西番蓮中夜來香花葉病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

顧佩佩 王瑩 楊之巽 韓俊娜 黃愛軍

摘要

夜來香花葉病毒（telosma?mosaic?virus，?TeMV）是對(duì)西番蓮危害較大的一種病毒病原。根據(jù)病毒末端結(jié)合蛋白（VPg）序列設(shè)計(jì)引物，建立了以Vpg334F/506R為特異性引物，退火溫度54℃，引物濃度0.6?μmol/L的SYBR?Green?Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。該方法可特異性擴(kuò)增TeMV基因組6?483～6?675?nt區(qū)域，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增效率為102.77%，決定系數(shù)為0.996?1，最低檢測(cè)濃度為2.370×102?拷貝/μL，靈敏度是普通PCR的1?000倍。應(yīng)用該方法對(duì)接種TeMV的西番蓮進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)接種3?d后可在葉片中檢測(cè)到TeMV，定量分析不同溫度下TeMV在葉片中的積累，發(fā)現(xiàn)26～28℃下病毒積累速度最快，且植株癥狀表現(xiàn)與病毒積累量密切相關(guān)。對(duì)贛南地區(qū)采集的76份西番蓮田間樣品進(jìn)行檢測(cè)，共檢出71份陽(yáng)性樣品，檢出率為93.4%。綜上，本研究建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法特異性強(qiáng)，靈敏度高，適于TeMV的快速檢測(cè)。

關(guān)鍵詞

夜來香花葉病毒;?西番蓮;?實(shí)時(shí)熒光定量PCR

中圖分類號(hào)：

S?436.67

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2022713

Establishment?and?application?of?a?realtime?fluorescence?quantitative?PCR?method?for?detection?of?telosma?mosaic?virus?in?Passiflora?edulis

GU?Peipei，?WANG?Ying，?YANG?Zhixun，?HAN?Junna，?HUANG?Aijun*

（College?of?Life?Sciences，?Gannan?Normal?University，?Ganzhou?341000，?China）

Abstract

Telosma?mosaic?virus?（TeMV）?is?a?devastating?virus?infecting?Passiflora?edulis?populations.?In?this?study，?the?specific?primer?pair，?Vpg334F/506R，?was?designed?based?on?the?conserved?region?of?the?viral?protein?genomelinked?（VPg）?gene?of?TeMV，?and?a?method?of?the?SYBR?Green?Ⅰbased?realtime?fluorescent?quantitative?PCR?（qPCR）?assay?was?established?with?optimal?annealing?temperature?of?54℃?and?primer?concentration?of?0.6?μmol/L，?respectively.?This?method?specifically?amplified?the?nucleotide?sequence?region?of?6?483-6?675?nt?in?the?genome?of?TeMV.?The?cycle?threshold?of?the?qPCR?standard?curve?exhibited?a?positive?linear?relationship?with?template?concentrations，?and?the?amplification?efficiency?and?R2?value?were?102.77%?and?0.996?1，?respectively.?This?method?could?detect?a?minimum?concentration?of?2.370×102?copies/μL?DNA，?which?was?1?000?folds?of?conventional?PCR?detection.?Monitoring?the?virus?accumulation?at?different?temperatures?after?inoculation?revealed?that?TeMV?could?be?detected?at?day?3?after?inoculation，?and?that?accumulated?in?leaves?could?be?more?readily?detected?at?26-28℃?than?at?other?temperatures.?The?symptoms?were?highly?correlated?with?the?content?of?virus?accumulation.?Finally，?the?developed?assay?was?used?to?detect?TeMV?in?76?passion?fruit?samples，?showing?that?the?detection?rate?of?TeMV?was?93.4%.?Thus，?this?assay?can?be?served?as?a?powerful?tool?for?detecting?TeMV?and?is?valuable?for?further?research?on?TeMV.

