福建省毛豆根結線蟲種類鑒定及初侵染來源

王婷 柯葉鑫 周瑤 喬燚 肖順 程曦 劉國坤

摘要

福建省漳州市一基地毛豆（品種：‘毛豆64’）苗期發生嚴重根結線蟲病，發病株率為78%。為明確其病原的種類及其初侵染來源，通過形態學、分子生物學方法進行了種類鑒定。研究結果表明，該線蟲雌蟲、雄蟲、2齡幼蟲（J2）的形態學特征與測量值和擬禾本科根結線蟲Meloidogyne?graminicola相吻合;基于線蟲rDNAITS序列和28S?rDNA?D2D3序列構建的系統發育樹進一步確定其為擬禾本科根結線蟲;室內接種試驗確定了其致病性。這是首次在福建省毛豆上發現擬禾本科根結線蟲。在毛豆基地畦地殘留的前作水稻稻茬根內和根際土壤中均分離到大量J2s，經特異性引物擴增確定為擬禾本科根結線蟲，研究認為前作水稻根系受擬禾本科根結線蟲侵染，在灌溉淹水狀態下線蟲2齡幼蟲和卵在根內與土壤中長期存活，成為輪作毛豆根結線蟲病的初侵染源。

關鍵詞

擬禾本科根結線蟲;?水稻根結線蟲;?鑒定;?系統發育分析

中圖分類號：

S?435.2

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2022716

Identification?and?primary?inoculum?sources?of?rootknot?nematode?in?Glycine?max?in?Fujian?province

WANG?Ting，?KE?Yexin，?ZHOU?Yao，?QIAO?Yi，?XIAO?Shun，?CHENG?Xi，?LIU?Guokun*

（College?of?Plant?Protection，?Fujian?Agriculture?and?Forestry?University，?State?Key?Laboratory?of?Ecological?Pest?

Control?for?Fujian?and?Taiwan?Crops，?Fuzhou?350002，?China）

Abstract

A?serious?rootknot?nematode?disease?occurring?at?the?seedling?stage?of?Glycine?max?‘maodou?64’，?with?a?disease?incidence?of?78%，?has?been?found?in?fields?in?Zhangzhou?region，?Fujian?province.?Morphological?measurements?of?females，?males?and?second?juveniles?（J2s）?matched?the?original?description?of?Meloidogyne?graminicola.?Species?identification?was?further?carried?out by?phylogenetic?analysis?based?on?the?sequences?of?rDNAinternal?transcribed?spacer?（ITS）?region?and?D2D3?region?of?28S?rDNA.?The?inoculation?test?in?greenhouses?confirmed?the?nematode’s?pathogenicity.?This?is?the?first?report?of?M.graminicola?parasitizing?soybean?in?Fujian?province.?A?large?number?of?J2s?had?been?isolated?from?the?root?of?preceding?rice?stubbles?and?rhizosphere?soil?in?ridged?fields?of?the?‘maodou?64’，?and?the?species?identification?was?confirmed?with?M.graminicola?specific?primers.?These?results?indicated?that?the?root?of?the?preceding?rice?was?infected?by?M.graminicola，?and?eggs?and?J2s?of?the?nematode?survived?in?waterlogged?soil?and?infected?root?for?a?long?period?of?time?in?irrigated?rice?cultivation，?and?became?the?primary?inoculum?sources?for?the?rootknot?nematode?disease?when?soybeans?are?planted?as?a?rotating?crop.

Key?words

Meloidogyne?graminicola;?rice?rootknot?nematode;?identification;?phylogenetic?analysis

