anthophila、P.?dispersa?和P.?cypripedii。其中P.anthophila、P.?dispersa?和P.?cypripedii引起芒果細(xì)菌性壞死病是中國首次報(bào)道。

關(guān)鍵詞

芒果;?細(xì)菌性壞死病;?泛菌屬

中圖分類號：

S?432.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2022772

Identification?of?the?pathogen?causing?mango?bacterial?necrotic?disease?in?Guangxi

CHEN?Xiaolin1，?SUN?Qiuling1，?HUANG?Suiping1，?TANG?Lihua1，?GUO?Tangxun1，MO?Jianyou1，?REN?Hui2*，?LI?Qili1*

（1.?Institute?of?Plant?Protection，?Guangxi?Academy?of?Agricultural?Sciences，?Key?Laboratory?of?Green?Prevention?

and?Control?on?Fruits?and?Vegetables?in?South?China，?Ministry?of?Agriculture?and?Rural?Affairs，?Guangxi?Key?

Laboratory?of?Biology?for?Crop?Diseases?and?Insect?Pests，?Nanning?530007，?China;?2.?Institute?of?Horticulture，?

Guangxi?Academy?of?Agricultural?Sciences，?Nanning?530007，?China）

Abstract

Mangifera?indica?L.?is?one?of?the?wellknown?fruits?in?China.?Bacterial?diseases?have?been?occurring?seriously?in?recent?years.?A?bacterial?necrotic?disease?mixed?with?bacterial?black?spot?disease?on?mango?was?observed，?with?an?incidence?rate?of?30%-60%，?even?up?to?90%，?in?our?investigation?of?mango?diseases?in?Baise，?Guangxi?from?2020?to?2021.?Twentyone?isolates?belonging?to?the?genus?Pantoea?were?successively?isolated?from?the?mango?necrotic?tissues?in?investigation?region?in?this?study.?The?isolates?were?identified?as?four?species：?Pantoea?vagans，?P.anthophila，?P.?dispersa?and?P.?cypripedii?based?on?the?morphological，?physiobiochemical?characteristics，?16S?rDNA?sequence，?phylogenetic?analysis?of?fusAgyrBleuSpyrGrlpBrpoB?concatenated?sequences?and?pathogenicity?test.?This?is?the?first?report?of?necrotic?disease?caused?by?P.anthophila，?P.?dispersa?and?P.?cypripedii?in?mango?in?China.

Key?words

Mangifera?indica;?bacterial?necrotic?disease;?Pantoea

芒果Mangifera?indica?L.是著名的熱帶果樹，主要種植于印度、中國和泰國等熱帶和亞熱帶國家［12］。2020年廣西芒果種植面積11.2萬hm2，產(chǎn)量近95萬t，為我國第一大芒果產(chǎn)區(qū)［3］。隨著品種結(jié)構(gòu)改變和氣候變化，芒果細(xì)菌性病害發(fā)生日益增多，近年呈加重趨勢，嚴(yán)重影響芒果產(chǎn)量和品質(zhì)，制約廣西芒果產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展［4］。

已報(bào)道引起芒果細(xì)菌性病害的病原菌，主要包括引起芒果細(xì)菌性黑斑病（又稱芒果細(xì)菌性角斑病）的柑橘黃單胞菌芒果致病變種Xanthomonas?citri?pv.?mangiferaeindicae［56］，引起芒果細(xì)菌性頂端壞死病的丁香假單胞菌Pseudomonas?syringae?pv.?syringae［7］，引起芒果葉斑病的樹生黃單胞菌X.arboricola［8］，引起芒果細(xì)菌性干枯病的血紅鞘氨醇單胞菌Sphingomonas?sanguinis［910］和引起芒果細(xì)菌性壞死病的泛菌屬細(xì)菌Pantoea?ananatis［11］、P.agglomerans［12］?和P.vagans［13］等種類。

2020年－2021年對廣西芒果主產(chǎn)地百色田東縣、田陽縣、右江區(qū)和田林縣不同果園的病害進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)芒果上發(fā)生一種類似于細(xì)菌性黑斑病的壞死病，兩者常混合發(fā)生，一般株發(fā)病率30%～60%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)90%以上。為明確該病害的病原菌，本研究對田間采集的病害樣品進(jìn)行病原菌的分離、純化、培養(yǎng)，并采用形態(tài)學(xué)觀察和生理生化特性、致病性測定、多基因系統(tǒng)發(fā)育分析等方法對分離物進(jìn)行鑒定，旨在明確廣西細(xì)菌性壞死病的病原菌種類和優(yōu)勢種群，為深入研究其發(fā)生規(guī)律和防治技術(shù)提供參考。

