廣東番茄巨芽病植原體的分子鑒定

湯亞飛 李正剛 佘小漫 于琳 藍(lán)國兵 何自福

摘要

2022年，對在廣東省湛江市廉江市田間發(fā)現(xiàn)的疑似番茄巨芽病病株，利用分子生物學(xué)方法對其相關(guān)植原體進(jìn)行了鑒定。以番茄病株葉片總DNA為模板，利用植原體16S?rRNA基因通用引物R16mF2/R16mR1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了廣東番茄巨芽病植原體（TBBGD2022）16S?rRNA基因片段（1?430?bp，GenBank登錄號為ON102780）。16S?rRNA基因序列相似性分析顯示，TBBGD2022與16SrⅡ組植原體菌株的相似性較高，為96.82%～100%，其中與隸屬于16SrⅡV亞組的6個(gè)植原體株系相似性為100%。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，TBBGD2022與16SrⅡ組各植原體株系聚類在一個(gè)大分支，并與16SrⅡV亞組成員聚類在一個(gè)小分支，親緣關(guān)系較近。16S?rRNA?基因相似系數(shù)分析表明，TBBGD2022與16SrⅡV亞組的參照株系‘Praxelis?clematidea’?phyllody?phytoplasma?（GenBank登錄號：KY568717）?的相似系數(shù)為1.00。上述研究結(jié)果表明，廣東番茄巨芽病植原體隸屬16SrⅡV亞組成員。本文首次報(bào)道在廣東發(fā)現(xiàn)番茄巨芽病，通過其16S?rRNA序列分析進(jìn)一步確定了其相關(guān)植原體的分類地位，為該病害的防控提供了科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞

番茄巨芽病;?植原體;?16S?rRNA;?分子鑒定

中圖分類號：

S?436.412

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2022487

Molecular?identification?of?phytoplasma?associated?with?tomato?big?bud?disease?in?Guangdong?province

TANG?Yafei， LI?Zhenggang，?SHE?Xiaoman，?YU?Lin，?LAN?Guobing，?HE?Zifu*

（Institute?of?Plant?Protection，?Guangdong?Academy?of?Agricultural?Sciences，?Key?Laboratory?of?Green?

Prevention?and?Control?on?Fruits?and?Vegetables?in?South?China，?Ministry?of?Agriculture?and?Rural?Affairs，?

Guangdong?Provincial?Key?Laboratory?of?High?Technology?for?Plant?Protection，?Guangzhou?510640，?China）

Abstract

In?2022，?the?suspected?tomato?big?bud?diseased?plants?were?found?in?Lianjiang?city，?Zhanjiang?city，?Guangdong?province.?The?related?phytoplasma?was?detected?and?identified?using?molecular?technology.?The?16S?rRNA?gene?fragment?（1?430?bp，?GenBank?accession?no.?ON102780）?of?phytoplasma?associated?with?tomato?big?bud?disease?in?Guangdong?province?（TBBGD2022）?was?amplified?from?total?DNA?of?diseased?tomato?plants?using?universal?primers?R16mF2/R16mR1.?Sequence?similarity?based?on?16S?rRNA?gene?sequence?showed?that TBBGD2022?had?higher?similarity?（96.82%-100%）?with?phytoplasmas?from?16SrⅡ?group，?while?had?highest?similarity?（100%）?with?six?phytoplasmas?belonged?to?16SrⅡV?subgroup.?Phylogenetic?analysis?showed?that?TBBGD2022?formed?a?large?evolutionary?branch?with?16SrⅡ?group?phytoplasmas，?and?a?small?evolutionary?branch?with?16SrⅡV?subgroup?phytoplasmas.?iPhyClassifier?analysis?for?16S?rRNA?gene?showed?that?the?similarity?coefficient?between?TBBGD2022?and?‘Praxelis?clematidea’?phyllody?phytoplasma?（GenBank?accession?no.?KY568717）?of?the?reference?strain?from?16SrⅡV?subgroup?was?1.00.?These?results?showed?that?phytoplasma?associated?with?tomato?big?bud?disease?in?Guangdong?province?belonged?to?the?16SrⅡV?subgroup.?In?this?paper，?tomato?big?bud?disease?was?discovered?firstly?in?Guangdong，?and?the?taxonomic?status?of?its?related?phytoplasma?was?further?determined.?The?results?provide?the?scientific?basis?for?controlling?tomato?big?bud?disease?in?Guangdong?province.

