復(fù)合木霉制劑防治黃連根腐病及其機(jī)理研究

伍曉麗 王鈺 劉飛 陳大霞

摘要

為評(píng)價(jià)復(fù)合木霉制劑對(duì)黃連根腐病的防治效果，并揭示其防病機(jī)理，為黃連根腐病專用微生物農(nóng)藥的研發(fā)奠定基礎(chǔ)，本試驗(yàn)將深綠木霉Trichoderma?atroviride、長(zhǎng)枝木霉T.longibrachiatum、鉤狀木霉T.hamatum、擬康寧木霉T.koningiopsis等4種木霉配制的復(fù)合制劑和尖鐮孢Fusarium?oxysporum以不同的方式分別施用于黃連，統(tǒng)計(jì)根腐病發(fā)生情況，檢測(cè)黃連根部防御酶活性，用高通量測(cè)序分析根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，復(fù)合木霉制劑對(duì)尖鐮孢導(dǎo)致的根腐病具有明顯預(yù)防效果;復(fù)合木霉制劑和尖鐮孢分別接種黃連可提高SOD、POD、CAT、PAL、PPO等防御性酶活性，產(chǎn)生誘導(dǎo)抗性;而它們先后接種黃連可產(chǎn)生強(qiáng)化效應(yīng)，從另一個(gè)途徑提高植株抗病性。復(fù)合木霉制劑和尖鐮孢都會(huì)降低真菌的數(shù)量、多樣性，和某些真菌的相對(duì)豐度，而復(fù)合木霉制劑的抑菌作用更強(qiáng)烈，尤其能明顯抑制尖鐮孢、Ilyonectria?sp.等病原真菌的生長(zhǎng)，且能改善土壤真菌群落結(jié)構(gòu)。木霉和尖鐮孢都能在土壤中較長(zhǎng)期定殖。可見，復(fù)合木霉制劑可以預(yù)防尖鐮孢導(dǎo)致的黃連根腐病，防病機(jī)理包括誘導(dǎo)黃連植株產(chǎn)生抗性，接種后再遭受病原菌侵染產(chǎn)生的強(qiáng)化效應(yīng)，優(yōu)化土壤真菌群落結(jié)構(gòu)，抑制土壤中病原菌等，且有效期較長(zhǎng)。因此復(fù)合木霉制劑具有開發(fā)為微生物農(nóng)藥防治黃連根腐病的潛力。

關(guān)鍵詞

復(fù)合木霉制劑;?黃連根腐病;?根際土壤;?防御酶活性;?真菌群落結(jié)構(gòu)

中圖分類號(hào)：

S?476

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2022783

Control?of?Coptis?chinensis?root?rot?disease?by?compound?Trichoderma?agent?and?its?mechanism

WU?Xiaoli1，?WANG?Yu1，?LIU?Fei2，?CHEN?Daxia1*

（1.?Institute?of?Medical?Material?Planting，Chongqing?Academy?of?Chinese?Materia?Medica，?Chongqing?Subcenter?of?

National?Resource?Center?for?Chinese?Materia?Medica，?China?Academy?of?Chinese?Medical?Sciences，?Chongqing?Key?

Laboratory?of?Chinese?Medicine?Resources，?Chongqing?Engineering?Research?Center?for?Fine?Variety?Breeding?

Techniques?of?Chinese?Materia?Medica，Chongqing?400065，?China;?2.?Health?Center?of?Chongqing?Academy?of?

Chinese?Materia?Medica，?Chongqing?400065，?China）

Abstract

To?evaluate?the?effect?of?compound?Trichoderma?agent?on?Coptis?chinensis?root?rot，?investigate?its?mechanism?and?provide?a?theoretical?basis?for?developing?special?microbial?pesticides?against?this?disease，?compound?Trichoderma?agent，?consisting?of?Trichoderma?atroviride，?T.longibrachiatum，?T.hamatum?and?T.koningiopsis，?and?Fusarium?oxysporum?were?applied?to?C.chinensis?plants，?respectively.?The?root?rot?symptoms?were?observed;?the?root?defensive?enzyme?activities?were?determined，?and?fungal?communities?in?the?rhizosphere?soil?were?analyzed?by?highthroughput?sequencing.?The?results?indicated?that?compound?Trichoderma?agent?had?obvious?preventive?effect?on?root?rot?caused?by?F.oxysporum.?Compound?Trichoderma?agent?and?F.oxysporum，?when?applied?respectively，?could?increase?the?activities?of?SOD，?POD，?CAT，?PAL?and?PPO，?inducing?the?plants’?resistance，?while?strengthening?effect?was?observed?when?compound?Trichoderma?agent?and?F.oxysporum?were?applied?successively，?improving?plant?resistance?by?other?means.?Both?compound?Trichoderma?agent?and?F.oxysporum?decreased?the?number?and?diversity?of?fungi?and?relative?abundance?of?some?fungi.?Compared?with?F.oxysporum，?compound?Trichoderma?agent?had?stronger?fungistatic?activity，?inhibited?pathogenic?fungi?such?as?F.oxysporum，?Ilyonectria?sp.，?and?improved?soil?fungal?community?structure.?Both?Trichoderma?sp.?and?F.?oxysporum?could?inhabit?soil?for?a?long?time.?Therefore，?compound?Trichoderma?agent?could?prevent?root?rot?disease?caused?by?F.oxysporum.?The?diseaseresistant?mechanism?included?induced?resistance，?strengthening?effect?induced?by?pathogen?after?inoculation?with?compound?Trichoderma?agent，?optimizing?the?fungal?community，?inhibiting?soil?pathogens，?etc.?Besides，?compound?Trichoderma?agent?had?relatively?long?term?of?validity.?In?sum，?compound?Trichoderma?agent?had?the?potential?as?microbial?pesticide?against?C.chinensis?root?rot?disease.

