SND1作為肺腺癌癌基因和預后標志物的鑒定與分析

張芮豪 黃華 朱光勝 吳迪 陳琛 曹培俊 丁晨 劉紅雨 陳軍 李永文

肺癌是世界上最常見的癌癥之一，也是癌癥死亡的重要原因[1]。2020年全球癌癥統計數據分析[2]顯示，肺癌導致的死亡人數約為180萬，占所有癌癥相關死亡人數的18.0%。肺癌根據組織病理類型可分為小細胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）和非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）兩大組織類型。NSCLC占肺癌的85%，而肺腺癌（lung adenocarcinoma, LUAD）是NSCLC病例中的主要亞型[3]。近年來，盡管手術、靶向治療和免疫治療等各個方面取得了重大進展，但LUAD患者的5年生存率仍低于15%[4]。因此，鑒定LUAD的診斷、治療和預后預測的新靶點至關重要。

葡萄球菌含核酸酶結構域1（Staphylococcalnuclease and tudor domain containing 1, SND1）是一種轉錄共激活因子，編碼SND1蛋白質，在mRNA剪接、編輯和蛋白穩定性等多種轉錄后調控過程中發揮重要作用。SND1在哺乳動物中普遍表達，在進化上高度保守，在多種生物學過程，包括細胞增殖、分化和凋亡中具有重要的生理作用[5]。SND1通過調節轉錄因子、信號通路、細胞周期調節因子等關鍵分子，促進腫瘤細胞的生長和存活。其在肺癌、肝細胞癌、乳腺癌、宮頸癌和卵巢癌等多種實體腫瘤中表達上調，通過影響腫瘤的增殖、遷移和侵襲等作用，導致患者預后不良[6-10]。因此，SND1被認為是一個潛在的治療靶點。然而，SND1在肺癌中的作用還未完全明確，需要進一步的研究來充分了解SND1在肺癌尤其是LUAD中的作用。

在本研究中，我們利用公共數據庫研究了SND1在LUAD中腫瘤組織與相應癌旁組織中的表達差異，分析SND1表達與LUAD患者預后的關系以及LUAD中SND1表達與免疫細胞浸潤的相關性；利用體外實驗探討SND1對LUAD細胞生物學行為的影響。我們的研究進一步探索了SND1在LUAD中的潛在致癌作用，證實SND1可能是LUAD診斷和治療的潛在生物標志物和治療靶點。

1 資料與方法

1.1 數據來源和生物信息分析 分別從基因表達綜合數據庫（Gene Expression Omnibus, GEO）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）和癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas, TCGA）（https://portal.gdc.cancer.gov/）中獲取與LUAD相關的基因數據，共包含3個數據集，分別是TCGA-LUAD數據集以及2個GEO數據集（GSE116959和GSE68517）。其中TCGA-LUAD數據集包含510例LUAD患者的轉錄組數據，而GSE116959和GSE68517兩個數據集分別包含57例和86例LUAD患者的數據樣本。使用人類蛋白質表達圖譜（The Human Protein Atlas, HPA）分析SND1在LUAD患者中的免疫組化染色結果。利用UALCAN數據庫（The University of ALabama at Birmingham Cancer Data Analysis Portal）（http://ualcan.path.uab.edu/）進行廣泛的交互式生物信息學分析，包括臨床因子、RNA-seq和預后相關數據。此外，從癌細胞系百科全書數據庫（Cancer Cell Line Encyclopedia, CCLE）（https://sites.broadinstitute.org/ccle）獲取SND1在20種LUAD細胞系的mRNA表達數據。另外，我們使用癌癥基因組門戶網站（c-BioPortal）分析SND1在LUAD細胞中的基因突變，并使用Kaplan-Meier曲線評估SND1的表達與肺LUAD患者總生存期（overall survival, OS）的關系。

1.2 功能富集分析 通過使用R中的“ClusterProfiler”軟件包進行基因本體（gene ontology, GO）功能分析和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路富集分析。