Key?words

telosma?mosaic?virus;?Passiflora?edulis;?qPCR

西番蓮Passiflora?edulis?Sims又名百香果，屬于西番蓮科Passifloraceae、西番蓮屬Passiflora，為多年生藤本植物，其果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，在我國(guó)主要種植于臺(tái)灣、廣東、廣西、福建、海南、云南、貴州等省區(qū)［13］。據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部2018年統(tǒng)計(jì)，我國(guó)西番蓮種植面積已達(dá)到44?466?hm2，年產(chǎn)量為59.03萬t，全年總產(chǎn)值達(dá)到30億元［45］。病毒病害是為害西番蓮產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素之一。20世紀(jì)80年代，臺(tái)灣省西番蓮產(chǎn)業(yè)因遭到病毒病大范圍肆虐，最終導(dǎo)致全省西番蓮種植面積由1?392?hm2降至540?hm2，年總產(chǎn)量由16?020?t降至8?045?t［6］。病毒病的發(fā)生已嚴(yán)重影響西番蓮產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，目前西番蓮上已報(bào)道的病毒病種類超過40種［78］。

夜來香花葉病毒（telosma?mosaic?virus，TeMV）是一種正義單鏈RNA病毒，隸屬于馬鈴薯Y病毒屬，該病毒侵染西番蓮后可引起葉片花葉、皺縮、畸形，植株矮化、衰弱，果實(shí)果皮木質(zhì)化等癥狀，其可通過扦插、嫁接以及機(jī)械接種等多種途徑傳播［9］。自然條件下除西番蓮?fù)猓琓eMV還可侵染夜來香Telosma?cordata［10］、翅莢決明Senna?alata［11］、廣藿香Pogostemon?cablin［12］;實(shí)驗(yàn)室條件下可侵染多種豆科及莧科植物［9］。

我國(guó)于2017年在福建西番蓮上首次報(bào)道了TeMV的發(fā)生［13］。目前我國(guó)西番蓮產(chǎn)區(qū)TeMV發(fā)生越來越普遍，在福建、廣西和貴州等地區(qū)該病毒田間檢出率高達(dá)80%以上，對(duì)該產(chǎn)業(yè)的危害愈發(fā)嚴(yán)重［1415］。因此建立TeMV快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，對(duì)該病毒的防控具有重要意義。目前已基于多種技術(shù)建立了TeMV的檢測(cè)方法，其中包括：常規(guī)?RTPCR［13］、逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（reversetranscription?loopmediated?isothermal?amplification，RTLAMP）［16］、血清學(xué)檢測(cè)［9］等。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（realtime?fluorescence?quantitativ?PCR，qPCR）作為一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好的檢測(cè)技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于多種植物病毒檢測(cè)中。該方法能夠定量監(jiān)測(cè)病毒在植物體內(nèi)的分布情況，對(duì)于病毒生物學(xué)特性研究具有重要意義。本研究旨在建立TeMV實(shí)時(shí)熒光定量?PCR檢測(cè)方法，為?TeMV的快速檢測(cè)和病毒研究提供技術(shù)支撐。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?供試植物

以實(shí)驗(yàn)室保存的單獨(dú)感染TeMV的西番蓮樣品作為qPCR引物篩選的測(cè)試樣品。試驗(yàn)中所用攜帶西番蓮潛隱病毒（passiflora?latent?carlavirus，?PLV）、西番蓮嚴(yán)重花葉病毒（passion?fruit?severe?mottle?virus，?PFV）、東亞西番蓮病毒（East?Asian?passiflora?virus，?EAPV）、黃瓜花葉病毒（cucumber?mosaic?virus，?CMV）和柑橘相關(guān)彈狀病毒（citrusassociated?rhabdovirus，?CiaRV）的西番蓮樣品均保存于實(shí)驗(yàn)室。田間檢測(cè)樣品于2020年分別采自江西省贛州市尋烏縣、瑞金市、于都縣及贛縣西番蓮種植園，共獲得76份表現(xiàn)為花葉、皺縮及畸形等疑似病毒病癥狀的西番蓮葉片，葉片樣品提取總RNA后于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2?主要試劑與儀器