Key?words

compound?Trichoderma?agent;?Coptis?chinensis?root?rot?disease;?rhizosphere?soil;?defensive?enzyme?activities;?fungal?communities

黃連Coptis?chinensis?Franch.?是毛茛科Ranunculaceae黃連屬Coptis多年生草本植物，以干燥根莖入藥，是中國(guó)常用大宗藥材之一。含有生物堿、香豆素、木脂類化合物、有機(jī)酸、甾體、黃酮、揮發(fā)油、樹脂、淀粉、鞣質(zhì)等物質(zhì)，具有保護(hù)心腦血管、降糖、抗炎、抗腫瘤等藥理作用［1］。黃連主產(chǎn)于中國(guó)重慶、四川、湖北等省，重慶石柱是黃連最大產(chǎn)區(qū)，占我國(guó)黃連產(chǎn)量的60%，世界產(chǎn)量的40%［2］。根腐病是黃連的主要病害，近十幾年來在各大黃連主產(chǎn)區(qū)大面積暴發(fā)。發(fā)病時(shí)，從須根開始腐爛，逐步蔓延至主根，葉片枯萎，最后整株死亡。嚴(yán)重時(shí)，整塊地黃連全部死亡，經(jīng)濟(jì)損失最高達(dá)到3萬～4萬元/667m2。很多農(nóng)民放棄種植，產(chǎn)區(qū)大面積萎縮。目前該病已成為制約黃連種植業(yè)發(fā)展的瓶頸。黃連根腐病的病原菌有很多種，主要是真菌，包括尖鐮孢Fusarium?oxysporum、三線鐮孢F.tricinctum［3］、腐皮鐮孢F.solani［4］、Ilyonectria?liliigena、毀滅柱孢菌I.destructans［5］、Pythium?macrosporum［6］等。其中尖鐮孢分離頻率高，致病力強(qiáng)，是主要的致病菌之一。目前黃連根腐病主要用物理方法和化學(xué)方法進(jìn)行防治，但幾乎沒有效果，且對(duì)環(huán)境和藥材造成污染。

木霉是一類有益真菌，存在于土壤中，至少對(duì)18個(gè)屬29種病原真菌有拮抗作用［7］。國(guó)內(nèi)外對(duì)其生防功能開展了大量研究，發(fā)現(xiàn)木霉對(duì)多種植物病害均有很好的防治效果。且兼具促生、修復(fù)土壤等作用，鑒于木霉具有以上功能，很多木霉菌株被開發(fā)為微生物農(nóng)藥，用于代替化學(xué)農(nóng)藥，以降低農(nóng)藥殘留，減少對(duì)環(huán)境的污染和對(duì)人體的危害［8］。項(xiàng)目組前期研究發(fā)現(xiàn)，有4株木霉對(duì)尖鐮孢導(dǎo)致的黃連根腐病具有較好的防治效果，且這4株木霉相互間拮抗作用不明顯。研究表明，在實(shí)際應(yīng)用中含多種菌株的復(fù)合制劑在環(huán)境適應(yīng)性、效果穩(wěn)定性等方面比單一菌株更有優(yōu)勢(shì)［9］，因此，本研究擬將這4株木霉配制成復(fù)合制劑施用于黃連，評(píng)價(jià)其對(duì)尖鐮孢導(dǎo)致的根腐病的防治效果，并分析其對(duì)黃連根部防御酶活性和根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響，以揭示其防病機(jī)理，為黃連根腐病專用微生物農(nóng)藥的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?材料

木霉菌種：?深綠木霉Trichoderma?atroviride、長(zhǎng)枝木霉T.longibrachiatum、鉤狀木霉T.hamatum和擬康寧木霉T.koningiopsis均為實(shí)驗(yàn)室保存菌種。

病原菌：尖鐮孢F.oxysporum菌株分離自根腐病黃連須根。

供試黃連植株和土壤：在重慶市石柱縣楓木鎮(zhèn)黃連基地（108°46′E，?30°25′N，?海拔1?366?m），取播種后生長(zhǎng)1年的健康黃連幼苗和移栽后生長(zhǎng)2年的健康黃連植株（植株帶根際土），同時(shí)收集取樣點(diǎn)表層10～15?cm土壤（沙壤土，有機(jī)質(zhì)?21.53?g/kg，堿解氮?209.00?mg/kg，有效磷55.03?mg/kg，有效鉀260.86?mg/kg，pH?5.32）。

1.2?復(fù)合木霉制劑對(duì)黃連根腐病的防治作用

麥粒清水中浸泡24?h，瀝干水分，與濕潤(rùn)木屑按麥粒∶木屑=1∶10混合，裝500?mL罐頭瓶，121℃滅菌1 h，?24?h后再滅菌1?h，冷卻，分別接入4種木霉菌種，25℃避光培養(yǎng)，直至菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)基質(zhì)，4種木霉的培養(yǎng)物等量混合成木霉固體混合制劑備用;同樣方法制備尖鐮孢固體制劑;長(zhǎng)寬各6?cm，高7?cm的花缽用1‰高錳酸鉀溶液浸泡1?h消毒，流水沖洗后瀝干備用;泥炭蘚土在120℃下烘3?h，24?h后同樣溫度和時(shí)間再烘1次，無菌水潤(rùn)濕，冷卻備用;黃連幼苗清水洗凈根部泥土備用。進(jìn)行以下5個(gè)處理：