1?材料與方法

1.1?病害調(diào)查及病樣采集

2020年－2021年在廣西芒果主產(chǎn)地百色地區(qū)不同種植區(qū)（田東縣、田林縣、田陽縣和右江區(qū)）采集不同品種芒果上類似細(xì)菌性黑斑病的壞死病樣品。

1.2?病原菌的分離與純化

選取葉片或果實(shí)病樣，切取病健交界處組織（5?mm×5?mm），75%乙醇浸泡10?s，2%次氯酸鈉浸泡1?min，滅菌水沖洗3次，置于研缽中，加入少量石英砂和1?mL滅菌水進(jìn)行充分研磨，吸取100?μL上清液至分裝有900?μL滅菌水的1.5?mL離心管進(jìn)行系列梯度稀釋，吸取10-3～10-6梯度各100?μL涂布于LB固體平板上，28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每份樣品選擇不同菌落形態(tài)的代表性菌株1株進(jìn)行保存。

1.3?病原菌鑒定

1.3.1?菌株的分子生物學(xué)鑒定

將分離菌株在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24?h，采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取菌株總DNA。利用細(xì)菌16S?rDNA的通用引物27F（5′GAGTTTGATCCTGGCTCAG3′）和1492R（5′CGGCTACCTTGTTACGACTT3′）對36株供試菌株基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增［14］。20?μL?PCR反應(yīng)體系：2×PCR?buffer?（plus?Mg2+）10?μL，dNTPs（2.5?mmol/L）0.5?μL，DNA模板1?μL，上、下游引物（10?μmol/L）各1?μL，Taq?酶（5?U/μL）0.1?μL，ddH2O?6.4?μL。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3?min;94℃變性45?s，57℃退火45?s，72℃延伸1?min，35個(gè)循環(huán);72℃延伸5?min。泛菌多位點(diǎn)序列包括延伸因子EFG基因（fusA）、DNA促旋酶基因（gyrB）、亮氨酰tRNA合成酶基因（leuS）、CTP合成酶基因（pyrG）、脂蛋白基因（rlpB）和RNA聚合酶β亞基基因（rpoB）的擴(kuò)增引物信息、退火溫度及擴(kuò)增產(chǎn)物大小見表1［15］。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠檢測條帶后，產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序結(jié)果提交NCBI在線網(wǎng)站進(jìn)行相似性比對，使用MEGA?X的最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定近緣細(xì)菌菌株的分類地位。

1.3.2?形態(tài)與生理生化特性鑒定

將分離菌株接種于LB固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)2?d，觀察菌落形態(tài)、大小、顏色、表面及邊緣形態(tài)、透明度等特征;對細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色，觀察染色結(jié)果。參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》（第8版）進(jìn)行生理生化特性測定：3%耐鹽性、氧化酶和過氧化氫酶活性、硝酸鹽還原試驗(yàn)、淀粉水解、明膠液化、硫化氫的產(chǎn)生以及碳源（蔗糖、D果糖、葡萄糖、α半乳糖、麥芽糖和甘露醇）利用等。

1.4?菌株的致病性測定

每個(gè)種選取代表性菌株1株進(jìn)行致病性測定。將菌株接種于LB液體培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)過夜，收集菌體，無菌水重懸并調(diào)節(jié)OD600=0.1。選取‘玉文’芒果新梢上的健康葉片，用無菌注射器針頭對葉片進(jìn)行輕微刺傷后，將滅菌脫脂棉蘸取菌液接種于葉片背面，28℃保濕培養(yǎng)48?h。以接種本研究分離的芒果細(xì)菌性黑斑病菌為對照，無菌水為空白對照。定時(shí)觀察記錄發(fā)病情況。采用相同的方法對‘玉文’芒果果實(shí)進(jìn)行離體接種，測定菌株致病性。果實(shí)接種前依次用75%乙醇清洗10?s，2%次氯酸鈉1?min，無菌水清洗3次，晾干，然后采用無菌注射器針頭對4個(gè)位置進(jìn)行刺傷，每個(gè)位置刺傷8個(gè)傷口，將滅菌脫脂棉蘸取菌液接種于刺傷位置，28℃保濕培養(yǎng)48?h。對接種后發(fā)病的芒果組織進(jìn)行病原菌再分離、純化與鑒定，完成柯赫氏法則驗(yàn)證。空白對照采用同樣的方法進(jìn)行處理。