毛豆Glycine?max?（L.）?Merr.，也稱菜用大豆或青毛豆，是未成熟且呈青綠色的食用大豆，營養價值高，在中國具有悠久的種植歷史［1］。中國是世界上毛豆的主要出口國，福建、廣東、江蘇、浙江、安徽、山東、湖南等地是其主栽培區［2］。根結線蟲Meloidogyne?spp.在世界大多數大豆產區有分布，在美國、巴西等國家的大豆產區發生嚴重，報道的主要病原線蟲有南方根結線蟲Meloidogyne?incognita、爪哇根結線蟲M.javanica、花生根結線蟲M.arenaria等［34］。20世紀大豆根結線蟲在我國黃淮海豆區、福建、江西等多地有報道，主要種類與國外相似［57］，但后來未有發生危害的進一步相關報道。2017年在我國海南毛豆產區首次發現擬禾本科根結線蟲M.graminicola侵染毛豆［8］。2021年12月福建省漳州市龍海區某基地毛豆苗發生了嚴重的根結線蟲病，本文對其種類進行鑒定，并對其初侵染源進行研究，旨在明確毛豆根結線蟲病的病原并為其防治提供理論依據。

1?材料與方法

1.1?樣本采集

毛豆根結線蟲樣本采集：2021年9月初，福建省漳州市（24°19′N，?117°45′E）毛豆基地，種植品種為‘毛豆64’，前季種植水稻‘汕優016’，收割后播種毛豆，出苗后9?d，可見毛豆生長不良，矮化，根部具有典型根結癥狀。采用平行線取樣法，調查其株發病率。采集的新鮮樣本自封袋裝好，帶回實驗室進行根結癥狀拍照等。

畦地稻茬根與土壤的收集：因水稻田翻耕起壟后種植毛豆，部分稻茬根系仍保留較為完整，采集稻茬根系與粘附土壤樣本，帶回實驗室檢查其中的線蟲。

1.2?毛豆根結線蟲種群純化、繁殖保存

單卵囊接種繁育：將新鮮的毛豆根結置于解剖鏡下，直接剖取單卵囊，接種到預先培植在滅菌沙壤土（沙∶壤=1∶2）的3～4葉期水稻‘汕優016’苗根部，在室溫下進行繁殖。

1.3?稻茬根及土壤根結線蟲的分離、繁殖保存

將采集的稻茬根上粘附土壤小心剝離，混合土樣后，每份樣本稱取50?g，采用改良貝爾曼漏斗法［9］進行線蟲分離，24?h和48?h各收集1次，合并計數。稻茬根經自來水沖洗后認真觀察根結生長情況，將無根結的已褐變根進行剖檢，觀察根內是否有雌蟲或卵囊等;每份樣品隨機挑取5?g根系剪碎，使用改良貝爾曼漏斗法進行分離［9］。從殘留稻樁根上獲得的2齡幼蟲，接種于同1.2方法繁育的水稻幼苗根部，室溫下進行繁殖。

1.4?分離線蟲對毛豆的致病性測定

將‘毛豆64’種子直接播種于滅菌的沙壤土中，每盆（高14?cm，直徑12?cm）1粒，等苗長到8～10?cm時，將水稻上純化種群獲得的新孵化2齡幼蟲配制成300條/mL懸浮液，取6?mL用移液槍接種于土壤根莖部外圍2?cm處，均分4點接種，置于L∥D=14?h∥10?h（光期28℃/暗期26℃），相對濕度為60%的培養箱內。處理與清水對照各6株，接種后30?d對根系進行檢查。

1.5?病原線蟲形態學鑒定

新鮮采回的毛豆根結，自來水洗凈后于體視顯微鏡下用挑針挑取雌蟲、卵囊和雄蟲。將卵囊挑至裝有無菌水的培養皿中，28℃恒溫箱孵育2?d獲得2齡幼蟲。供試線蟲的殺死、固定及會陰花紋的制作方法參照張紹升等［9］的方法。采用Nikon顯微鏡（Eclipse?NiU?931609，日本）和配套軟件NISElements?BR，進行蟲態觀測，采用De?Man公式計算形態測量值。各蟲態分別取20個樣本。

1.6?病原線蟲種類的分子生物學鑒定

1.6.1?DNA提取

線蟲DNA提取參照Liu等［10］的方法。挑取水稻根部土壤分離或毛豆根結卵囊新鮮孵化的2齡幼蟲1條，在無菌水中清洗2次后，轉移至裝有10?μL?WLB的離心管內，短暫離心后，將離心管放入液氮快速冷凍約1?min，再放入65℃水浴鍋內使其融化，反復凍融3次，加入1?μL?1.0?mg/mL蛋白酶K。將離心管放入PCR儀中65℃消化60?min，95℃失活10?min，得到根結線蟲DNA提取液，置于－20℃保存備用。