復(fù)合木霉制劑處理：接種復(fù)合木霉固體制劑2?g/缽，?灌施無菌水25?mL/缽定根。72?h后接種滅菌的空白麥粒木屑培養(yǎng)基2?g/缽。

尖鐮孢處理：接種尖鐮孢固體制劑2?g/缽，?灌施無菌水25?mL/缽定根。72?h后接種滅菌的空白麥粒木屑培養(yǎng)基2?g/缽。

復(fù)合木霉制劑+尖鐮孢處理：先接種復(fù)合木霉固體制劑2?g/缽，?灌施無菌水25?mL/缽定根。72?h后接種尖鐮孢固體制劑2?g/缽。

尖鐮孢+復(fù)合木霉制劑處理：先接種尖鐮孢固體制劑2?g/缽，?灌施無菌水25?mL/缽定根。72?h后接種復(fù)合木霉固體制劑2?g/缽。

清水對(duì)照：灌施無菌水25?mL/缽定根。

接種方式：花缽底部先放置少量泥炭蘚土，栽培黃連幼苗1株/缽，根據(jù)不同處理取復(fù)合木霉固體制劑或尖鐮孢固體制劑，與基質(zhì)混合，填入苗周圍，澆無菌水定根，放置在陰涼通風(fēng)處恢復(fù)。每重復(fù)22株（其中12株用于測(cè)定防御酶活性，其余10株調(diào)查發(fā)病情況），每處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。5?d后將黃連植株移至溫室，L∥D=10?h∥14?h，光照時(shí)溫度設(shè)置為25℃，光照強(qiáng)度為1?500?lx，黑暗時(shí)溫度設(shè)置為20℃，生長(zhǎng)30?d后統(tǒng)計(jì)黃連根腐病發(fā)病率、病情指數(shù)、防效等。病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下：0級(jí)，無腐爛根;1級(jí)，1%～20%的須根腐爛;2級(jí)，21%～40%的須根腐爛;3級(jí)，41%～60%的須根腐爛;4級(jí)，61%～80%的須根腐爛;5級(jí)：81%～100%的須根腐爛。

發(fā)病率=患根腐病黃連株數(shù)黃連總株數(shù)×100%;

病情指數(shù)=∑（各級(jí)病株數(shù)×相應(yīng)級(jí)值）調(diào)查總株數(shù)×最高級(jí)別值;

防效=對(duì)照區(qū)病情指數(shù)-處理區(qū)病情指數(shù)對(duì)照區(qū)病情指數(shù)×100%。

1.3?黃連根部防御酶活性檢測(cè)

取復(fù)合木霉制劑、尖鐮孢、復(fù)合木霉制劑+尖鐮孢、清水對(duì)照這4個(gè)處理的須根測(cè)防御酶活性。分別在第一次處理后的72、120、168、216?h，每處理每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取3株須根，無菌水洗凈，無菌濾紙吸干水分，混合成一個(gè)樣本，立即放液氮保存，每處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，共計(jì)48個(gè)樣本。送蘇州科銘生物技術(shù)有限公司采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)防御酶活性：過氧化氫酶（catalase，CAT）采用H2O2催化法［10］，過氧化物酶（peroxidase，POD）采用愈創(chuàng)木酚法［11］，超氧化物歧化酶（superoxide?dismutase，SOD）采用WST8法［12］，苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine?ammonia?lyase，PAL）采用L苯丙氨酸催化法［13］，多酚氧化酶（polyphenol?oxidase，PPO）采用鄰苯二酚催化法［14］。

1.4?復(fù)合木霉制劑對(duì)根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響

菌種培養(yǎng)同1.2，只是待菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)基質(zhì)后，1?;000?lx光照下培養(yǎng)96?h使培養(yǎng)料長(zhǎng)滿分生孢子。無菌水洗下培養(yǎng)物，4層滅菌紗布過濾出孢子，無菌水稀釋至1×108?cfu/mL，4種木霉的孢子懸浮液等體積混合制作復(fù)合木霉液體制劑。用同樣方式制作尖鐮孢液體制劑。

試驗(yàn)采用盆栽，將直徑20?cm，高25?cm的塑料缽用1‰高錳酸鉀溶液浸泡1?h消毒，清水洗凈。裝取樣點(diǎn)收集的土壤3.5?kg/缽，2年生黃連植株帶根際土移栽入缽，1株/缽，澆透無菌水。20?d后待黃連適應(yīng)環(huán)境即進(jìn)行如下處理：

復(fù)合木霉制劑處理：?復(fù)合木霉液體制劑灌施黃連根部，25?mL/缽。

復(fù)合木霉制劑+尖鐮孢處理：?復(fù)合木霉液體制劑灌施黃連根部，25?mL/缽，3?d后施入尖鐮孢液體制劑25?mL/缽。

尖鐮孢處理：?尖鐮孢液體制劑灌施黃連根部，25?mL/缽。

清水對(duì)照：?無菌水灌施黃連根部，25?mL/缽。

每重復(fù)3缽，每個(gè)處理設(shè)置5個(gè)重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。試驗(yàn)在溫室中進(jìn)行，L∥D=10?h∥14?h，光照時(shí)溫度設(shè)置為20℃，光照強(qiáng)度為1?500?lx，黑暗時(shí)溫度設(shè)置為15℃［15］。適時(shí)澆無菌水保濕，60?d后取土樣，抖掉根部松散的土壤，取與根部緊密結(jié)合的土壤，每個(gè)重復(fù)3株黃連的根際土壤混合為一個(gè)樣本，共計(jì)20個(gè)樣本。

土壤真菌檢測(cè)由北京諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行，采用?CTAB?法提取土壤樣本的基因組DNA，以ITS51737F（5′GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG3′）和ITS22043R：?（5′GCTGCGTTC

TTCATCGATGC3′）［16］為引物對(duì)ITS15F片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR?反應(yīng)體系（30?μL）：Phusion?Master?Mix（2×）15?μL，上、下游引物（2?μmol/L）各1.5?μL，gDNA（1?ng/μL）10?μL，H2O?2?μL。擴(kuò)增條件：98℃?預(yù)變性1?min;98℃?10?s，50℃?30?s，72℃?30?s，30個(gè)循環(huán);72℃?5?min。

PCR產(chǎn)物進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫(kù)在Illumina?Nova?Seq?6000平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。用Qiime軟件（Version?1.9.1）中的BLAST方法（http：∥qiime.org/scripts/assigntaxonomy.html）與Unit（v?8.2）數(shù)據(jù)庫(kù)（https：∥unite.ut.ee/）進(jìn)行物種注釋分析，并分別在各個(gè)分類水平統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。使用MUSCLE（Version?3.8.31，http：∥www.drive5.com/muscle/）軟件進(jìn)行快速多序列比對(duì)，最后對(duì)各樣本的數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理。用QIIME軟件?（version?1.9.1）?計(jì)算alphadiversity，用?R軟件?（version?2.15.3）?繪制稀釋曲線和PCoA圖以評(píng)價(jià)betadiversity。

