雙靶向融合蛋白用于新城疫病毒La Sota株對鴨的免疫效率的提高作用

摘要：" 本研究旨在探究雙靶向融合蛋白用于新城疫病毒（NDV） La Sota毒株對鴨的免疫效率的提高作用，為提升鴨新城疫免疫防控能力做有益探索。將特異性結合囊膜病毒表面糖蛋白的紅藻凝集素（GRFT）與靶向結合禽樹突狀細胞的納米抗體分子（VHH）的編碼基因進行串聯表達，經大腸桿菌表達系統制備雙靶向融合蛋白。利用組氨酸（His）標簽純化GRFT-VHH融合蛋白，采用有限稀釋法定量評價融合蛋白與La Sota病毒的結合能力。用飽和結合融合蛋白的La Sota病毒制備疫苗，分組免疫無特定病原體（SPF）雛鴨，監測免疫后血凝抑制（HI）抗體效價以及IL-4、IFN-γ細胞因子水平。結果顯示，構建的重組大腸桿菌能夠高效表達融合蛋白，經Ni柱純化回收的GRFT-VHH54、GRFT-VHH74蛋白質量濃度分別為230 μg/mL、1 350 μg/mL，僅需100 ng融合蛋白即可完全結合1×108半數感染量（EID50）病毒；NDV+GRFT-VHH54組免疫后21 d HI抗體效價達到7 log22以上，血清中IL-4和IFN-γ含量分別為80.0 pg/mL、8.8 pg/mL，顯著高于NDV單獨免疫組（Plt;0.05）。雙靶向融合蛋白GRFT-VHH54能夠提高新城疫病毒La Sota株對鴨的免疫效率，可作為免疫增強劑做進一步的開發與應用。

關鍵詞：" 新城疫病毒；融合蛋白；靶向；免疫效率

中圖分類號：" S831.7""" 文獻標識碼：" A""" 文章編號：" 1000-4440（2024）12-2317-07

收稿日期：2024-06-30

基金項目：江蘇農牧科技職業學院院級課題（NSF2023ZR13）

作者簡介：李" 玲（1981-），女，江蘇鹽城人，碩士，講師，主要從事動物疾病防控研究。（E-mail）ll20220215@163.com

通訊作者：徐" 海， （E-mail）hai_x@126.com

李" 玲，祝博森，朱" 婷，等. 雙靶向融合蛋白用于新城疫病毒La Sota株對鴨的免疫效率的提高作用［J］. 江蘇農業學報，2024，40（12）：2317-2323.

doi：10.3969/j.issn.1000-4440.2024.12.015

Immunoenhancement of Newcastle disease virus La Sota strain in ducks by dual-targeting fusion protein

LI Ling1，" ZHU Bosen1，" ZHU Ting1，" SHANG Lu2，3，" DENG Bihua3，4，" LU Yu3，4，" XU Hai2，3

（1.Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College， Taizhou 225300， China;2.Taizhou Institute of Agricultural Sciences， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Taizhou 225300， China;3.GuoTai （Taizhou） Center of Technology Innovation for Veterinary Biologicals， Taizhou 225300， China;4.Institute of Veterinary Immunology ＆ Engineering， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China）