1.6.2?目的片段的PCR擴增及序列分析

選用線蟲rDNAITS區通用引物TW81?（5′GTTTCCGTAGGTGAACCTGC3′），AB28（5′ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT3′）［11］和28S?D2D3區通用引物D2A?（5′ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG3′），D3B?（5′TCGGAAGGAACCAGCTACTA3′）［12］。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。25?μL反應體系：2.5?μL?DNA模板，上、下游引物（10?μmol/L）各1?μL，?ddH2O?8?μL，Premix?TaqTM（TaKaRa，大連寶生物公司）12.5?μL。PCR反應程序：94℃預變性4?min;94℃?30?s，55℃?（ITS區）或54℃?（28S?D2D3區）?30?s，72℃?40?s，35個循環;72℃?10?min，4℃保存。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠檢測合格后送往生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，上傳GenBank獲得序列號。將所得目的片段序列在NCBI進行BLAST比對，選取序列相似度最高的類群作為建樹序列。通過采用MAFFT?version?7［13］程序中GINSI模型進行序列的多重比對;在CIPRES?Science?Gateway?（www.pholy.org）［14］運算平臺上進行序列分析。運用程序MrBayes?on?XSEDE，采用GTR+I+G模型構建貝葉斯樹［15］;運用程序RAxMLHPC2?on?XSEDE［16］，采用GTRCAT模型構建極大似然樹［17］。根據序列設定分析運算運行5×106～1×107代，最大似然法的自展重復設定為1?000次。最后采用Figtree?v?1.4.3和Adobe?Illustrator?CC在貝葉斯50%多數原則一致樹上標注ML自展值和后驗概率。

1.6.3?特異性引物驗證田間樣品中線蟲種類

田間隨機采集毛豆根結、殘留稻茬根部根結及根土壤樣本各8份，剖取根結雌蟲、改良貝爾曼法分離根內和土壤中2齡幼蟲，提取各樣本中單條線蟲的DNA，采用擬禾本科根結線蟲特異

性引物MgF（5′TTATCGCATCATTTTATTTG3′），

MgR（5′CGCTTTGTTAGAAAATGACCCT3′）［18］進行擴增。PCR反應程序：95℃?4?min;94℃?30?s，52℃?30?s，72℃?35?s，35個循環;72℃?10?min，4℃保存。PCR產物使用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

2?結果與分析

2.1?毛豆根結線蟲病田間癥狀及發病率

田間毛豆出苗9?d，受根結線蟲嚴重侵染后，植株明顯矮化，生長衰退，葉片失綠黃化，受害根部主根與側根尖處出現大小不一的根結，呈現不規則隆起或錘狀腫脹，但典型特點是呈鉤狀或靴狀（圖1a，?b）。在體視鏡下解剖根部根結，可見根內有1至多個根結線蟲未成熟雌蟲。經調查發現受害地塊毛豆發病率為78%。

2.2?線蟲的形態學特征

雌蟲呈球形、梨形或橢圓形，乳白色，頸部細長，多數雌蟲尾部稍隆起（圖1c）。會陰花紋整體呈橢圓形，背弓中等偏低，側區側線不明顯，會陰花紋整體線紋較為連續且平滑，背區線紋會被細碎的短線紋截斷，形成不規則的條溝，似人為撕裂般;側尾腺孔小，明顯，間距窄，小于陰門裂長度（圖1d～g）。

毛豆根結線蟲形態測量值見表1。通過形態鑒定，除2齡幼蟲b值［（4.5～6.7）?μm?vs?（2.9～4.0）?μm］和雄蟲最大體寬［（40.3～50.5）?μm?vs?（24.0～34.7）?μm］偏大以外，其余測量值均與擬禾本科根結線蟲的描述相符［19］。

1）?表中數據為平均值±標準差。n：標本個數;L：體長;a：體長/體寬;b：體長/唇至食道腺與腸交界處的長度;b′：體長／唇到食道腺末端的長度;DGO：背食道腺開口至口針基球的距離;PHPH：兩側尾腺孔的距離;APH：肛門到兩側尾腺孔中心點的長度;VA：陰門至肛門的長度;H：尾部透明區長度。