1.3 免疫浸潤分析 采用單樣本基因集富集分析（single sample gene set enrichment analysis, ssGSEA）進行腫瘤免疫浸潤分析，Spearman相關分析評估SND1高表達組和低表達組與24個免疫細胞浸潤水平的相關性。

1.4 臨床樣本 收集天津醫科大學總醫院肺部腫瘤外科手術切除的LUAD組織及其對應的癌旁組織10例。本研究嚴格遵守天津醫科大學總醫院倫理委員會的倫理準則，并獲得了參與者的書面同意。

1.5 細胞培養 肺癌細胞系（NCI-H1975、A 549、NCI-H1299、HCC827和PC-9）和人正常肺上皮細胞系（BEAS-2B）均用含10%胎牛血清（Gibco, NY, USA）的DMEM培養基，于37oC、5% CO2濃度的培養箱中培養。

1.6 實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR） 常規Trizol法提取細胞總R NA，2.0 μg總R NA用反轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit［TaKaRa，寶生物工程（大連）有限公司］反轉錄成cDNA，然后按照產品說明書進行qRT-PCR。實時熒光定量PCR檢測SND1和GA PDH mR NA 水平。SND1引物序列為：正向引物5’-GGTGGACTACATTAGACCAGCC-3’，反向引物5’-AGACCTTTGCTGACAAGCCTC-3’。GAPDH引物序列為：正向引物5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，反向引物5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。每個反應重復3次，以確保數據的準確性和可靠性，2ΔΔCT法計算SND1表達水平。

1.7 免疫印跡 使用RIPA裂解緩沖液（上海碧云天生物技術有限公司）裂解細胞提取總蛋白。30 μg蛋白樣本經10%SDS-PAGE凝膠電泳，并轉移至PVDF膜上。用5% BSA室溫封閉2 h。封閉后，將膜與SND1抗體（ab65078, Abcam,1:1000）在4 °C下孵育過夜。然后在膜上孵育過氧化氫酶（horseradish peroxidase, HRP）結合的二抗2 h，曝光顯影。用Image J分析條帶灰度值。

1.8 免疫熒光 將H1975和A549細胞以每孔1×105個接種于無菌玻片上，培養24 h后取出玻片并用4%多聚甲醛溶液固定，以保持其形狀和結構的完整性。細胞經用0.1% Triton X-100處理后，5% BSA封閉液，加入SND1（1:200）抗體4 °C孵育過夜。隨后，加入熒光標記的二抗于37 °C孵育40 min。熒光顯微鏡下觀察SND1的表達和亞細胞定位。

1.9 細胞周期分析 收集并清洗H1975和A549細胞沉淀，70%乙醇4 °C固定過夜，經RNase A在37 °C下孵育30 min處理，終濃度50 μg/mL的碘化丙啶（propidium iodide, PI）室溫避光孵育30 min。使用流式細胞儀對細胞周期進行檢測。

1.10 免疫組化（immunohistochemistry, IHC） 常規脫蠟法處理患者病理切片，檸檬酸鈉緩沖液進行抗原修復，SND1抗體（1:100）4 °C孵育過夜。經PBS沖洗3次后，與二抗室溫孵育1 h再滴加新鮮的DAB進行染色，經蘇木素復染，并進行鏡檢分析。

1.11 細胞增殖分析 EdU實驗用來評估細胞增殖情況。細胞以每孔6×103個的密度接種于96孔板上，培養箱中培養48 h。每孔中加入10 μL EdU試劑孵育2 h。細胞經4%多聚甲醛和0.5% Triton X-100溶液固定和透化處理后，Hoechst染色并通過熒光顯微鏡拍照記錄。通過公式：EdU陽性細胞（紅色染色）數/Hoechst 33342陽性細胞（藍色染色）總數，計算分析細胞的增殖情況。CCK-8法分析細胞增殖。收集細胞，以每孔1×104個細胞接種于96孔板上，細胞培養0、12、24、48 h后加入CCK-8處理，酶標儀檢測光密度（optical delnsity, OD）值后分析細胞增殖情況。所有實驗均重復3次，以確保統計分析的可信度。