1.5?數(shù)據(jù)處理

用Excel?2019記錄數(shù)據(jù)，用SPSS?20.0中的LSD法進(jìn)行多重比較。

2?結(jié)果與分析

2.1?復(fù)合木霉制劑對(duì)黃連根腐病的防治效果

復(fù)合木霉制劑對(duì)黃連根腐病的防治試驗(yàn)結(jié)果顯示，復(fù)合木霉制劑+尖鐮孢處理的新葉數(shù)顯著高于尖鐮孢（0.01<P<0.05），復(fù)合木霉制劑+尖鐮孢和清水對(duì)照、復(fù)合木霉制劑處理的植株干重顯著或極顯著高于尖鐮孢和尖鐮孢+復(fù)合木霉制劑處理（0.01<P<0.05?或P<0.01）。尖鐮孢和尖鐮孢+復(fù)合木霉制劑處理的根腐病發(fā)病率、病情指數(shù)顯著或極顯著高于其余3個(gè)處理（0.01<P<0.05?或P<0.01）。復(fù)合木霉制劑+尖鐮孢處理的防治效果極顯著高于尖鐮孢+復(fù)合木霉制劑（P<0.01）。尖鐮孢處理的發(fā)病率極顯著高于尖鐮孢+復(fù)合木霉制劑（P<0.01）。復(fù)合木霉制劑+尖鐮孢和清水對(duì)照、復(fù)合木霉制劑處理的各指標(biāo)間沒有顯著差異（P>0.05）（表1）。可見復(fù)合木霉制劑對(duì)黃連根腐病有明顯的預(yù)防效果，但治療效果不佳。

1）?CTA：?復(fù)合木霉制劑;?FU：?尖鐮孢。FU+CTA：?先施用FU再施用CTA;?CTA+FU：?先施用CTA再施用FU。表中同列不同小寫和大寫字母分別表示經(jīng)單因素方差分析和LSD法多重比較在0.05和0.01水平差異顯著。表2同。

CTA：?Compound?Trichoderma?agent;?FU：?Fusarium?oxysporum.?FU+CTA：?Applying?FU?first?and?then?CTA;?CTA+FU：?Applying?CTA?first?and?then?FU.?Different?small?and?capital?letters?in?the?same?column?indicate?significant?differences?（P<0.05）?and?extremely?significant?differences?（P<0.01），?respectively，?based?on?Oneway?ANOVA?and?LSD?multiple?comparison.?The?same?applies?in?Table?2.

2.2?復(fù)合木霉制劑對(duì)黃連根部防御酶活性的影響

復(fù)合木霉制劑和尖鐮孢都有刺激根部防御酶活性的作用，不同的處理對(duì)各種防御酶有不同的影響。SOD酶活性在尖鐮孢處理后120?h達(dá)到最高值，且極顯著高于其余3個(gè)處理（P<0.01），然后降低，在216?h稍有升高，顯著或極顯著高于其余3個(gè)處理（0.01<P<0.05?或P<0.01）。復(fù)合木霉制劑+尖鐮孢處理后黃連根部SOD在72?h顯著或極顯著高于其余3個(gè)處理（0.01<P<0.05?或P<0.01），此后降低，在168?h時(shí)達(dá)最高峰，極顯著高于其余3個(gè)處理（P<0.01）。而復(fù)合木霉制劑處理對(duì)SOD活性的影響不明顯（圖1）。

黃連根部POD酶活性在復(fù)合木霉制劑處理后72?h達(dá)最高峰，極顯著高于尖鐮孢和清水對(duì)照（P<0.01），在120?h顯著高于清水對(duì)照（0.01<P<0.05），此后下降;復(fù)合木霉制劑+尖鐮孢處理的POD酶活在72、120?h都極顯著高于清水對(duì)照（P<0.01），在120、168?h顯著或極顯著高于尖鐮孢和復(fù)合木霉制劑處理（0.01<P<0.05?或P<0.01），此后下降;尖鐮孢處理的POD酶活在72?h時(shí)顯著高于清水對(duì)照（0.01<P<0.05），在216?h顯著高于復(fù)合木霉制劑和復(fù)合木霉制劑+尖鐮孢處理（P<0.05）（圖2）。

圖1?復(fù)合木霉制劑處理對(duì)黃連根部SOD活性的影響

Fig.1?The?effect?of?compound?Trichoderma?agent?on?SOD?activity?in?Coptis?chinensis?root

圖2?復(fù)合木霉制劑處理對(duì)黃連根部POD活性的影響

Fig.2?The?effect?of?compound?Trichoderma?agent?on?POD?activity?in?Coptis?chinensis?root

復(fù)合木霉制劑處理的黃連根部CAT酶活性在72?h和120?h極顯著高于尖鐮孢和清水對(duì)照（P<0.01），此后下降;尖鐮孢處理的CAT酶活性在120?h極顯著高于清水對(duì)照和復(fù)合木霉制劑+尖鐮孢處理（P<0.01），在216?h極顯著高于復(fù)合木霉制劑處理和復(fù)合木霉制劑+尖鐮孢處理（P<0.01）;復(fù)合木霉制劑+尖鐮孢處理的CAT酶活在72?h極顯著高于尖鐮孢處理和清水對(duì)照（P<0.01）（圖3）。

圖3?復(fù)合木霉制劑處理對(duì)黃連根部CAT活性的影響

Fig.3?The?effect?of?compound?Trichoderma?agent?on?CAT?activity?in?Coptis?chinensis?root

復(fù)合木霉制劑處理對(duì)黃連根部PAL酶活性的影響不明顯;尖鐮孢處理的PAL酶活在72?h極顯著高于清水對(duì)照（P<0.01）;復(fù)合木霉制劑+尖鐮孢處理的PAL酶活在72、168、216?h都極顯著高于清水對(duì)照（P<0.01），在120、168、216?h都極顯著高于尖鐮孢（P<0.01），在168、216?h都顯著或極顯著高于復(fù)合木霉制劑處理（0.01<P<0.05或P<0.01）（圖4）。

圖4?復(fù)合木霉制劑處理對(duì)黃連根部PAL活性的影響

Fig.4?The?effect?of?compound?Trichoderma?agent?on?PAL?activity?in?Coptis?chinensis?root