Data?are?mean±SD.?n：?Number?of?specimens?measured;?L：?Body?length;?a：?Body?length/body?width;?b：?Body?length/length?from?the?lip?to?the?junction?of?esophageal?gland?and?intestine;?b′：?Body?length/length?from?the?lip?to?esophageal?gland?end;?DGO：?The?distance?from?dorsal?esophageal?gland?orifice?to?the?stylet?base;?PHPH：?Length?of?two?phasmids;?APH：?Length?from?anus?to?the?midpoint?of?phasmids;?VA：?Length?from?vulva?to?anus;?H：?Length?of?tail?hyaline?portion.

2.3?毛豆根結線蟲種群在水稻上的繁殖

將毛豆上分離的單卵囊接種在水稻‘汕優016’上30?d后，根尖頂端有明顯的錘狀、鉤狀或靴狀的根結（圖1h），根結內有卵囊、雌蟲與孵化的幼蟲，表明水稻品種‘汕優016’是根結線蟲的良好寄主。

2.4?分離線蟲對毛豆的致病性

接種后30?d對盆栽毛豆進行檢查，接種根結線蟲的處理植株明顯矮化，只有未接種線蟲對照株高的70%左右（圖1i），清洗毛豆的根部，對照株無根結，根細長、多，而處理株毛豆的根數量少，根長只有對照株的40%左右（圖1j），根結與田間毛豆的根結癥狀相似，根系發生不同程度的腫脹，并呈鉤狀或靴狀，從根結處可進一步長出細根，可再受侵染，有的根結呈蘿卜狀（圖1k，?l）。體視鏡下對根結進行解剖，可觀察到根內雌蟲、雄蟲及卵粒，雌蟲尾尖稍有隆起，與田間擬禾本科根結線蟲雌蟲形態一致，研究結果表明分離的根結線蟲對毛豆具有致病性。

2.5?田間稻茬根上根結及分離的根部線蟲

前作稻茬根際土壤每50?g中分離的根結線蟲2齡幼蟲數量33.5～125.4?（平均73.3）條;稻茬根用自來水沖洗后發現，12個稻茬中有7個在根部前端有少許根結（圖1m），將沒有根結的褐根剖檢，未見雌蟲或卵囊，可見2齡幼蟲游離出，剪碎后均分離到根結線蟲2齡幼蟲，6.40～38.6?（平均22.4）?條/g。將2齡幼蟲接種于水稻‘汕優016’根部，30?d后有明顯根結產生。

2.6?分離線蟲的分子生物學鑒定

毛豆與稻茬的根結卵囊孵化的2齡幼蟲，經rDNAITS區與28S?D2D3區序列擴增，得到6條序列，并上傳GenBank，獲得登錄號。分別為rDNAITS區：ON024384（毛豆），ON024385（毛豆）;ON024382（水稻），與擬禾本科根結線蟲（MT159689、MN647545、KR604730）的序列相似性達98.27%～99.31%;28S?D2D3區：ON032632（毛豆），ON032633（毛豆）;ON032630（水稻），均與擬禾本科根結線蟲（MT159675、KF751066、MW490724）的序列相似性達99.61%～100%。采用貝葉斯法和極大似然法，基于ITS區和28S?D2D3區序列所構建的系統進化樹顯示，毛豆根結線蟲與其他擬禾本科根結線蟲種群位于一個進化分支（PP/BS=1/100）中，并與其他根結線蟲明顯區分（圖2a，b），因此將其鑒定為擬禾本科根結線蟲。

利用擬禾本科根結線蟲特異性引物MgF/MgR，對毛豆根結線蟲雌蟲、稻茬根部分離雌蟲、稻茬根內及土壤中分離的2齡幼蟲分別進行PCR檢測，所有樣本均得到369?bp的目的條帶，這一結果與文獻報道［18］相符，對照象耳豆根結線蟲未有條帶，進一步證明了寄生毛豆與水稻上的根結線蟲為擬禾本科根結線蟲。