Abstract：" This study aimed to explore the enhanced immunogenicity of the Newcastle disease virus （NDV） La Sota strain in ducks through a dual-targeting fusion protein， providing valuable insights for improving NDV immune prevention and control capabilities. The genes encoding Griffithsin （GRFT） that specifically binds to the surface glycoprotein of enveloped viruses and nanoantibody molecules （VHH） targeting avian dendritic cells were co-expressed in tandem using the Escherichia coli system and purified via a His-tag. The binding capacity of the GRFT-VHH fusion protein to the La Sota virus was quantitatively assessed using a limited dilution method. Vaccines were prepared with La Sota virus saturated with the fusion protein and administered to groups of specific pathogen free （SPF） ducklings. After immunization， the hemagglutination inhibition （HI） antibody titer and levels of cytokines IL-4 and IFN-γ were evaluated. Results indicated that the constructed recombinant E. coli efficiently expressed the fusion protein. The concentrations of GRFT-VHH54 and GRFT-VHH74 purified by Ni column were 230 μg/mL and 1 350 μg/mL， respectively. Only 100 ng of the fusion protein was required to fully bind 1×108 median infective dose （EID50） virus. The HI antibody titer in the NDV+GRFT-VHH54 group reached more than 7 log22， and the levels of IL-4 and IFN-γ in serum were 80.0 pg/mL and 8.8 pg/mL respectively at 21 d post-immunization， which were significantly higher than those in the NDV group （Plt;0.05）. The dual-targeting fusion protein GRFT-VHH54 can enhance the immunogenicity of the NDV La Sota strain in ducks， and can be used as an immunopotentiator for further development and application.

Key words：" Newcastle disease virus;fusion protein;targeting;immune efficiency

新城疫病毒（Newcastle disease virus， NDV）是一種有囊膜的線性單股負鏈RNA病毒，屬于副黏病毒科（Paramyxoviridae）禽腮腺炎病毒亞科（Avulavirinae）正禽腮腺炎病毒屬（Orthoavulavirus）正禽腮腺炎病毒1型（Avina orthoavulavirus 1）的成員。自1926年首次被報道以來，經歷了4次世界范圍內的大流行，其宿主范圍不斷擴大，能感染的禽類超過250種，對家禽養殖業造成嚴重危害，而水禽被認為是NDV的天然儲存宿主，一般無臨床癥狀或僅表現輕微癥狀。中國自1997年報道了水禽群因感染NDV出現高發病率和死亡率后，鴨、鵝自然感染發病的情況時有發生。近年來，隨著養鴨產業的集約化與規模化，鴨群感染強毒NDV而造成嚴重損失的情況時有報道，感染范圍涵蓋了番鴨、半番鴨、麻鴨以及野鴨等諸多品種。

接種疫苗是預防和控制傳染病的有效手段之一。當前，新城疫（ND）載體疫苗、滅活疫苗以及減毒活疫苗在臨床上應用廣泛，有效控制了雞新城疫的發生與流行。但國內市場尚未有商品化的鴨源ND疫苗，鴨場防疫主要依靠傳統的雞ND疫苗作為替代，其免疫效果在學界一直存在爭議。Nishizawa等利用新城疫La Sota株活疫苗免疫北京鴨，在異源NDV毒株攻擊后未能分離到病毒，說明疫苗接種對減少NDV的傳播具有重要意義。石躍采用新城疫La Sota株活疫苗接種紹興鴨和綠頭鴨，結果發現病毒在2種鴨體內未能高效復制，刺激機體產生的中和抗體水平較為低下，并不能提供有效的免疫保護。胡焱等對比了新城疫病毒Ⅰ系活疫苗（CS2株）、Ⅳ系滅活疫苗（La Sota株）以及重組基因Ⅶ型滅活疫苗（A-Ⅶ株）對貴州三穗麻鴨的免疫效果，結果發現3種疫苗均能誘導產生較高的抗體滴度，且A-Ⅶ株誘發的抗體滴度最高，持續時間最長，能有效抑制免疫鴨排毒。因此，基于前人的臨床研究結果，筆者認為在沒有專屬鴨用ND疫苗的情況下，加強現有ND疫苗對鴨的免疫應答水平，進而提高交叉保護能力，仍是目前防控鴨NDV的關鍵所在。