Key?words

tomato?big?bud?disease;?phytoplasma;?16S?rRNA;?molecular?identification

植原體是一類無細(xì)胞壁，難以人工培養(yǎng)的專性寄生于活性細(xì)胞的植物病原菌，由Doi等1967年發(fā)現(xiàn)并報(bào)道［1］。該病原菌屬細(xì)菌界Bacteria柔膜菌綱Mollicutes植原體暫定屬Candidatus?（Ca.）?genus?Phytoplasma［23］，主要通過取食植物韌皮部的葉蟬、木虱等刺吸式口器昆蟲傳播，也可通過嫁接或菟絲子傳播。植原體的寄主種類多，可侵染1?000多種植物，常引起植株表現(xiàn)叢枝、花變?nèi)~、畸形、黃化、小葉等典型癥狀，嚴(yán)重影響全球各地農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)［4］。關(guān)于植原體的鑒定與分類，由于不能在人工培養(yǎng)基上進(jìn)行分離、培養(yǎng)，目前主要依據(jù)其16S?rRNA序列差異，以及rp、secY等保守基因序列、傳播介體、天然植物寄主。截止到2019年6月，依據(jù)16S?rRNA?基因核苷酸序列相似性、限制性片段長度多態(tài)性，國際上將已鑒定出的植原體劃分為52個(gè)暫定種（‘Ca.Phytoplasma’）、34個(gè)組（group）和100多個(gè)亞組（subgroup）［4］。

番茄Solanum?lycopersicum?L.是廣東省主要的蔬菜品種之一，在全省各蔬菜產(chǎn)區(qū)均有廣泛種植。近幾年，冬種番茄在粵西地區(qū)發(fā)展迅速，面積逐年增加，已成為湛江市（雷州、遂溪、廉江）、茂名市電白等地農(nóng)民收入來源的主要經(jīng)濟(jì)作物。2022年以來，本團(tuán)隊(duì)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)廣東省湛江市廉江市的冬種番茄產(chǎn)區(qū)發(fā)生疑似番茄巨芽病的新病害，田間病株主要表現(xiàn)為葉小、頂部枝梢和花柄肥大、腋芽上叢生直立的不定芽等癥狀。

番茄巨芽病（tomato?big?bud?disease，TBB）是由植原體引起的一種病害，最早發(fā)現(xiàn)于澳大利亞［5］，已在美國［6］、意大利［7］、伊朗［8］、印度［9］、埃及［10］、約旦［11］、巴西［12］、中國［13］等多個(gè)國家有報(bào)道。在我國，唐偉文等1982年首次在海南發(fā)現(xiàn)番茄巨芽病［13］，隨后，該病害在新疆和云南也有報(bào)道［1415］。筆者采用分子生物學(xué)方法，對發(fā)生在廣東省廉江市疑似番茄巨芽病的病株樣品進(jìn)行檢測，進(jìn)一步對相關(guān)植原體的16S?rRNA基因進(jìn)行克隆和序列分析，明確其分類地位，為防治該病害提供科學(xué)依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料和試劑

5份疑似巨芽病的櫻桃番茄病樣2022年2月采集于廣東省廉江市番茄種植地。植物基因組DNA抽提試劑盒（Easypure?Plant?Genomic?DNA?Kit）和大腸桿菌Escherichia?coli?T1化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;Premix?TaqTM、pMD?19T?Vector購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2?病樣總DNA的抽提