1.12 侵襲試驗 Transwell小室實驗用來評估細胞侵襲情況。Transwell小室預先用基質凝膠（Corning）包被過夜。將1.2×105個細胞以100 μL不含胎牛血清的培養基接種于上室，下室中加入600 μL含有10% FBS的完全培養基作為趨化誘導劑。孵育48 h后，用4%的多聚甲醛固定，并用0.1%的結晶紫染色。顯微鏡下拍照，分析細胞的侵襲情況。每項實驗均獨立進行3次。

1.13 統計分析 使用GraphPad Prism 9.0軟件進行統計分析。計量數據用均數±標準差（Mean±SD）表示。采用t檢驗來評估兩組間的差異，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 SND1在LUAD中的表達上調 為了探索人源SND1在LUAD中的致癌作用，我們首先利用cBioPortal數據庫分析了SND1在LUAD中的突變情況，結果顯示SND1基因在超過3%的LUAD患者中存在基因改變，主要表現為突變和深度缺失（圖1A）。通過在TCGA和GEO數據庫收集的數據集分析SND1在LUAD中的表達情況，提示LUAD組織的SND1 mRNA表達量明顯高于癌旁肺組織（P＜0.001）（圖1B）。進一步，通過分析TCGA數據庫中57例LUAD組織和其配對遠癌組織，證實了SND1在LUAD組織中顯著上調（圖1C）。GEO數據集GSE116959和GSE68517的分析也得出相似的結果（圖1D）。

為了進一步明確SND1在LUAD中的表達情況，我們使用CPTAC數據庫分析SND1在LUAD中的蛋白表達情況，結果顯示，LUAD組織中的SND1蛋白表達相較癌旁肺組織顯著升高（圖1E）。此外，HPA數據庫中的分析結果也表明，與配對的遠癌組織相比，SND1在LUAD組織中的蛋白表達顯著升高（圖1F）。為了進一步驗證研究結果，我們利用CCLE數據集來分析SND1基因在各NSCLC細胞系中的表達情況，結果顯示，SND1在多個肺癌細胞系中的表達顯著上調（圖1G）。

2.2 SND1表達與LUAD患者臨床因素的相關性 為了探討SND1的表達和患者臨床病理特征的關系，我們利用UALCAN數據庫分析SND1在不同腫瘤分期和淋巴結轉移不同階段的表達情況。結果表明，在腫瘤分期I和II期及淋巴結轉移陰性的患者組織中，SND1的表達水平較低（圖2A、2B）。而且，SND1蛋白表達與LUAD的分化程度密切相關，分化程度越高，SND1蛋白越高（圖2C）。采用Kaplan-Meier評估SND1表達與生存時間的相關性。結果提示，SND1高表達患者的OS時間明顯短于SND1低表達患者（HR=1.18, 95%CI: 1.04-1.35,P=0.013）（圖2D）。受試者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲線分析表明SND1對LUAD具有明顯的診斷價值，是LUAD重要的診斷性ROC獨立指標［曲線下面積（area under the curve,AUC）為0.877］。上述結果表明SND1是LUAD重要的促癌基因，并且有可能成為LUAD的分子標志物和治療靶點。

圖2 SND1與LUAD的臨床相關性。A、B：TCGA數據庫（UCLCAN）中不同腫瘤分期和淋巴結轉移的LUAD中SND1的表達；C：CPTAC數據庫中不同分化狀態LUAD中SND1蛋白表達水平；D：根據SND1在LUAD中的表達水平計算的OS的Kaplan-Meier生存曲線；E：基于TCGA數據庫的SND1在LUAD中的ROC曲線。與正常對照組相比，*P＜0.05，***P＜0.001。Fig 2 Clinical correlation between SND1 and LUAD. A, B: Expression of SND1 in LUAD stratified by tumor stages and lymph node metastases status in the TCGA database (UCLCAN); C: Protein expression levels of SND1 stratified by grades of LUAD in the CPTAC database; D: Kaplan-Meier survival curves for the OS according to the expression levels of SND1 in LUAD; E: ROC curve of SND1 in LUAD based on TCGA database. OS: overall survival;ROC: receiver operating characteristic; AUC: area under the curve; ns: not significant. Compared with normal control group, *P＜0.05, ***P＜0.001.