本研究擬開發一種新型雙靶向融合蛋白用作ND疫苗的免疫增強劑。該融合蛋白由特異性結合囊膜病毒表面糖蛋白的紅藻凝集素（GRFT）與靶向結合禽樹突狀細胞的納米抗體分子（VHH）2個亞基組成。GRFT亞基負責與NDV表面囊膜結合，而游離的VHH亞基則負責引導病毒主動結合樹突狀細胞，加速抗原的捕獲與加工遞呈，促進機體產生更為廣泛和強烈的免疫應答。為此，采用大腸桿菌表達系統制備雙靶向融合蛋白，飽和結合La Sota毒株后制備油乳劑滅活疫苗，分組免疫無特定病原體（SPF）雛鴨，檢測抗體效價和細胞因子水平，旨在為提升ND疫苗免疫效率做有益探索。

1" 材料與方法

1.1" 試驗材料

大腸桿菌BL21-DE3、DH5α、pET-32a（+）質粒均由江蘇農牧科技職業學院保存；新城疫病毒La Sota株由江蘇省農業科學院國家獸用生物制品工程技術研究中心提供。限制性內切酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶均為大連寶生物公司產品；膠回收試劑盒為德國凱杰公司產品；鴨IFN-γ、IL-4酶聯免疫吸附測定（ELISA）檢測試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司；其余試劑均為分析純。臺式離心機購自美國Beck-man公司； PCR儀購自大連寶生物公司；Geldoc-It Imaging System購自美國UVP公司，酶標儀購自美國Bio-rad公司。

1.2" 雙靶向融合蛋白重組表達載體構建

將特異性結合囊膜病毒表面糖蛋白的GRFT與特異性結合禽樹突狀細胞的納米抗體分子VHH54、VHH74進行串聯，其原理如圖1所示。根據大腸桿菌表達系統進行密碼子優化，將GRFT-VHH54、GRFT-VHH74基因序列送金唯智生物有限公司合成，并根據pET-32a（+）載體多克隆位點在基因上下游分別添加Nde Ⅰ和Bam H Ⅰ酶切位點。雙酶切合成的基因與pET-32a（+）載體，用1%瓊脂糖凝膠電泳回收、純化目的基因與載體，并以摩爾比3∶1進行連接，轉化大腸桿菌BL21-DE3感受態細胞。將轉化產物涂布在含有氨芐青霉素（Amp+）固體培養基的平皿，37 ℃過夜培養，次日挑選單菌落培養，提取質粒，篩選重組子，鑒定正確的重組表達載體并命名為pET-GRFT-VHH54、pET-GRFT-VHH74。

1.3" 雙靶向融合蛋白表達與鑒定

過夜培養pET-GRFT-VHH54、pET-GRFT-VHH74重組菌，次日按1∶100（體積比）轉接，37 ℃振蕩培養2.5 h （OD600為0.4～0.6），加入異丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷（IPTG）至濃度為0.5 mmol/L，繼續誘導培養5.0 h，收獲細菌。使用SDS-PAGE、Western-blot鑒定融合蛋白的表達，根據His標簽層析柱（HisTrap HP）操作說明純化蛋白質，使用微量分光光度計（Nanodrop）定量后保存備用。

1.4" 融合蛋白與新城疫病毒的互作關系

將新城疫La Sota病毒調整滴度至1 mL 1×109 半數感染量（EID50），然后做連續2倍比稀釋，每個稀釋度取10 μL點樣于硝酸纖維膜，同時設置磷酸鹽緩沖液（PBS）作為陰性對照，融合蛋白作為陽性對照。待完全干燥后將膜轉移至1%脫脂乳中，4 ℃過夜封閉。次日，用含0.5%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液（PBST）洗膜3次，轉入質量濃度為2 μg/mL的融合蛋白中孵育45 min，用PBST洗膜3次，再轉入1∶5 000稀釋的辣根過氧化酶標記的抗組氨酸標簽（HRP Anti-6X His Tag）的抗體中孵育45 min，用PBST洗滌3次，用二氨基聯苯胺（DAB）底物顯色，觀察反應情況。將1 mL 1×109 EID50的新城疫La Sota病毒包被于96孔ELISA板，在1%脫脂乳中，4 ℃過夜封閉。調整融合蛋白質量濃度至2 μg/mL，然后做2倍比梯度稀釋，加入1孔100 μL包被了病毒的ELISA板中，每個稀釋度做3個重復，37 ℃孵育45 min。用PBST洗滌5次，每孔加入1∶10 000稀釋的抗Histag-HRP抗體，37 ℃孵育45 min。用PBST洗滌5次，加入3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺（TMB）底物顯色10 min，每孔加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應，讀取OD450值。