2?結(jié)果與分析

2.1?病害調(diào)查與病原菌分離

2020年－2021年間田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，廣西百色田東縣、田陽縣、右江區(qū)和田林縣不同果園的芒果上發(fā)生一種類似于細(xì)菌性黑斑病的壞死病。葉片感病初期產(chǎn)生水漬狀小點(diǎn)，后期逐漸擴(kuò)展成多角形或不規(guī)則形狀的黑褐色病斑，周圍伴有黃暈圈（圖1a～e）;果實(shí)感病初期主要表現(xiàn)為褐色小點(diǎn)，后期擴(kuò)展成表面隆起的黑褐色病斑，嚴(yán)重時(shí)病斑潰瘍開裂且有汁液溢出（圖1f～j）。先后從不同果園采集病害樣本28份，經(jīng)組織表面消毒、研磨和稀釋分離，每份樣品選擇不同菌落形態(tài)的代表性菌株1株進(jìn)行保存，共獲得36株細(xì)菌（表2，圖1k～o）。

2.2?菌株的分子生物學(xué)鑒定

利用細(xì)菌通用引物27F/1492R對菌株的16S?rDNA序列進(jìn)行擴(kuò)增、測序，將獲得的序列在NCBI進(jìn)行BLASTn同源性比對。對36個(gè)供試菌株16S?rDNA序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明，36個(gè)菌株中，15個(gè)菌株的16S?rDNA序列與芒果細(xì)菌性黑斑病菌的相應(yīng)序列一致性最高，達(dá)99.5%以上，與黃單胞菌屬不同種聚在一個(gè)大分支，另外21個(gè)菌株的16S?rDNA序列與泛菌屬Pantoea的相應(yīng)序列一致性最高，達(dá)99%以上，與泛菌屬不同種聚在另一個(gè)大分支（圖2）。進(jìn)一步克隆、測序泛菌屬21個(gè)菌株的6個(gè)基因片段（fusA、gyrB、leuS、pyrG、rlpB和rpoB），并進(jìn)行BLASTn同源性比對。利用MEGAX軟件的最大似然法（maximum?likelihood，ML）構(gòu)建6個(gè)基因串聯(lián)序列的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。

結(jié)果表明，以Tatumella?terrea為外群，21個(gè)菌株分別聚在4個(gè)不同的分支，被鑒定為4個(gè)種：P.vagans、P.anthophila、P.dispersa和P.cypripedii。其中，?8個(gè)菌株為P.vagans，占比38%，是優(yōu)勢種。菌株的分離和鑒定結(jié)果表明，同一樣品存在泛菌屬不同種或泛菌屬與細(xì)菌性黑斑病菌混合發(fā)生的情況（表2）。

2.3?菌株的形態(tài)和生理生化特性

泛菌屬4個(gè)種的供試菌株具有以下共同的特征：菌落黃色，均為革蘭氏陰性菌，能在3%鹽濃度下生長，氧化酶陰性，過氧化氫酶陽性，不能還原硝酸鹽，可以降解淀粉，能利用蔗糖、D果糖、葡萄糖、α半乳糖、甘露醇作為碳源。此外，4個(gè)種供試菌株均不具有明膠液化能力，但可以產(chǎn)生硫化氫;除P.?vagans，泛菌屬其他3個(gè)種均可以利用麥芽糖作為碳源;除P.cypripedii外，其他3個(gè)種甲基紅反應(yīng)均為陽性（表3）。

2.4?致病性測定

分別選取4個(gè)種的代表性菌株各1株進(jìn)行致病性測定。對‘玉文’芒果新梢上的健康葉片采用刺傷接種供試菌懸液，28℃保濕培養(yǎng)48?h。結(jié)果顯示，接種5?d后，葉片開始出現(xiàn)針狀褐色小點(diǎn)，接種15?d后，不同種菌株接種葉片的發(fā)病程度不同，但發(fā)病癥狀與田間自然發(fā)病的癥狀基本一致（圖4a～f）。采用相同的方法對‘玉文’果實(shí)離體接種進(jìn)行菌株致病性測定。結(jié)果顯示，接種果實(shí)7?d后，發(fā)病癥狀與田間自然發(fā)病的癥狀相似（圖4g～l）。從發(fā)病組織中重新分離病原菌，經(jīng)純化和分子鑒定，分離到與供試菌株同種細(xì)菌，驗(yàn)證了科赫氏法則。