3?結論與討論

本研究從福建省漳州地區發現毛豆根結線蟲，通過形態學、分子生物學與致病性測定，明確為擬禾本科根結線蟲，這是福建省首次發現該線蟲為害毛豆，且造成嚴重危害;這是我國繼海南省發現擬禾本科根結線蟲為害毛豆［8］的第二次發現，表明一些毛豆品種是擬禾本科根結線蟲的易感寄主品種，可造成嚴重損失。我國現有的毛豆品種種類眾多，包括本地選育品種和從中國臺灣、日本等地引進的品種［2］，但毛豆品種對于擬禾本科根結線蟲的感抗性尚無人研究。

擬禾本科根結線蟲廣泛分布于熱帶與亞熱帶地區，其寄主廣泛，可侵染禾本科、十字花科等的100多種植物，是水稻上的最重要的病原線蟲之一，又被稱為水稻根結線蟲［20］。該線蟲在我國最早于海南的蔥Allium?fistulosum［21］上發現，后相繼在福建［22］、湖北［23］、湖南［24］、江蘇［25］、浙江［26］、江西［27］、四川［28］等省份水稻種植區發生。本研究中毛豆基地的前季作物為水稻‘汕優016’，8月份收割后即開始翻地整壟播種毛豆，出苗后9?d即發現嚴重根結，發病株率高達78%，由于水源為干凈溪水，因此判斷初侵染源應來自田間。但調查中農戶反映前季水稻生長正常，產量符合預期，并未出現擬禾本科根結線蟲造成水稻黃化、矮化、結實少等嚴重癥狀。作者田間調查發現殘留稻茬根系只有少許根結，但在田間殘留稻茬根系內及田間土壤均分離到較大量的2齡幼蟲，經接種試驗與分子生物學檢測鑒定為擬禾本科根結線蟲，表明其初侵染來源于前季水稻根系和土壤。擬禾本科根結線蟲為定居型內寄生線蟲，卵囊可產在水稻根內，2齡幼蟲可遷移至土壤或在根內直接遷移、繁殖［20，29］。擬禾本科根結線蟲能夠侵染旱稻、灌溉稻、深水稻、低洼地水稻，但其適合在濕度32%、溫度22～29℃的土壤中生長，在長期淹水

狀態下2齡幼蟲無法侵染且生長會受到抑制，在淹水狀態下不能侵入根系而以卵或2齡幼蟲在根內或土壤中長期存活，2齡線蟲數量在4個月后會下降嚴重，但卵塊可存活至少14個月［3031］。從本研究結果來分析，發生地前季水稻為灌溉稻，水稻根部可能在育秧期或苗期淺水階段受到擬禾本科根結線蟲的侵染并繁殖，但因水稻生育期內持續灌溉或間歇灌溉為常態，線蟲種群以卵或2齡幼蟲在根內或土壤中長期存活，并未對水稻產量或外觀造成明顯影響，后成為下一季輪作毛豆的初侵染源。毛豆在南方省份廣泛種植，為提高土地產出率和經濟效益，減少連作障礙與土傳病害，毛豆與其他作物輪作成為重要的栽培模式［3235］。如福建省曾有直播稻苗發生嚴重的擬禾本科根結線蟲為害［36］，其侵染源來自前季蔬菜;成都平原水稻與蔬菜輪作田間擬禾本科根結線蟲檢出率為40.9%［37］。因此隨著毛豆稻或菜輪作栽培模式的普遍推廣，毛豆擬禾本科根結線蟲病問題可能會普遍發生。對于該線蟲病的防控，可因地制宜選用抗性品種、農業防治、化學防治等綜合措施。選用抗病的毛豆品種最為經濟、有效，不同毛豆品種對于該線蟲的抗性差異明顯，但尚未有系統測定。利用水旱輪作是減少擬禾本科根結線蟲病最直接、有效的措施之一，可通過水稻田長期淹水達到減少或消滅線蟲種群數量的目的［20］;必要時在整畦時或毛豆苗期施用阿維菌素顆粒、噻唑膦顆粒等殺線蟲劑。

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（責任編輯：楊明麗）