1.5" 疫苗制備與分組免疫

取10 mL滴度為1 mL 4×108EID50新城疫La Sota病毒，加入0.1%二乙烯亞胺（BEI）進行滅活。取其中5 mL滅活病毒與質量濃度為2 μg/mL融合蛋白等體積混合，37 ℃孵育1 h；剩余5 mL滅活病毒與等體積PBS混合。以體積比54∶46將抗原與ISA206佐劑進行混合，充分乳化后制備成疫苗。選取10日齡SPF鴨分成7組，每組10羽，接種制備的滅活疫苗，于接種后7 d、21 d、35 d采血評價免疫效率。疫苗配比及分組情況見表1。

1.6" 免疫效率的評價

在免疫后7 d、21 d、35 d采血并分離出血清，血凝抑制（HI）抗體效價測定按照中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業標準《新城疫檢疫技術規程》（SN/T 0764-2011）進行。根據ELISA檢測試劑盒操作說明，測定免疫后第21 d血清樣品中IFN-γ、IL-4含量。

1.7" 數據統計與分析

運用SPSS Statistics 19軟件對抗體水平和細胞因子含量數據進行統計分析，采用單因素方差分析和Tukey事后檢驗，不同字母標記表示組間的差異顯著（Plt;0.05）。

2" 結果與分析

2.1" 重組質粒載體構建與融合蛋白表達

提取重組質粒載體pET-GRFT-VHH54、pET-GRFT-VHH74，經Bam HⅠ、HapⅠ雙酶切后得到約2 100 bp的目的基因片段，大小符合預期（圖2A、圖2B），測序分析發現，基因序列正確、閱讀框無移碼。重組菌經IPTG誘導后表達出約27 000目標蛋白（圖2C），Western-blot檢測結果顯示，該蛋白質與抗His標簽特異性抗體有較好的反應活性（圖2D）。

2.2" 融合蛋白與La Sota毒株結合能力的定量分析

利用融合蛋白上的His標簽，經Ni柱親和純化，收獲目的蛋白，經SDS-PAGE檢測，GRFT-VHH54、GRFT-VHH74融合蛋白的條帶較為單一（圖3A）；Nanodrop測定結果顯示，GRFT-VHH54、G-RFT-VHH74蛋白質量濃度分別為230 μg/mL、1 350 μg/mL。通過固定病毒稀釋融合蛋白的方式測定二者的結合能力，結果（圖3B）顯示，當投入的融合蛋白大于100 ng時即可完全結合1×108 EID50病毒，繼續增加融合蛋白的量至200 ng，OD450值未能繼續升高。融合蛋白投入量下降，其結合在病毒表面的融合蛋白含量也隨之減少，表現為OD450值的降低。通過固定融合蛋白稀釋病毒的方式測定二者的結合能力，結果（圖3C）顯示，隨著吸附在硝酸纖維膜上的病毒量減少，顯色反應逐漸減弱，表現為顯色圈的縮小以及顏色變淡。

2.3" HI抗體水平的檢測

各組鴨只HI抗體效價如圖4所示：免疫后7 d至21 d，各免疫組抗體整體呈上升趨勢，且第21 d時NDV+GRFT-VHH54組抗體效價顯著高于其他組（P＜0.05），NDV+GRFT-VHH74組與NDV組差異不顯著（P＞0.05）。免疫后21 d至35 d，各免疫組抗體效價未能持續上升，且NDV、1/2NDV+GRFT-VHH74和NDV+GRFT-VHH74組抗體效價顯著下降，僅NDV+GRFT-VHH54組抗體效價仍達到7 log22以上。