取番茄病樣100?mg，利用植物DNA提取試劑盒抽提其總DNA，具體步驟參照按試劑盒說明書。總DNA溶解于40?μL?滅菌的超純水中，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3?16S?rRNA基因的擴(kuò)增

利用擴(kuò)增植原體16S?rRNA基因的通用引物R16mF2（5′CATGCAAGTCGAACGGA3′）/R16mR1（5′CTTAACCCCAATCATCGAC3′）［16］，對待測病樣總DNA進(jìn)行PCR檢測，預(yù)期擴(kuò)增目的片段大小為1.4?kb。反應(yīng)體系25.0?μL：待測樣品總DNA?1.0?μL，?Ex?TaqTM?Premix?12.5?μL，上游引物（10?μmol/L）?1.0?μL，下游引物（10?μmol/L）?1.0?μL，超純水9.5?μL。反應(yīng)程序：95℃?預(yù)變性4?min;95℃?1?min，55℃?1?min，72℃?90?s，35個(gè)循環(huán);72℃延伸10?min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.4?基因克隆與測序

將所獲目的片段進(jìn)行純化、連接至pMD19T載體，采用熱激法將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌T1感受態(tài)細(xì)胞，吸取80.0?μL菌液涂布在含100?μg/mL?Amp、40?μL/mL?Xgal的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃?倒置培養(yǎng)過夜;從每個(gè)平板隨機(jī)挑取3個(gè)陽性單菌落送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。

1.5?序列分析

利用DNAStar的SeqMan對序列進(jìn)行拼接，將所得DNA序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLASTn搜索，確定是否為植原體基因序列;利用在線分析工具M(jìn)USCLE，將所獲得的16S?rRNA基因序列與已報(bào)道的相關(guān)序列進(jìn)行相似性分析。采用MEGA?6.06的最大似然法（maximum?likelihood，ML）［17］構(gòu)建基于16S?rRNA基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹，Bootstrap值設(shè)置為1?000。進(jìn)一步將16S?rRNA基因相關(guān)片段序列通過植原體在線分類軟件iPhyClassifier進(jìn)行虛擬RFLP分析和計(jì)算相似系數(shù)，確定其分類地位［18］。

2?結(jié)果與分析

2.1?田間癥狀

番茄病株田間主要表現(xiàn)為葉小、頂部枝梢呈淡紫色、肥大，直立向上呈圓錐形，花柄肥大、花萼顯著膨大，在葉腋處長出1個(gè)粗短肥大的腋芽，在腋芽頂部叢生若干個(gè)不定芽，病株不結(jié)果或結(jié)出少量堅(jiān)硬的圓錐形小果實(shí)（圖1），與已報(bào)道的番茄巨芽病田間癥狀類似。

2.2?PCR檢測結(jié)果

利用擴(kuò)增植原體16S?rRNA基因的引物R16mF2/

R16mR1對采集的5份番茄巨芽病疑似病樣分別進(jìn)行PCR檢測，電泳結(jié)果顯示（圖2），能從5份病樣中擴(kuò)增出預(yù)期大小的目的片段，健康植株中未擴(kuò)增出任何片段。這表明采集于廣東省廉江市的番茄巨疑似病樣中存在植原體，命名為廣東番茄巨芽植原體（TBBGD2022）。