3?結(jié)論與討論

本研究通過形態(tài)學(xué)、生理生化特性、分子鑒定與致病性測定的方法明確了廣西百色芒果細(xì)菌性壞死病的4種病原菌屬于泛菌屬，其中優(yōu)勢種為Pantoea?vagans，占比38%。其次為P.anthophila、P.cypripedii和P.dispersa。目前芒果上已相繼報(bào)道泛菌屬P.ananatis、P.agglomerans和?P.vagans為芒果細(xì)菌性壞死病的病原菌［1113］。本研究為國內(nèi)外首次報(bào)道泛菌屬P.anthophila、P.dispersa和P.cypripedii引起芒果細(xì)菌性壞死病。2020年和2021年的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該病害在廣西百色發(fā)生普遍，且常與芒果細(xì)菌性黑斑病混合發(fā)生，容易被忽略或混淆，值得進(jìn)一步關(guān)注。

植物病原細(xì)菌傳統(tǒng)的分類依據(jù)主要是表型特征和生理生化特性，前者包括菌落形態(tài)、細(xì)菌革蘭氏染色觀察、致病性等。由于有些重要分類特征的重疊和環(huán)境的影響，遺傳關(guān)系較近的小種、亞種及致病變種等往往難以區(qū)分，給病原菌的快速準(zhǔn)確鑒定帶來諸多困難［16］。本研究中生理生化特性結(jié)果也證實(shí)其無法有效區(qū)分泛菌屬4個(gè)不同種。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，現(xiàn)代細(xì)菌分類已進(jìn)入多相分類（polyphasic?taxonomy）階段［17］。16S?rRNA的基因序列是細(xì)菌分類鑒定的強(qiáng)有力工具，幾乎可以對所有的細(xì)菌進(jìn)行屬水平上的鑒定［1819］，但由于其保守性高，不太適合種或某些近緣種的鑒定。本研究中基于16S?rDNA序列能將36株菌株進(jìn)行屬水平的區(qū)分，但無法在種水平上進(jìn)行有效鑒定。目前，基于fusA、gyrB、leuS、pyrG、rlpB和rpoB多位點(diǎn)序列分析被廣泛應(yīng)用于泛菌屬細(xì)菌的分類鑒定研究中，其快速準(zhǔn)確、重復(fù)性好，在細(xì)菌的分類鑒定中具有獨(dú)特優(yōu)勢［15］。本研究結(jié)果也表明，基于fusA、gyrB、leuS、pyrG、rlpB和rpoB多基因序列能有效區(qū)分泛菌的不同種。

泛菌屬是一類基因組高度可塑的革蘭氏陰性腸桿菌科細(xì)菌，廣泛存在于水體、土壤及動(dòng)植物等多種環(huán)境，目前至少包括25個(gè)種和2個(gè)亞種［20］。很多泛菌屬菌株是植物病原菌，可引起植物結(jié)瘤、萎蔫、軟腐或壞死等癥狀［12，?2122］。植物病原細(xì)菌主要是通過自然孔口或傷口入侵植物組織［23］。本研究在進(jìn)行菌株致病性測定時(shí)采用刺傷接種，發(fā)現(xiàn)不同菌株致病性強(qiáng)弱存在差異，這些病原菌能否從自然孔口侵入有待進(jìn)一步的研究。本研究明確P.anthophila、P.dispersa和P.cypripedii引起芒果細(xì)菌性壞死病，為后續(xù)研究該病害的發(fā)生流行學(xué)奠定基礎(chǔ)，為制定有效的防控策略提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

［1］?LAURICELLA?M，?EMANUELE?S，?CALVARUSO?G，?et?al.?Multifaceted?health?benefits?of?Mangifera?indica?L.?（mango）：?The?inestimable?value?of?orchards?recently?planted?in?Sicilian?rural?areas?［J/OL］.?Nutrients，?2017，?9（5）：?525.?DOI：?10.3390/nu9050525.