RNAeasy?Isolation?Reagent、HiScript?Ⅱ?One?Step?RTPCR?Kit購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;PrimeScriptTM?Ⅱ?1st?Strand?cDNA?Synthesis?Kit、TaKaRa?MiniBEST?Plasmid?Purification?Kit?Ver.4.0、DL?2000/5000?DNA?Marker、TaKaRa?MiniBEST?Agarose?Gel?DNA?Extraction?Kit?Ver.4.0、pMDTM19T?Vector?Cloning?Kit、DH5α?感受態(tài)細(xì)胞，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司;FastStart?Essential?DNA?Green?Master，購(gòu)自Roche公司。

Nanodrop?2000c超微量核酸蛋白測(cè)定儀，美國(guó)Thermo?Scientific公司;?S1000TM?Thermal?Cycler，美國(guó)BioRad公司;DYY6C型電泳儀，北京六一儀器廠;JS2012型凝膠成像系統(tǒng)，上海培清科技有限公司;LightCycler?96?System，瑞士Roche公司;GPX250C光照培養(yǎng)箱，上海南榮實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司。

1.2?方法

1.2.1?RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

參照試劑盒RNAeasy?Isolation?Reagent說明書提取西番蓮葉片樣品總RNA，并于-80℃保存?zhèn)溆谩２捎梅崔D(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM?Ⅱ?1st?Strand?cDNA?Synthesis?Kit合成病毒的cDNA模板。

1.2.2?引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室獲得的TeMV江西分離物TeMVXW、TeMVRJ、TeMVYD（GenBank登錄號(hào)分別為ON932194、ON932195、ON932196）以及GenBank中已報(bào)道的TeMV分離物（MK340754、MK340755、MT557572等）的病毒末端結(jié)合蛋白?（viral?protein?genomelinked，VPg）保守序列，使用引物設(shè)計(jì)軟件Oligo?7設(shè)計(jì)一對(duì)用于TeMV實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的特異性引物VPg334（5′GAATTGGATAGACAAGCCAT3′）/VPg506R

（5′GAAGTGTTTGTGGCATACC3′）。本研究所得引物VPg334F/506R以及試驗(yàn)中所用西番蓮內(nèi)參引物C21209F（5′AGCTCTTCTACATCTGCGCT3′）/C21209R（5′TTCTTGTGCATCTTCCCCCG3′）［17］均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2.3?TeMV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備

以RNA為模板，利用引物VPg334F/506R通過一步法RTPCR擴(kuò)增TeMV基因組的6?483～6?675?nt區(qū)域，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。反應(yīng)總體積50.0?μL：RNA模板?2.0?μL，10?μmol/L上、下游引物各1?μL，2×One?Step?Buffer?25?μL，One?Step?Enzyme?Mix?2?μL，ddH2O?19?μL。反應(yīng)條件：50℃反轉(zhuǎn)錄30?min;94℃預(yù)變性4?min;94℃變性20?s，56℃退火20?s，72℃延伸20?s，共35個(gè)循環(huán)。

PCR產(chǎn)物用TaKaRa?MiniBEST?Agarose?Gel?DNA?Extraction?Kit回收，回收產(chǎn)物與pMD19T載體連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選經(jīng)菌液PCR鑒定后的陽(yáng)性克隆子送至蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。選擇測(cè)序結(jié)果中序列完全正確的陽(yáng)性克隆樣品，參照TaKaRa?MiniBEST?Plasmid?Purification?Kit說明書提取質(zhì)粒，所得質(zhì)粒命名為VPg192。利用Nanodrop?2000c超微量核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)質(zhì)粒純度與濃度，

并將獲得的質(zhì)粒作為后續(xù)試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)品。

質(zhì)粒拷貝數(shù)計(jì)算公式：拷貝數(shù)（拷貝/μL）=［質(zhì)粒濃度（g/μL）×10-9×6.02×1023（拷貝/mol）］/［660（g/mol）×（載體長(zhǎng)度+片段長(zhǎng)度）］［18］。