2.3 SND1的分布和亞細胞定位 我們通過HPA數據庫分析SND1的分布和亞細胞定位，圖3A顯示了SND1在人不同器官中的表達圖譜，可見SND1在所有器官中都有表達（圖3A）。HPA數據庫的細胞結構圖還顯示，SND1在小鼠細胞中主要定位于細胞質中（圖3B）。為了進一步確定SND1在人LUAD細胞中的亞細胞定位，我們使用免疫熒光檢測SND1在BEAS-2B、H1975、A549和HCC827細胞的蛋白表達情況。圖3C顯示SND1主要定位于LUAD細胞質中，與HPA數據庫分析的數據相一致。

圖3 SND1在體內和細胞中的分布。A、B：基于人類蛋白質圖譜的SND1體內和細胞內分布；C：共聚焦熒光顯微鏡觀察SND1在LUAD細胞中的表達及定位（×100）。Fig 3 Location of SND1 distribution in vivo and in cells. A, B: In vivo and intracellular SND1 distribution based on the human protein atlas; C:Confocal fluorescence microscopy to examine the location of SND1 expression in LUAD cells (×100).

2.4 相關基因和差異基因的功能富集 為了探索SND1在LUAD中的功能，我們利用STRING數據庫分析了與SND1相互作用的蛋白，并構建PPI網絡圖（圖4A）。另外，基于TCGA的數據，我們利用Spearman相關性分析篩選出了與SND1相關性最強的500個基因。隨后對這500個基因進行了KEGG通路富集和GO功能富集，結果顯示，SND1參與了真核生物的內質網蛋白加工、細胞周期、細胞凋亡、DNA復制和核糖體生物發生等生物過程和信號通路（圖4B）。GO細胞成分分析結果顯示SND1相關基因主要富集在細胞核中，包括細胞核、核腔、蛋白復合物、核質和細胞內無膜結構的細胞器（圖4C）。GO生物過程分析結果顯示，SND1相關基因主要富集在大分子生物合成過程、細胞氮化合物生物合成過程、細胞大分子生物合成過程和細胞周期（圖4D）。而GO分子功能主要富集在核酸結合、RNA結合、小分子結合、核苷酸結合和核苷磷酸結合方面（圖4E）。

圖4 SND1相關基因的功能富集。A：SND1相關蛋白相互作用網絡；B：相關基因的KEGG富集注釋；C-E：相關基因的GO富集注釋，包括CC、BP和MF；F：高SND1表達組與低SND1表達組DEGs的火山圖；G：染色體分離調控；H：DNA復制啟動；I：有絲分裂紡錘體的組裝；J：細胞周期DNA復制；K：有絲分裂核分裂。Fig 4 Functional enrichment of SND1 related genes. A: SND1-related protein interactions networks; B: KEGG enrichment annotation of related genes; C-E: GO enrichment annotation of the related genes, including CC, BP and MF; F: The volcano plot of the DEGs in the high-SND1 expression group vs low-SND1 expression group; G: Regulation of chromosome segregation; H: DNA replication initiation; I: Mitotic spindle assembly; J: Cell cycle DNA replication; K: Mitotic nuclear division. DEGs: differentially expressed genes.