復(fù)合木霉制劑處理對(duì)黃連根部PPO酶活性的影響不明顯;尖鐮孢處理的PPO酶活在120?h極顯著高于其余3個(gè)處理（P<0.01）;復(fù)合木霉制劑+尖鐮孢處理的PPO酶活在120?h極顯著高于復(fù)合木霉制劑處理（P<0.01），在168?h極顯著高于其余3個(gè)處理（P<0.01）（圖5）。

從以上結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，復(fù)合木霉制劑處理可以提高黃連根部部分防御酶活性，誘導(dǎo)黃連產(chǎn)生抗性;而復(fù)合木霉制劑和尖鐮孢先后作用于黃連會(huì)產(chǎn)生明顯的強(qiáng)化效應(yīng)，從另一個(gè)途徑提高抗病性。

2.3?復(fù)合木霉制劑對(duì)黃連根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1?對(duì)根際土壤真菌多樣性的影響

20個(gè)土壤樣本真菌高通量測(cè)序共獲得2?034?015條raw?tags，處理后得到effective?tags?1?307?286條，平均有效率為64.27%，對(duì)所有樣本的effective?tags以97%的一致性進(jìn)行OTUs聚類，共獲得24?549?個(gè)OTUs。20個(gè)樣本可注釋的真菌OTUs分屬于18個(gè)門，73個(gè)綱，183個(gè)目，429個(gè)科，942個(gè)屬，1?458個(gè)種。當(dāng)測(cè)序量超過10?000讀長(zhǎng)時(shí)，雖仍有新的OUTs出現(xiàn)，但由于曲線均已趨于平緩，表明該樣品取樣基本合理，能夠比較真實(shí)地反映土壤真菌群落多樣性（圖6）。

圖5?復(fù)合木霉制劑處理對(duì)黃連根部PPO活性的影響

Fig.5?The?effect?of?compound?Trichoderma?agent?on?PPO?activity?in?Coptis?chinensis?root

圖6?復(fù)合木霉制劑和尖鐮孢處理后黃連根際土壤真菌高通量測(cè)序結(jié)果的稀釋曲線

Fig.6?The?fungal?dilution?curves?in?Coptis?chinensis?rhizosphere?soil?treated?with?compound?Trichoderma?agent?

and?Fusarium?oxysporum

真菌alphadiversity的評(píng)價(jià)指標(biāo)較多，各指數(shù)表征的意義不同：Observed?species指數(shù)表示直觀觀測(cè)到的物種數(shù)目（也即是OTUs數(shù)目）;Shannon指數(shù)表示樣品中的分類總數(shù)及其占比，群落多樣性越高，物種分布越均勻，Shannon指數(shù)越大;Simpson指數(shù)表征群落內(nèi)物種分布的多樣性和均勻度;Chao1指數(shù)估計(jì)群落樣品中包含的物種總數(shù);ACE指數(shù)估計(jì)群落中OTU數(shù)目。復(fù)合木霉制劑對(duì)黃連根際土壤真菌多樣性具有明顯的影響。復(fù)合木霉制劑和復(fù)合木霉制劑+尖鐮孢處理的Observed?species指數(shù)、?Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)顯著或極顯著低于清水對(duì)照（0.01<P<0.05或P<0.01），?Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)顯著或極顯著低于尖鐮孢處理（0.01<P<0.05或P<0.01）;尖鐮孢處理的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)顯著或極顯著低于清水對(duì)照（0.01<P<0.05或P<0.01）。可見施用復(fù)合木霉制劑和尖鐮孢都會(huì)降低真菌多樣性，而前者作用更強(qiáng)烈（表2）。

就betadiversity而言，主成分分析表明，?PC1和PC2貢獻(xiàn)率分別為58.83%和11.58%。4個(gè)處理的散點(diǎn)區(qū)域基本分別屬于4個(gè)象限，復(fù)合木霉制劑和復(fù)合木霉制劑+尖鐮孢處理散點(diǎn)區(qū)域位置比較接近，它們與其他2個(gè)處理都相距較遠(yuǎn)（圖7）。

2.3.2?對(duì)根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響

復(fù)合木霉制劑處理對(duì)黃連根際土壤的真菌群落結(jié)構(gòu)在門和屬的水平均具有明顯的影響。根際土壤中真菌優(yōu)勢(shì)門是子囊菌門Ascomycota、擔(dān)子菌門Basidiomycota、被孢菌門Mortierellomycota等（圖8）。復(fù)合木霉制劑和復(fù)合木霉制劑+尖鐮孢處理的Ascomycota極顯著高于尖鐮孢和清水對(duì)照（P<0.01），是后者的1.26～1.58倍;而Basidiomycota顯著或極顯著低于尖鐮孢和清水對(duì)照處理（0.01<P<0.05或P<0.01），是后者的44.24%～70.55%;其他Mortierellomycota、壺菌門Chytridiomycota、Aphelidiomycota等在4個(gè)處理間也有顯著或極顯著差異（0.01<P<0.05或P<0.01），大多是清水對(duì)照高于其余3個(gè)處理（圖9）。

根際土壤真菌優(yōu)勢(shì)屬是木霉屬Trichoderma、鐮孢屬Fusarium、被孢霉屬M(fèi)ortierella等（圖10）。復(fù)合木霉制劑處理的Trichoderma極顯著高于尖鐮孢和清水對(duì)照處理（P<0.01），分別是后者的12.39、9.3倍;尖鐮孢處理的Fusarium極顯著高于復(fù)合木霉制劑和清水對(duì)照（P<0.01），分別是后者的5.87、5.98倍;復(fù)合木霉制劑+尖鐮孢處理的Trichoderma極顯著低于復(fù)合木霉制劑（P<0.01），是它的72.45%，但極顯著高于尖鐮孢和清水對(duì)照處理?（P<0.01），分別是它們的8.97、6.74倍;復(fù)合木霉制劑+尖鐮孢處理的Fusarium極顯著低于尖鐮孢（P<0.01），是它的39.37%，而與其他2個(gè)處理沒有顯著差異（P>0.05）。復(fù)合木霉制劑和復(fù)合木霉制劑+尖鐮孢處理的很多其他屬，如土赤殼屬Ilyonectria、Mortierella、Solicoccozyma、短梗蠕孢屬Trichocladium、奧腹菌屬Octaviania、鎖蝴菌屬Clavulina、Paraboeremia等均顯著或極顯著低于清水對(duì)照（0.01<P<0.05或P<0.01）;尖鐮孢處理的少數(shù)其他屬，如Trichocladium、Octaviania等顯著或極顯著低于清水對(duì)照（0.01<P<0.05或P<0.01）（圖11）。