1.2.4?實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系的優(yōu)化

以質(zhì)粒VPg192為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)總體積20.0?μL：Master?mix?（SYBR?Green）10.0?μL、10?μmol/L上、下游引物（分別設(shè)置0.4、0.6、0.8?μL和1.0?μL共4個(gè)引物用量）、質(zhì)粒模板1.0?μL，?ddH2O補(bǔ)足體系至20.0?μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性10?min;95℃變性10?s;以引物的退火溫度Tm值為基礎(chǔ)，分別以52、52.4、53.2、54、55.1、56.2、57.3、58.2、59.1、60℃為溫度梯度，退火10?s，72℃延伸10?s，共40個(gè)循環(huán)。對(duì)擴(kuò)增效率和熔解曲線進(jìn)行分析，選擇合適的引物用量和退火溫度。

1.2.5?實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

用ddH2O按10倍梯度稀釋質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，濃度分別為2.370×100、2.370×101、2.370×102、2.370×103、2.370×104、2.370×105、2.370×106、2.370×107、2.370×108拷貝/μL和2.370×109?拷貝/μL。分別以這10個(gè)質(zhì)粒樣品為模板，在優(yōu)化后的反應(yīng)條件下進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，反應(yīng)中以健康西番蓮樣品的cDNA作為陰性對(duì)照，以無酶水作為空白對(duì)照，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)。反應(yīng)結(jié)束后，以擴(kuò)增得到的Ct值和模板質(zhì)粒拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6?實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系靈敏度和特異性檢測(cè)

以10倍梯度稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，分別進(jìn)行普通PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，比較兩種方法的靈敏度，質(zhì)粒初始濃度為2.370×109?拷貝/μL。用經(jīng)檢測(cè)后確定含有PLV、PFV、EAPV、CMV和CiaRV，但不含TeMV的cDNA樣品進(jìn)行TeMV的實(shí)時(shí)熒光定量PCR特異性檢測(cè)。

1.2.7?西番蓮中TeMV的定量檢測(cè)

采用汁液摩擦接種的方法接種西番蓮實(shí)生幼苗，并以0.1?mol/L?PBS接種作為陰性對(duì)照。接種后將植株置于恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀察植株發(fā)病情況。培養(yǎng)箱設(shè)置光周期L∥D=16?h∥8?h，分組設(shè)置3個(gè)不同溫度條件：低溫組夜間最低溫為17℃，白天最高溫為19℃;中溫組夜間最低溫26℃，白天最高溫28℃;高溫組夜間最低溫35℃，白天最高溫37℃。在接種后的第0、3、6、9、12?天，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)樣品進(jìn)行病毒的定量檢測(cè)，以對(duì)照植株cDNA作為陰性對(duì)照，以無酶水作為空白對(duì)照，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)。

提取感病西番蓮植株不同組織（花、嫩葉、老葉、嫩莖、老莖、根）RNA，利用上述建立的方法定量測(cè)定不同組織內(nèi)TeMV含量，共設(shè)3次重復(fù)。

1.2.8?田間樣品檢測(cè)

從贛南地區(qū)不同縣區(qū)共采集76份疑似感染TeMV的西番蓮樣品，采用qPCR技術(shù)檢測(cè)田間樣品感染TeMV的情況。

2?結(jié)果與分析

2.1?TeMV實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系的優(yōu)化

將TeMV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，通過對(duì)引物用量和退火溫度進(jìn)行篩選，最終確定當(dāng)引物VPg334F和VPg506R用量均為0.6?μL，退火溫度為54℃時(shí)，擴(kuò)增曲線良好且熔解曲線峰單一。優(yōu)化后的反應(yīng)總體積20.0?μL：Master?mix?（SYBR?Green）?10.0?μL，10?μmol/L上、下游引物各0.6?μL，質(zhì)粒模板1.0?μL，ddH2O補(bǔ)足體系至20.0?μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性10?min;95℃變性10?s;54℃退火10?s，72℃延伸10?s，?40個(gè)循環(huán)。后續(xù)試驗(yàn)均使用優(yōu)化后的反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增。