為了進一步研究SND1的生物學功能，基于TCGA數據庫中SND1的表達量將LUAD中SND1表達分為高表達組和低表達組。以調整后的P＜0.05和|log2 FC|＞1為臨界值，我們篩選出477個差異表達基因（differentially expressed genes,DEGs）（圖4F）。通過基因組富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA），我們發現SND1差異基因在染色體分離調控基因集、DNA復制啟動基因集、有絲分裂紡錘體組裝基因集、細胞周期DNA復制基因集和有絲分裂核分裂基因集等重要過程的基因集中顯著富集（圖4G-4K）。這些發現表明，SND1可能通過影響LUAD細胞的細胞周期和染色體分離等生物學過程影響LUAD的發生發展。

2.5 免疫細胞浸潤與LUAD中SND1的異常表達有關 為了研究SND1表達與免疫細胞浸潤水平的關系，我們利用ssGSEA法進行免疫浸潤分析。結果顯示，16種免疫細胞類型在SND1高表達和低表達兩組中的表達模式差異較大。值得注意的是，SND1高表達組的B細胞、T細胞、樹突狀細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞和巨噬細胞的表達水平較低（圖5A）。

圖5 SND1表達與免疫細胞浸潤。A：SND1高表達組和SND1低表達組中16種免疫細胞的差異表達；B：SND1與LUAD中免疫檢查點基因的關系；C-E：SND1表達與基質評分、免疫評分和估計評分的關系。Fig 5 SND1 expression and immune cell infiltration. A: Differential expression of 16 immune cells in high SND1 expression group and low SND1 expression group; B: Relationship between SND1 and immune checkpoint genes in LUAD; C-E: Relationship between SND1 expression and stromal score, immune score and estimate score. *P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001.

同時，我們還觀察到SND1的表達與免疫抑制相關基因（包括BTLA、CTLA4、PDCD1、IDO1、SLAMF7、TIGIT、IL-10、CD274和IL-4）呈正相關，而與VTCN1、EDNRB、VEGFA、VEGFB則呈負相關（圖5B）。此外，SND1的表達與免疫刺激相關基因，如ICOSLG、TNFRSF9、CD28、TNF、PRF1、CD80、IL-2RA、IL-2、ICOS、IFNG、CXCL10和CXCL9等呈正相關，而與CX3CL1和TNFSF4呈負相關。進一步地，通過Spearman分析，我們還發現SND1的表達與免疫反應相關的評分（包括免疫評分、估計評分和間質評分）呈負相關（圖5C-5E）。這些發現共同表明，SND1與多種免疫細胞浸潤和免疫相關基因存在一定聯系，可能作為LUAD免疫療法療效潛在的預后指標。

2.6 SND1對LUAD細胞周期、增殖、遷移和侵襲的影響 為了驗證上述的研究結果，我們檢測了SND1在人正常支氣管上皮細胞BEAS-2B以及H1975、A549、PC9、H1299等LUAD細胞系中的表達。與人正常支氣管上皮細胞BEAS-2B相比較，SND1在4株LUAD細胞系中的mRNA和蛋白水平上的表達均顯著上調（圖6A、6B）。此外，免疫組化的結果顯示SND1在LUAD組織中的蛋白表達明顯高于其相應的癌旁組織（圖6C）。

圖6 SND1在LUAD細胞系和組織中的表達情況。A、B：SND1在支氣管上皮細胞系（BEAS-2B）和4種NSCLC細胞系（H1975、A549、PC9和H1299）中的mRNA水平和蛋白水平表達；C：10例LUAD患者腫瘤和非腫瘤組織中SND1的免疫組化染色。與BEAS-2B細胞系相比，*P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001。Fig 6 SND1 expression in LUAD cell lines and tissues. A, B: Expression of SND1 in bronchial epithelial cell lines (BEAS-2B) and four NSCLC cell lines(H1975, A549, PC9 and H1299) at mRNA level and protein level; C: Immunohistochemical staining of SND1 in tumor and non-tumor tissues from ten LUAD patients. Compared with BEAS-2B cell line, *P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001.