從以上結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，復(fù)合木霉制劑可以優(yōu)化土壤真菌群落結(jié)構(gòu)，競(jìng)爭(zhēng)抑制土壤中Fusarium?sp.、Ilyonectria?sp.等病原真菌的生長(zhǎng)。

3?結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，復(fù)合木霉制劑對(duì)尖鐮孢導(dǎo)致的黃連根腐病有明顯防治作用，可以降低發(fā)病率和病情指數(shù)，減少對(duì)植株生長(zhǎng)發(fā)育的損害。并且在尖鐮孢侵染前接種復(fù)合木霉制劑效果明顯，甚至可以將尖鐮孢的損害程度降低到清水對(duì)照的水平。而在尖鐮孢侵染后再接種復(fù)合木霉制劑，防治效果大幅度下降。魯海菊等［17］的研究表明，提前7?d接種深綠木霉T.atroviride，?再接種枇杷根腐病菌Pestalotiopsis?microspora，對(duì)枇杷根腐病的防治效果高達(dá)80%。而在接種病原菌后7?d接種T.atroviride，防病效果僅為40%。這可能是由于如果先接種病原菌，病原菌在根際優(yōu)先擴(kuò)繁，占據(jù)優(yōu)勢(shì)生態(tài)位，可以抵御木霉的競(jìng)爭(zhēng)，且病原菌侵入黃連根部后，受到根組織的保護(hù)，木霉就難以對(duì)它產(chǎn)生抑制作用;而先接種木霉，木霉在根際和根內(nèi)大量擴(kuò)繁，占據(jù)空間，并分泌抗生素，對(duì)根部形成保護(hù)屏障，同時(shí)木霉還誘導(dǎo)黃連植株產(chǎn)生抗性，從而抵御尖鐮孢的侵染。

植物的防御性酶多種多樣，與植物抗病性密切相關(guān)。本研究中，接種復(fù)合木霉制劑后120?h之內(nèi)黃連根部POD、CAT的活性顯著提高，此后下降。這個(gè)結(jié)果也證實(shí)了先接種復(fù)合木霉制劑防病效果更佳，強(qiáng)調(diào)了預(yù)防的重要性。此外，尖鐮孢處理后黃連植株根部防御酶也快速響應(yīng)。很多植物都會(huì)出現(xiàn)這種病原微生物脅迫誘導(dǎo)的防御酶分泌現(xiàn)象［1819］，這是植物的自我保護(hù)機(jī)制，其分泌酶的種類、時(shí)間和酶活性與植株的抗性相關(guān)［20］，因此在作物、藥材、蔬菜等的抗性育種工作中，接種目標(biāo)病原菌后植株防御性酶活性可以作為所選育出的品種抗性強(qiáng)弱的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一［21］。我們的研究還發(fā)現(xiàn)，復(fù)合木霉制劑和尖鐮孢對(duì)某些防御酶可能具有協(xié)同刺激作用，復(fù)合木霉制劑+尖鐮孢處理168?h時(shí)的黃連根部SOD活性極顯著高于相同時(shí)間點(diǎn)復(fù)合木霉制劑和尖鐮孢單獨(dú)處理，168?h和216?h的PAL活性，120?h和168?h的POD活性均有類似情況。其他研究中也有這類現(xiàn)象，先接種叢枝菌根真菌（AM真菌）再接種黃萎病菌的棉花根部PAL、幾丁質(zhì)酶和POD活性明顯高于單獨(dú)接種AM真菌或黃萎病菌的處理。崔衛(wèi)東等［22］將這種現(xiàn)象稱為強(qiáng)化效應(yīng)，即接種生防菌后形成的生防菌－植株共生體在受到病原菌入侵時(shí)發(fā)生的防御性反應(yīng)得以強(qiáng)化的現(xiàn)象，且這種強(qiáng)化現(xiàn)象不僅表現(xiàn)在防御酶活性方面，在其他方面也表現(xiàn)明顯，先接種?AM?真菌再接種黃萎病菌的棉花根細(xì)胞壁明顯加寬，細(xì)胞顏色加深，導(dǎo)管處產(chǎn)生膠狀物質(zhì)，細(xì)胞壁木質(zhì)化，出現(xiàn)了細(xì)胞壁物質(zhì)的沉積，此外總酚含量明顯提高［22］。因此推斷，復(fù)合木霉制劑+尖鐮孢處理的防御酶活性高于單獨(dú)施用復(fù)合木霉制劑或尖鐮孢的這種現(xiàn)象也屬于強(qiáng)化效應(yīng)的一個(gè)表現(xiàn)。可見，復(fù)合木霉制劑對(duì)黃連的誘導(dǎo)抗性不僅表現(xiàn)在提高防御酶活性，也包括強(qiáng)化效應(yīng)。這也是先接種復(fù)合木霉制劑對(duì)根腐病防治效果更好的原因之一。因此，我們?cè)诖撕蟮狞S連和其他植物的病害防治工作中是否也可以利用強(qiáng)化效應(yīng)，即先施用大量有益真菌誘導(dǎo)植株產(chǎn)生抗性，同時(shí)占據(jù)優(yōu)勢(shì)生態(tài)位，再小劑量接種低侵染力，低競(jìng)爭(zhēng)力的病原菌，人為制造強(qiáng)化效應(yīng)以提高植株抗病性，這是個(gè)值得深入探討的問題。