2.2?標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

采用優(yōu)化后的qPCR反應(yīng)體系進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，濃度在2.370×102～2.370×109?拷貝/μL范圍內(nèi)的質(zhì)粒模板經(jīng)擴(kuò)增后，所得Ct值與模板濃度呈良好的線性關(guān)系。標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-3.257?2，決定系數(shù)R2為0.996?1，擴(kuò)增效率為102.77%，直線方程為y=-3.257?2x+43.345，y為Ct值，x為質(zhì)粒濃度的對(duì)數(shù)值（圖1）。

2.3?實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系特異性檢測(cè)

采用qPCR方法分別檢測(cè)攜帶TeMV、PLV、PFV、EAPV、CMV和CiaRV的西番蓮樣品。結(jié)果顯示僅攜帶TeMV的樣品出現(xiàn)正常的擴(kuò)增曲線，3次重復(fù)所得Ct值分別為15.68、15.44、15.72（圖2a），且熔解曲線峰值相同（圖2b）。其他感病樣品均無明顯擴(kuò)增曲線，且熔解曲線無峰，結(jié)果表明該方法可用于特異性檢測(cè)TeMV。

2.4?實(shí)時(shí)熒光定量PCR和普通PCR靈敏度比較

將初始濃度為2.370×109?拷貝/μL的TeMV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品按10倍梯度稀釋，分別以稀釋后的質(zhì)粒作為模板。結(jié)果顯示，普通PCR最低可檢測(cè)到濃度為2.370×105?拷貝/μL的TeMV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品（圖3a），qPCR可檢測(cè)到濃度為2.370×102?拷貝/μL的TeMV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品（圖3b）。上述結(jié)果表明本研究建立的TeMV實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系是普通PCR檢測(cè)靈敏度1?000倍。

2.5?西番蓮接種TeMV后的癥狀觀察及葉片病毒含量的定量檢測(cè)

從接種TeMV的第0天起，定期觀察不同溫度條件下培養(yǎng)的西番蓮葉片癥狀發(fā)展情況（圖4）。在17～19℃范圍內(nèi)，第9天接種葉上部嫩葉出現(xiàn)卷葉癥狀，第12天時(shí)癥狀加重，頂部新葉表現(xiàn)為卷葉以及輕微花葉癥狀;?26～28℃下，第6天便出現(xiàn)較明顯的卷葉癥狀;?35～37℃下，癥狀出現(xiàn)緩慢，觀察期間內(nèi)未出現(xiàn)明顯卷葉及花葉癥狀。

接種后第0、3、6、9、12天采集接種植株的上部葉片，采用引物VPg334F/506R以及西番蓮內(nèi)參基因引物C21209F/R對(duì)樣品進(jìn)行定量檢測(cè)（圖5）。結(jié)果顯示，接種3?d時(shí)就可在接種植株上部未接種葉中檢測(cè)到TeMV，且12?d內(nèi)，不同溫度條件下西番蓮葉片中TeMV的相對(duì)表達(dá)量變化總體呈上升趨勢(shì);在26～28℃條件下，TeMV的含量快速上升，遠(yuǎn)高于其余2組;17～19℃以及35～37℃條件下，上升趨勢(shì)在9?d后趨于平緩，2組間病毒相對(duì)表達(dá)量無顯著差異。

以上結(jié)果表明，溫度能夠影響TeMV在西番蓮內(nèi)的增殖速率以及植株的癥狀表達(dá)情況。26～28℃下病毒在植株內(nèi)快速增殖，癥狀發(fā)展快，且該條件下TeMV增殖速率高于35～37℃與17～19℃;35～37℃條件不僅會(huì)降低病毒的積累速率，對(duì)植株的癥狀表達(dá)亦有影響。

2.6?西番蓮各組織部位TeMV相對(duì)表達(dá)量

針對(duì)病毒含量高的組織進(jìn)行檢測(cè)可提高病毒檢出率。本試驗(yàn)通過優(yōu)化后的體系定量檢測(cè)感病西番蓮植株花、嫩葉、老葉、嫩莖、老莖、根等組織樣本中TeMV含量，?3次重復(fù)所得平均Ct值分別為19.47、20.5、20.74、19.03、34.04和32.54，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出樣品中病毒含量分別為1.297×107、6.38×106、5.41×106、1.75×107、5.92×102拷貝/μL和1.66×103拷貝/μL（圖6）。可見植株較老的莖稈以及根部組織中病毒含量相對(duì)較低，在花、嫩莖、嫩葉等新生組織中病毒含量相對(duì)較高。因此，在檢測(cè)西番蓮感染TeMV情況時(shí)，以葉片作為檢測(cè)樣本可有效保障病毒檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