2.4" 細胞因子水平的檢測

免疫后21 d，各試驗組每羽鴨血清中IL-4和INF-γ含量如圖5A所示：NDV+GRFT-VHH54免疫組鴨只血清中IL-4含量最高，達到80.0 pg/mL，且顯著高于1/2NDV、NDV、1/2NDV+GRFT-VHH54、1/2NDV+GRFT-VHH74以及NDV+GRFT-VHH74免疫組（Plt;0.05）。同樣，NDV+GRFT-VHH54免疫組鴨只血清中INF-γ含量最高，達到8.8 pg/mL，顯著高于其他試驗組（Plt;0.05）。

3" 討論

一直以來，鴨、鵝等水禽被認為對NDV具有較強的抵抗力，被感染帶毒但不表現臨床癥狀。2000年以來，張訓海等、李建軍等陸續報道了家鴨感染新城疫病毒導致死亡的病例，這些研究結果對傳統認知提出了挑戰。此外，在廣東、江蘇、安徽、福建以及浙江等多個省份的鴨群中發生一種新型傳染病，臨床表現為采食量下降、腹瀉、消瘦以及呼吸道、消化道、胰腺和脾臟出現潰瘍、出血等典型病變，最終被證實該病的病原是NDV強毒株。經過病毒分離和基因序列分析發現，鴨源強毒NDV以基因Ⅶ型為主，與雞源NDV毒株在基因序列、感染宿主范圍以及體外培養特性等方面存在一定差異。雖然新城疫病毒有多個基因型，但只有1個血清型，不同毒株之間存在抗原性和基因特性的差異，卻仍然保持一定的交叉保護性。當前中國新城疫疫苗使用較為廣泛的是B1、La Sota、N79、N88和C30毒株，尚沒有專屬于鴨、鵝以及鴿子等禽類的ND疫苗產品，在此背景下，通過提高現有ND疫苗免疫效率，進而達到更好的交叉保護效率仍是其他禽類防控新城疫的備選方案之一。

唐思靜等將大腸桿菌熱敏感性腸毒素突變體蛋白與NDV La Sota毒株共同免疫，能誘導高水平的黏膜免疫球蛋白A（IgA）和血清抗體。徐磊等發現豬脾臟轉移因子能夠提高NDV La Sota株免疫后IL-6、IL-10以及IL-21介導的免疫應答和ND HI抗體效價，還能降低強毒NDV攻擊后介導的炎癥反應和病毒血癥，進而提高La Sota株的免疫保護效率。因此，開發新型佐劑及免疫增強劑來提高ND疫苗的免疫效率對該病的防控仍有現實意義。本研究通過原核表達系統制備了GRFT-VHH雙靶向融合蛋白作為免疫增強劑，病毒粒子在融合蛋白的引導下，主動靶向結合抗原遞呈細胞，促進了抗原的加工遞呈，提升了免疫效率。

GRFT是一種廣譜的抗病毒蛋白，在病毒性疾病的預防與治療領域有著良好的應用前景，能夠與一切具有類似外殼糖蛋白結構的膜病毒非可逆的結合。體外試驗結果表明，100 ng的融合蛋白即可飽和結合1.000 0×108 EID50的La Sota病毒，而1.562 5×105 EID50的病毒也能被融合蛋白吸附，說明二者的結合具有較好的親和性和靈敏性。VHH54、VHH74是從T7噬菌體表面展示的羊駝源納米抗體文庫中篩選得到能結合雞、鴨、鵝等家禽骨髓源樹突狀細胞的納米抗體分子，本團隊前期已對該納米抗體分子的氨基酸組成、空間構象以及結合樹突狀細胞的選擇性與特異性等指標進行了檢測。