以上研究結(jié)果對(duì)于指導(dǎo)黃連大田生產(chǎn)中根腐病的防治工作具有重要意義。病原菌從接觸根部到侵入根部，再到表現(xiàn)出癥狀，這個(gè)時(shí)間段即潛伏期，短的只有幾個(gè)月，如有的育苗基地黃連苗因根腐病全部死亡;大田一般在移栽后2～3年開始發(fā)病。而生產(chǎn)上并不重視預(yù)防，連農(nóng)一般都是在發(fā)病初期，即表現(xiàn)出癥狀以后才施用藥劑，此時(shí)病原菌已侵入根內(nèi)，難以殺滅，導(dǎo)致防治效果不佳。鑒于以上情況，建議根腐病應(yīng)該重在預(yù)防，即在播種和移栽前對(duì)苗圃、大田土壤以及種子種苗進(jìn)行提前消毒殺菌，最大限度減少病原入侵植株的幾率。建議搭配施用微生物農(nóng)藥，還可以使植株產(chǎn)生誘導(dǎo)抗性和強(qiáng)化效應(yīng)，進(jìn)一步降低根腐病發(fā)生率。

由于黃連根腐病的病原菌主要是真菌，因此本研究分析復(fù)合木霉制劑對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)的影響。從多樣性指數(shù)看，2個(gè)施用復(fù)合木霉制劑的處理組真菌的數(shù)量和多樣性均降低。真菌群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果也表明，2個(gè)施用復(fù)合木霉制劑的處理很多真菌屬相對(duì)豐度都低于清水對(duì)照，可見復(fù)合木霉制劑對(duì)這些真菌有明顯拮抗作用，其中有些是病原真菌，如Ilyonectria［23］。很多研究均發(fā)現(xiàn)木霉對(duì)真菌有抑制作用，施用哈茨木霉T.harzianum和綠木霉T.virens的樟子松Pinus?sylvestris?var.?mongolica幼苗根際土壤中真菌數(shù)量和alphadiversity均低于對(duì)照［24］;與清水對(duì)照相比，尖鐮孢處理會(huì)降低真菌的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)，而復(fù)合木霉制劑和復(fù)合木霉制劑+尖鐮孢處理后黃連根際土壤中真菌Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)又低于尖鐮孢處理;從真菌群落結(jié)構(gòu)看，尖鐮孢處理組少數(shù)真菌屬相對(duì)豐度低于清水對(duì)照，而2個(gè)施用復(fù)合木霉制劑的處理很多真菌屬相對(duì)豐度都低于清水對(duì)照。以上結(jié)果說明尖鐮孢的大量施入對(duì)某些真菌也有一定的抑制作用，但木霉抑菌譜更廣，抑制作用更強(qiáng)烈;復(fù)合木霉制劑+尖鐮孢處理的真菌Simpson指數(shù)高于復(fù)合木霉制劑;真菌群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果也表明，復(fù)合木霉制劑+尖鐮孢處理的Trichoderma相對(duì)豐度低于復(fù)合木霉制劑，?但高于尖鐮孢和清水對(duì)照。以上結(jié)果揭示了尖鐮孢與木霉在土壤中存在競(jìng)爭(zhēng)，在一定程度上削弱了木霉對(duì)其他真菌的抑制作用，但不能完全抑制木霉的生長(zhǎng);而復(fù)合木霉制劑+尖鐮孢處理的Fusarium相對(duì)豐度低于尖鐮孢，且與其他2個(gè)處理沒有顯著差異，反映出復(fù)合木霉制劑對(duì)尖鐮孢有強(qiáng)烈的抑制作用，甚至將尖鐮孢的豐度降低到了對(duì)照的水平。從PcoA圖可見，復(fù)合木霉制劑+尖鐮孢和復(fù)合木霉制劑處理的散點(diǎn)區(qū)域位置較接近，它們均與尖鐮孢和清水對(duì)照處理差異較大，說明前二者、后二者真菌群落結(jié)構(gòu)差異較小，但這兩組之間真菌群落結(jié)構(gòu)差異較大。也反映了復(fù)合木霉制劑對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)的影響大于尖鐮孢。

在門水平上，復(fù)合木霉制劑和復(fù)合木霉制劑+尖鐮孢處理的Ascomycota相對(duì)豐度高于清水對(duì)照和尖鐮孢處理，而Basidiomycota?的相對(duì)豐度低于這兩個(gè)處理。喬宇穎發(fā)現(xiàn)健康土壤中Ascomycota類真菌更多，而亞健康土壤中Basidiomycota類真菌更多［25］，表明施用復(fù)合木霉制劑的土壤更健康。

在屬水平上，復(fù)合木霉制劑處理的Trichoderma相對(duì)豐度高于尖鐮孢和清水對(duì)照，可見木霉可以在土壤中較長(zhǎng)期定殖;其他研究也發(fā)現(xiàn)木霉可以在土壤中長(zhǎng)期定殖［26］，有的木霉定殖期甚至長(zhǎng)達(dá)150?d［27］;尖鐮孢處理的Fusarium相對(duì)豐度高于復(fù)合木霉制劑和清水對(duì)照，說明尖鐮孢也能在土壤中較長(zhǎng)期生存，對(duì)黃連造成危害。

綜上所述，復(fù)合木霉制劑對(duì)尖鐮孢導(dǎo)致的黃連根腐病有明顯防治效果，且預(yù)防效果優(yōu)于治療效果，其防病機(jī)理包括誘導(dǎo)黃連植株產(chǎn)生抗性、接種復(fù)合木霉制劑后再遭受病原菌侵染產(chǎn)生的強(qiáng)化效應(yīng)、優(yōu)化土壤真菌結(jié)構(gòu)、競(jìng)爭(zhēng)抑制土壤中病原真菌生長(zhǎng)等，且有效期較長(zhǎng)。研究結(jié)果為利用木霉防治黃連根腐病提供了參考。但目前還存在如下問題，室外環(huán)境較室內(nèi)環(huán)境更復(fù)雜，且導(dǎo)致根腐病的還有其病原菌，包括尚未鑒定出的病原。因此，擬進(jìn)一步開展大田試驗(yàn)，評(píng)價(jià)復(fù)合木霉制劑的防治效果，重點(diǎn)評(píng)價(jià)其預(yù)防效果。此外，也計(jì)劃對(duì)強(qiáng)化效應(yīng)在黃連根腐病防治中的應(yīng)用進(jìn)行深入探討。

參考文獻(xiàn)

［1］?黃玲.?黃連化學(xué)成分及有效成分藥理活性的研究進(jìn)展［J］.?中西醫(yī)結(jié)合心血管病電子雜志，?2020，?8（17）：?136137.