2.3?16S?rRNA基因序列分析

克隆與測序分析結(jié)果表明，TBBGD2022的16S?rRNA片段大小為1?430?bp?（GenBank登錄號為ON102780）。BLASTn結(jié)果顯示，TBBGD2022與花生叢枝植原體組（16SrⅡ）成員的16S?rRNA序列相似性最高。MUSCLE分析結(jié)果顯示（表1）：TBBGD2022與16SrⅡ組各植原體株系的16S?rRNA基因序列相似性為96.82%～100%，與其他組植原體的相似性較低，為88.84%～91.42%;其中與來自中國海南、臺灣、廣東的隸屬于16SrⅡV亞組的6個(gè)植原體株系以及來自印度的番茄巨芽病株系相似性最高，為100%。進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)，TBBGD2022與印度、中國、伊朗、澳大利亞、埃及、美國、新喀里多尼亞、坦桑尼亞、巴西報(bào)道的28個(gè)番茄巨芽植原體相關(guān)株系的16S?rRNA基因序列相似性為88.84%～100%，其中與印度報(bào)道的TBBOT03株系相似性為100%，與中國報(bào)道的YNym、YM?株系相似性分別為99.93%、99.60%，而與中國新疆報(bào)道的ZYT3、syc1?株系相似性較低，為90.66%。

以柑橘黃龍病亞洲種廣東株系（Candidatus?Liberibacter?asiaticus?GuangdongHP，GenBank登錄號為DQ432005）的16S?rRNA序列為外組，利用MEGA?6.06的最大似然法對TBBGD2022與33個(gè)植原體株系進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果顯示（圖3），TBBGD2022與隸屬于16SrⅡ組的15個(gè)番茄巨芽植原體株系及5個(gè)其他植原體株系聚集在一個(gè)大分支，親緣關(guān)系較近;而與隸屬于16SrⅠ、16SrⅢ、16SrⅥ、16SrⅨ、16SrⅫ組的13個(gè)番茄巨芽植原體株系親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。進(jìn)一步以隸屬于16SrⅠ組的翠菊黃化植原體（Aster?yellows?phytoplasma，GenBank登錄號為AY389828）的16S?rRNA序列為外組，對TBBGD2022與16SrⅡ組各亞組相關(guān)株系進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果顯示（圖4），其與16SrⅡA、16SrⅡD、16SrⅡV、16SrⅡP、16SrⅡQ和16SrⅡU等6個(gè)亞組植原體株系親緣關(guān)系近，形成一個(gè)獨(dú)立的大分支，其中與16SrⅡA、16SrⅡD、16SrⅡV?3個(gè)亞組親緣關(guān)系最近。

2.4?16S?rRNA基因序列的iPhyClassifier在線分析

利用植原體在線分類軟件iPhyClassifier對TBBGD2022的16S?rRNA基因中引物R16F2n/R16R2之間的片段進(jìn)行虛擬RFLP分析，結(jié)果顯示（圖5）：AluⅠ、BamH?Ⅰ、Bfa?Ⅰ、BstU?Ⅰ、Dra?Ⅰ、EcoR?Ⅰ、Hae?Ⅲ、Hha?Ⅰ、Hinf?Ⅰ、Hpa?Ⅰ、Hpa?Ⅱ、KpnⅠ、Sau3A?Ⅰ、Mse?Ⅰ、RsaⅠ、Ssp?Ⅰ和TaqⅠ?17種限制性內(nèi)切酶虛擬RFLP?圖譜與16SrⅡV亞組的參考株系‘Praxelis?clematidea’?phyllody?phytoplasma?（登錄號：KY568717）?的酶切圖譜相似性最高，相似系數(shù)為1.00，表明TBBGD2022屬于16SrⅡV亞組成員。

3?結(jié)論與討論

番茄巨芽病是番茄生產(chǎn)中一種毀滅性病害，植株一旦感染該病后，就無法正常開花結(jié)果。該病害1902年最早在澳大利亞發(fā)現(xiàn)，我國1982年最先在海南發(fā)現(xiàn)。2022年，本團(tuán)隊(duì)在廣東廉江市發(fā)現(xiàn)了疑似番茄巨芽病新病害，PCR檢測表明該病樣感染了植原體，命名為廣東廉江番茄巨芽植原體（TBBGD2022），屬16SrⅡV亞組。本研究是番茄巨芽病在廣東省發(fā)生的首次報(bào)道。