為了進一步驗證我們之前的發現，我們選擇SND1表達量較高的LUAD細胞系H1975和A549進行下一步功能實驗的探索，并利用siRNA技術抑制細胞中SND1的表達。圖8A結果顯示，H1975和A549細胞轉染SND1 siRNA后，SND1在mRNA和蛋白水平的表達上都出現了顯著降低（圖7A）。CCK-8細胞增殖實驗結果顯示，下調SND1表達，能明顯抑制H1975和A549的細胞活力（圖7B）。EdU法檢測也提示敲低SND1表達能顯著抑制肺癌細胞的增殖（圖7C）。同時，流式細胞術檢測結果顯示，與H1975 NC組相比，H1975 si-SND1轉染組細胞處于G1期的比例明顯增加。在A549細胞中也得到了相似的結果（圖7D、7E）。為了探索SND1對H1975和A549細胞遷移和侵襲的影響，我們進行了細胞劃痕實驗和Transwell實驗，結果表明下調SND1表達能顯著降低H1975和A549細胞的遷移和侵襲能力（圖7F、7G）。為了進一步探討SND1促進LUAD細胞增殖和遷移侵襲的機制，我們利用蛋白免疫印跡檢測抑制SND1表達對細胞周期和遷移侵襲相關蛋白的影響，結果顯示，抑制SND1表達能顯著降低兩個關鍵細胞周期調控因子CDK4和cyclin-D1的表達。而細胞周期抑制因子p21和腫瘤抑癌基因p53的表達顯著上調，Snail和Vimentin的表達在敲低后降低（圖7H）。以上結果表明，SND1在促進LUAD細胞的增殖、遷移和侵襲中發揮著重要作用。

圖7 SND1對LUAD細胞周期、增殖、遷移和侵襲的影響。A：轉染si-NC和si-SND1后H1975和A549細胞的相對mRNA和蛋白水平；B：CCK-8檢測敲低SND1后H1975和A549細胞的細胞增殖；C：敲低SND1后H1975和A549細胞的EdU檢測結果（×20）；D、E：細胞周期檢測顯示SND1敲低誘導肺癌細胞G1期阻滯；F、G：劃痕和侵襲實驗結果顯示，與對照細胞相比，SND1敲低細胞的遷移和侵襲能力降低（×10）；H：與對照組相比，SND1敲低組中細胞周期、遷移和侵襲相關蛋白的表達。Fig 7 Effects of SND1 on LUAD cell cycle, proliferation, migration and invasion. A: Relative mRNA and protein levels of H1975 and A549 after transfection with si-NC and si-SND1; B: CCK-8 assay of cell proliferation in H1975 and A549 cells after SND1 knockdown; C: EdU assay results of H1975 and A549 after SND1 knockdown (×20); D, E: Cell cycle assay showed that SND1 knockdown induced G1 phase arrest; F, G: The results of scratch and transwell invasion assays showed reduced migration and invasion of SND1 knockdown cells compared with control cells (×10); H: Expression of cycle,migration and invasion-related proteins in the SND1 knockout group compared to controls. *P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001. OD: optical density.

3 討論

近年來，盡管科研人員對LUAD的治療和潛在機制開展了大量的研究，但患者的總體生存率仍然很低[3]。這些患者即使接受了放療和化療，腫瘤仍會復發和轉移，因此，迫切需要找到并驗證能準確評估LUAD進展的新型預后標志物。