［2］?石柱土家族自治縣人民政府.?黃連&nbsp;［EB/OL］.?（20200730）?［20221212］.?http：∥cqszx.gov.cn/zjsz/whly_260/wzsz/202007/t20200730_7738431.html.

［3］?伍曉麗，?王鈺，?劉飛，等.?黃連根腐病鐮刀菌屬病原真菌鑒定［J］.?中國(guó)中藥雜志，?2020，?45（6）：?13231328.

［4］?LU?Xiumei，?LI?Jinglin，?DONG?Jiayu，?et?al.?First?report?of?Fusarium?solani?causing?root?rot?on?Coptis?chinensis?in?southwestern?China?［J］.?plant?Disease，?2014，?98（9）：?1273.?

［5］?伍曉麗，?陳大霞，?劉飛，等.?黃連根腐病土赤殼屬病原真菌的鑒定［J］.?西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，?2021，?34（2）：?299305.

［6］?伍曉麗，?陳大霞，?劉飛，等.?黃連根腐病腐霉屬病原菌鑒定［J］.?西南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），?2021，?43（6）：?3743.

［7］?楊合同，?唐文華，?RYDER?M.?木霉菌與植物病害的生物防治［J］.?山東科學(xué)，?1999（4）：?715.

［8］?BECKER?P，?ESKER?P，?UMANA?G.?Incorporation?of?microorganisms?to?reduce?chemical?fungicide?usage?in?black?sigatoka?control?programs?in?Costa?Rica?by?use?of?biological?fungicides?［J/OL］.?Crop?Protection，?2021，?146：?105657.?DOI：?10.1016/j.cropro.2021.105657.

［9］?王承芳，?陳娟，?曠文豐，等.?復(fù)合木霉菌制劑防治葡萄灰霉病的效果研究［J］.?生物災(zāi)害科學(xué)，?2015，?38（4）：?333338.

［10］李仕飛，?劉世同，?周建平，?等.?分光光度法測(cè)定植物過氧化氫酶活性的研究［J］.?安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，?2007（2）：?7273.

［11］段秋笛，?楊旭，?趙焱，?等.?連香樹花芽發(fā)育過程中的生理生化特性研究［J］.?湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，?2022，?61（22）：?8993.

［12］楊加亮，?田云恒，?馬愛民.?虎奶菇MnSOD提取，鑒定及基因的克隆［J］.?食品工業(yè)科技，?2020，?41（15）：?150157.

［13］李楠，?熊彬，?張?jiān)崎_，?等.?L苯丙氨酸解氨酶產(chǎn)生菌分離及酶促反應(yīng)研究［J］.?食品科學(xué)，?2005，?26（12）：?7477.

［14］劉倩，?張慜，?容小紅，?等.?熱燙前處理對(duì)青菜中酶活性及色澤的影響［J］.?食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，?2013，?32（10）：?10311036.

［15］黃正方，?楊美全，?孟忠貴，?等.?黃連生物學(xué)特性和主要栽培技術(shù)［J］.?西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，?1994（3）：?299303.

［16］呂貝貝，?張貴云，?張麗萍，?等.?油菜根際及生物熏蒸對(duì)連作土壤真菌群落的影響［J］.?北方園藝，?2020（10）：?95103.

［17］魯海菊，?沈云玫，?陶宏征，?等.?內(nèi)生木霉P3.9菌株的多功能性及其枇杷根腐病的盆栽防效［J］.?西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，?2017，?26（11）：?16811688.

［18］SHORESH?M，?HARMAN?G?E，?MASTOURI?F.?Induced&nbsp;systemic?resistance?and?plant?responses?to?fungal?biocontrol?agents?［J］.?Annual?Review?of?Phytopathology，?2010，?48（1）：?2143.

［19］SPANIC?V，?VULETIC?M?V，?ABICIC?I，?et?al.?Early?response?of?wheat?antioxidant?system?with?special?reference?to?Fusarium?head?blight?stress?［J］.?Plant?Physiology?and?Biochemistry，?2017，?115：?3443.

［20］何婷，?劉太國(guó)，?陳萬權(quán)，?等.?小麥光腥黑粉菌對(duì)小麥三種防御酶活性的影響［J］.?分子植物育種，?2021，?19（2）：?614621.

［21］劉朝輝，?曾華蘭，?葉鵬盛，?等.?不同棉花品種防御酶活性對(duì)黃萎病菌的響應(yīng)效應(yīng)［C］∥中國(guó)棉花學(xué)會(huì)2013年年會(huì)論文集，?2013.

［22］崔衛(wèi)東，?龍宣杞，?侯新強(qiáng)，?等.?黃萎病原菌脅迫對(duì)叢枝菌根化棉花幼苗根部防御性酶及超微結(jié)構(gòu)的影響［J］.?新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，?2009，?46（6）：?12351244.

［23］沈永昶，?曹貝貝，?胡淼，?等.?三七根腐病原菌拮抗菌的篩選與活性分析［J］.?浙江理工大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），?2019，?41（6）：?806811.

［24］HALIFU?S，?DENG?Xun，?SONG?Xiaoshuang，?et?al.?Effects?of?two?Trichoderma?strains?on?plant?growth，?rhizosphere?soil?nutrients，?and?fungal?community?of?Pinus?sylvestris?var.?mongolica?annual?seedlings?［J/OL］.?Forests，?2019，?10（9）：?758.?DOI：?10.3390/f10090758.

［25］喬宇穎.?浙江麥區(qū)土壤健康評(píng)價(jià)微生物指標(biāo)篩選研究［D］.?楊凌：?西北農(nóng)林科技大學(xué)，?2021.

［26］賀字典，?宋士清，?高玉峰，等.?棘孢木霉Trichoderma?asperellum在土壤中定殖量的熒光定量PCR檢測(cè)［J］.?植物保護(hù)學(xué)報(bào)，?2016，?43（4）：?552558.

［27］李紀(jì)順，?陳凱，?李玲，等.?木霉融合子Tpf2的定殖及其對(duì)番茄防御酶系的影響［J］.?植物保護(hù)，?2018，?44（4）：?6569.

（責(zé)任編輯：楊明麗）