［2］?SOUZA?F?V?D，?REBOUAS?C?C，?SOUZA?E?H，?et?al.?In?vitro?conservation?of?mango?（Mangifera?indica?L.）?Ubá?and?Carlota?cvs.?through?culturing?immature?embryos?［J/OL］.?Anais?da?Academia?Brasileira?de?Ciencias，?2020，?92（S1）：?e20190400.?DOI：?10.1590/00013765202020190400.

［3］?張淑貞.?鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略背景下廣西百色芒果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展對策研究［J］.?中國商論，?2022（4）：?165168.

［4］?韓冬銀，?邢楚明，?李磊，?等.?廣西芒果病蟲害發(fā)生情況和防治現(xiàn)狀調(diào)查與分析［J］.?熱帶作物學(xué)報(bào)，?2020，?41（5）：?9941000.

［5］?DOIDGE?E?M.?A?bacterial?disease?of?the?mango，?Bacillus?mangiferae?［J］.?Annals?of?Applied?Biology，?1915，?2（1）：?145.

［6］?AHYOU?N，?GAGNEVIN?L，?GRIMONT?P?A，?et?al.?Polyphasic?characterization?of?xanthomonads?pathogenic?to?members?of?the?Anacardiaceae?and?their?relatedness?to?species?of?Xanthomonas?［J］.?International?Journal?of?Systematic?and?Evolutionary?Microbiology，?2009，?59（Pt?2）：?306318.

［7］?CAZORLA?F?M，?TORS?J?A，?OLALLA?L，?et?al.?Bacterial?apical?necrosis?of?mango?in?southern?Spain：?a?disease?caused?by?Pseudomonas?syringae?pv.?syringae?［J］.?Phytopathology，?1998，?88（7）：?614620.

［8］?漆艷香，?蒲金基，?張欣，?等.?杧果樹生黃單胞葉斑病病原的鑒定［J］.?果樹學(xué)報(bào)，?2011，?28（4）：?645650.

［9］?LIU?Feng，?ZHAN?Rulin，?HE?Zhongqin.?First?report?of?bacterial?dry?rot?of?mango?caused?by?Sphingomonas?sanguinis?in?China?［J］.?Plant?Disease，?2018，?102（12）：?2632.?

［10］何忠勤，?柳鳳，?詹儒林，?等.?杧果細(xì)菌性干枯病病原菌的分離與鑒定［J］.?中國南方果樹，?2019，?48（3）：?15.

［11］GUTIRREZBARRANQUERO?J?A，?CAZORLA?F?M，?TORES?J?A，?et?al.?First?report?of?Pantoea?ananatis?causing?necrotic?symptoms?in?mango?trees?in?the?Canary?Islands，?Spain?［J］.?Plant?Disease，?2019，?103（5）：?1017.

［12］GUTIRREZBARRANQUERO?J?A，?CAZORLA?F?M，?TORS?J?A，?et?al.?Pantoea?agglomerans?as?a?new?etiological?agent?of?a?bacterial?necrotic?disease?of?mango?trees?［J］.?Phytopathology，?2019，?109（1）：?1726.

［13］CHEN?Xiaolin，?SUN?Qiuling，?TANG?Lihua，?et?al.?First?report?of?bacterial?necrosis?caused?by?Pantoea?vagans?in?mango?in?China?［J/OL］.?Plant?Disease，?2022.?DOI：?10.1094/PDIS08221950PDN.

［14］LUDWIG?W.?Nucleic?acid?techniques?in?bacterial?systematics?and?identification?［J］.?International?Journal?of?Food?Microbiology，?2007，?120（3）：?225236.

［15］DELTOILE?A，?DECR?D，?COURANT?S，?et?al.?Phylogeny?and?identification?of?Pantoea?species?and?typing?of?Pantoea?agglomerans?strains?by?multilocus?gene?sequencing?［J］.?Journal?of?Clinical?Microbiology，?2009，?47（2）：?300310.

［16］田茜，?張美，?胡潔，?等.?植物病原細(xì)菌DNA條形碼檢測技術(shù)［J］.?植物檢疫，?2014，?28（6）：?17.

［17］馮潔.?植物病原細(xì)菌分類最新進(jìn)展［J］.?中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，?2017，?50（12）：?23052314.