2.7?田間西番蓮樣品的TeMV檢測(cè)

應(yīng)用本試驗(yàn)所建立的熒光定量PCR檢測(cè)體系對(duì)采自贛南地區(qū)不同縣區(qū)的76份田間樣品進(jìn)行分析，結(jié)果顯示（表1），76份樣品中，TeMV感病樣本共71份，不同地區(qū)所采集樣本中該病毒檢出率達(dá)到71.4%～100.0%，表明TeMV在所調(diào)查地區(qū)田間檢出率較高，推測(cè)該地區(qū)TeMV田間發(fā)生較為普遍。

3?結(jié)論與討論

近年來，TeMV在中國(guó)不同省（區(qū)）西番蓮產(chǎn)區(qū)蔓延，嚴(yán)重威脅了西番蓮產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，因此對(duì)田間病毒發(fā)生情況進(jìn)行早期的定性定量檢測(cè)與監(jiān)控十分有必要。本研究建立了該病毒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。該方法特異性好，靈敏度高，靈敏度是常規(guī)PCR檢測(cè)的1?000倍，可用于檢測(cè)低豐度病毒樣本。田間樣品檢測(cè)結(jié)果也表明該方法可用于TeMV的田間檢測(cè)。由于植物不同組織中所含的次生代謝產(chǎn)物存在差異，可能會(huì)影響RNA的提取及PCR檢測(cè)結(jié)果［19］，且病毒在植株不同部位積累量亦有較大差異，本研究所建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，對(duì)于感病西番蓮植株的不同組織部位均有良好的檢測(cè)效果。

有研究表明病毒侵染寄主植物過程中受溫度等外界環(huán)境因子影響，較高的環(huán)境溫度可能抑制病毒的快速積累，減弱植株的癥狀表現(xiàn)［2021］。類似結(jié)果已經(jīng)在多種病毒上報(bào)道，如Tu研究發(fā)現(xiàn)，豆類作物感染菜豆黃花葉病毒（bean?yellow?mosaic?virus，BYMV）后，其癥狀發(fā)展受溫度影響較大，16～24℃下病毒滴度較高且癥狀發(fā)展迅速，當(dāng)溫度高于28℃時(shí)，植株尖端壞死癥狀的發(fā)展受到抑制［22］。Chung等發(fā)現(xiàn)33℃高溫條件下，蕪菁花葉病毒（turnip?mosaic?virus，TuMV）侵染白菜時(shí)的癥狀發(fā)展較18～28℃緩慢［23］。同樣，高溫也可降低馬鈴薯Y病毒（potato?virus?Y，PVY）在本生煙中的積累速率并只引起輕微的癥狀［24］。本研究中所得結(jié)果表明TeMV侵染西番蓮過程中，病毒在葉片中的增殖和植株癥狀表現(xiàn)情況也會(huì)受到溫度影響，適宜溫度能夠加速TeMV的增殖以及植株的癥狀表現(xiàn)，而35～37℃高溫條件將抑制病毒在植株內(nèi)的增殖速率并延緩癥狀的出現(xiàn)，且病毒的積累量與植株癥狀表現(xiàn)之間存在一定聯(lián)系。

目前西番蓮廣泛種植于熱帶與亞熱帶地區(qū)，以上結(jié)果表明夏季高溫條件下，植株感病初期可能不易出現(xiàn)明顯病害癥狀。本研究中將實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)應(yīng)用于TeMV的快速檢測(cè)，在分子水平上為TeMV的檢測(cè)提供了一種快速、靈敏的方法。在此基礎(chǔ)上結(jié)合田間不同溫度條件以及寄主感病程度等因素監(jiān)測(cè)TeMV的發(fā)生情況，對(duì)該病毒的田間防控具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

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