植原體是危害蔬菜作物的重要病原之一，已報(bào)道至少有16個(gè)組和超過21個(gè)亞組的植原體與蔬菜病害相關(guān)，其中與番茄巨芽病相關(guān)的至少有16SrⅠ、16SrⅡ、16SrⅢ、16SrⅤ、16SrⅥ、16SrⅨ、16SrⅫ?7個(gè)組的植原體［19］。我國海南、云南、新疆三省（自治區(qū)）有番茄植原體相關(guān)病害發(fā)生的報(bào)道，并對其進(jìn)行了鑒定。唐偉文等通過癥狀、電鏡觀察、嫁接傳染、抗菌素處理明確引起海南番茄巨芽病和叢枝病的病原為植原體［13］，后續(xù)未見進(jìn)一步相關(guān)研究報(bào)道。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，Dong等明確與云南番茄黃化病有關(guān)的植原體屬于16SrⅡA組［14］。Du等鑒定出與新疆番茄巨芽病相關(guān)植原體屬于16SrⅥ組［15］。本文采用分子生物學(xué)技術(shù)明確與廣東番茄巨芽病相關(guān)的植原體屬于16SrⅡV亞組。可見，引起廣東番茄巨芽病的植原體與我國新疆和云南株系存在差異，其中與新疆株系的差異較大，二者16S?rRNA基因序列相似性僅為90.66%，且隸屬不同組;與云南株系的差異較小，二者16S?rRNA基因序列相似性99.93%，均隸屬16SrⅡ組。

16SrⅡV亞組植原體是2017年首次從海南假臭草叢枝病樣中鑒定出的一個(gè)新亞組［20］，目前在綠豆Vigna?radiata?（L.）?Wilczek［21］、大豆Glycine?max?（L.）?Merr.［22］、皺子白花菜Cleome?rutidosperma?DC.?Prodr.［23］、瓜葉栝樓Trichosanthes?cucumerina?L.［24］、一點(diǎn)紅Emilia?sonchifolia?（L.）?DC.［25］、皺葉煙草Nicotiana?plumbaginifolia?Viv.［26］、長序莧Digera?muricata?（L.）?Mart.［27］、灰毛豆Tephrosia?purpurea?（L.）?Pers.［28］、馬松子Melochia?corchorifolia?L.［29］、花生Arachis?hypogaea?L.［30］已有報(bào)道。本文首次報(bào)道了在番茄上鑒定到16SrⅡV亞組植原體，為研究植原體多樣性、分布以及病害防控提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

廣東省地處熱帶和亞熱帶地區(qū)，常年高溫高濕，物種資源豐富，植物和介體昆蟲周年可生長與繁殖，為植原體在內(nèi)的植物病害發(fā)生提供了十分有利的條件。廣東地區(qū)已報(bào)道的植原體相關(guān)病害有花生叢枝病［3032］、水稻橙葉病［33］、茄子變?nèi)~病［34］、桉樹黃化（叢枝）病［35］、桑樹黃化矮縮病［36］、棗瘋病［37］等，已給廣東省農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了嚴(yán)重影響。本研究首次在廣東湛江廉江發(fā)現(xiàn)植原體侵染引起的番茄巨芽病，該病害的病原TBBGD2022與發(fā)生在廣東湛江遂溪的花生叢枝病［30］的病原分類地位一致，均為16SrⅡV亞組植原體。由此推測，該植原體病害極有可能通過介體昆蟲在該區(qū)域蔓延。由于目前還缺乏有效防治植原體病害的藥劑，防治傳病介體昆蟲對防控該類病害的擴(kuò)散和發(fā)生至關(guān)重要。因此，下一步急需開展傳菌介體昆蟲種類鑒定、介體昆蟲的田間帶菌情況監(jiān)測等研究工作，為植原體病害的防控提供科學(xué)依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：田?喆）