以往的研究[11-13]顯示，SND1在乳腺癌、直腸癌和肝細胞癌等多種實體腫瘤表達上調。同時，其表達與多種癌癥的增殖、侵襲和遷移等惡性生物學過程密切相關。有研究[14,15]發現SND1在調節包括ERK和NF-κB在內的重要信號通路中起著至關重要的作用，而這些信號通路在腫瘤細胞的生長、轉移和腫瘤耐藥性中發揮重要作用。在結腸癌中，SND1陽性表達是結腸癌預后不良的獨立預測因子。SND1與星形膠質細胞升高基因1（metadherin,MTDH）相互作用促進了腫瘤的發生發展[16]。Yu等[17]報道，在乳腺癌中，SND1作為轉化生長因子β1（transforming growth factor-β1,TGFβ1）信號通路的一個關鍵調節因子，在促進乳腺癌細胞轉移中發揮重要作用。然而，SND1在LUAD中的作用尚未完全清楚。因此，本研究旨在探討SND1對LUAD細胞生物學功能和預后的影響，為LUAD的診斷治療提供潛在靶點。我們的研究證實，SND1在LUAD腫瘤組織中的表達明顯上調，SND1的高表達與LUAD臨床分期和淋巴結轉移密切相關。此外，對10例LUAD患者組織樣本的免疫組化分析表明，與癌旁組織相比，LUAD組織中SND1的表達顯著上升。同時，我們發現SND1的表達水平與LUAD細胞的增殖、遷移和侵襲能力之間存在聯系。在肺癌細胞系中利用siRNA技術敲低SND1表達，周期蛋白CDK4和cyclin-D1的表達也同時下降。我們的研究結果表明SND1可能是一個癌基因，在LUAD的發生發展中起重要作用。

此外，我們還觀察到SND1的表達與免疫細胞浸潤水平之間存在相關性，這表明了它在腫瘤微環境中的重要性。腫瘤微環境中免疫細胞與腫瘤細胞之間的相互作用，受到免疫細胞滲入腫瘤程度的影響[18]。研究[19,20]證實了CD4+T、輔助細胞（T helper, Th）和B細胞在癌癥的發生發展和癌癥免疫療法中的關鍵作用。在乳腺癌中，SND1與MTDH形成復合物，并通過結合和破壞Tap1/2 mRNA發揮作用。這種破壞會降低腫瘤抗原的表達，從而阻礙T細胞的浸潤和活化，進而使得癌細胞獲得免疫逃逸[21]。在LUAD的研究中，B細胞和CD4+濾泡輔助細胞共同增強CD8+T細胞的效應功能，從而加強抗腫瘤免疫反應[22]。此外，高水平的肥大細胞浸潤和CCR2+細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocytes, CTLs）的增加與LUAD患者的良好預后密切相關[23]。我們通過ssGSEA免疫浸潤分析發現，SND1表達改變時也會引起免疫細胞如B細胞、T細胞、樹突狀細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞和巨噬細胞水平的降低。免疫微環境中效應細胞比例的降低往往提示著患者的預后較差。這表明，SND1可能在調節免疫細胞的浸潤中發揮重要作用，可能通過影響免疫細胞浸潤程度而影響LUAD患者的預后。盡管我們的研究結果表明SND1與免疫浸潤相關，然而，SND1是否可作為LUAD免疫治療反應的標志物還需要更深入的探索，SND1影響LUAD免疫浸潤的確切機制還需要更深入的研究。

綜上所述，盡管本研究通過公共數據庫和體外實驗證實了SND1在LUAD中的重要促癌作用，為SND1作為LUAD患者重要的預后標志物提供了有價值的數據，但仍存在一些局限性。首先，我們的研究僅側重于探討SND1與LUAD之間的相關性，SND1參與LUAD生物學功能的具體機制尚不清楚，需要進一步的研究。其次，雖然我們進行了細胞實驗驗證了生物信息學的結果，但沒有用動物實驗進一步驗證。SND1與免疫浸潤細胞的相關性僅在生物信息學中得到驗證，考慮到腫瘤免疫微環境的復雜性，動物模型可以更全面地了解SND1在LUAD免疫微環境中的作用。總之，本研究探討了SND1的表達及其對LUAD惡性生物學行為以及患者預后的影響，這有助于進一步了解SND1在包括LUAD在內的人類腫瘤中的關鍵作用。

Competing interests

The authors declare that they have no competing interests.

Author contributions

Liu HY, Chen J, Li YW designed the research studies.Zhang RH, Huang H, Cao PJ, Wu D and Ding C performed the experiments. Chen C, Zhu GS and Huang H analyzed data. Zhang RH and Li YW wrote the manuscript. Liu HY provided financial support. Liu HY, Chen J and Li YW supervised the project. All authors made comments on the manuscript.