結合了融合蛋白的La Sota病毒能夠更快、更高地激發免疫反應，對比試驗結果顯示：對同等抗原含量的NDV進行免疫，NDV+GRFT-VHH54組產生的HI抗體水平顯著高于NDV組（Plt;0.05），而1/2抗原含量的NDV結合GRFT-VHH54后所激發HI抗體效價均值在免疫后的21～35 d亦高于全劑量NDV免疫組。雖然GRFT-VHH74蛋白具備結合La Sota病毒和樹突狀細胞的能力，但未能發揮免疫增強效果，NDV+GRFT-VHH74組與NDV組激發的HI抗體水平沒有顯著差異。此外，在免疫應答和抗感染免疫反應過程中細胞因子也發揮著重要作用。IL-4屬于Th2型細胞因子，具有促進B細胞增殖和分化的能力，是IgG1類抗體產生的關鍵因子；IFN-γ屬于Th1型細胞因子，是活化巨噬細胞的關鍵因子，能增強其吞噬和殺傷病原體的能力。與單獨免疫NDV相比，NDV+GRFT-VHH54組顯著上調了IL-4和IFN-γ表達水平，一方面解釋了該組為何能激發較高的HI抗體水平，另一方面可以預見該免疫組具備更強的抗病毒感染能力。由于受到試驗條件的限制，未能進行攻毒保護試驗，但抗體和細胞因子水平的比較能夠證明GRFT-VHH54具備免疫增強能力。此外，該研究也為提升家禽其他囊膜病毒疫苗的免疫效率提供很好的借鑒。

綜上所述，本研究成功構建雙靶向融合蛋白原核表達載體，制備的融合蛋白能夠高親和力、高靈敏度的結合NDV La Sota毒株，其中GRFT-VHH54融合蛋白能夠顯著提高La Sota疫苗免疫效率，激發更高水平的HI抗體以及上調IL-4和IFN-γ表達水平。

參考文獻：

連" 聰，溫肖會，呂殿紅，等. 我國新城疫分子流行病學研究進展. 廣東農業科學，2023，50（2）：115-124.

UL-RAHMAN A， ISHAQ H M， RAZA M A， et al. Zoonotic potential of Newcastle disease virus：old and novel perspectives related to public health. Reviews in Medical Virology，2022，32（1）：e2246.

MAO Q， MA S M， SCHRICKEL P L， et al. Review detection of Newcastle disease virus. Frontiers in Veterinary Science，2022，9：936251.

劉華雷，鄭東霞，孫承英，等. 1997-2005年中國水禽新城疫分子流行病學特點分析. 畜牧獸醫學報，2009，40（1）：145-148.

LYU H C， CHENG X G， WANG H， et al. Research advances on epidemic characteristics and control strategy of duck Newcastle disease . China Poultry，2018，40（2）：40-42.

劉秀梵，胡順林. 我國新城疫病毒的分子流行病學及新疫苗研制. 中國家禽，2010，32（21）：1-4.

王蒙蒙，金" 鑫. 雞新城疫商業化疫苗研究進展. 動物醫學進展，2024，45（5）：103-108.

NISHIZAWA M， PAULILLO A C， NAKAGHI L S O， et al. Newcastle disease in white Pekin ducks：response to experimental vaccination and challenge . Revista Brasileira de Ciência Avícola，2007，9（2）：123-125.

石" 躍. 新城疫病毒對鴨致病性研究. 北京：中國農業科學院，2011.

胡" 焱，嵇辛勤，阮" 涌，等. 不同新城疫疫苗對貴州三穗麻鴨的免疫效果比較. 中國獸藥雜志，2017，51（5）：1-6.

CAI Y X， XU W， GU C J， et al. Griffithsin with a broad-spectrum antiviral activity by binding glycans in viral glycoprotein exhibits strong synergistic effect in combination with a pan-coronavirus fusion inhibitor targeting SARS-CoV-2 spike S2 subunit. Virologica Sinica，2020，35（6）：857-860.

XU H， LI L， DENG B H， et al. Construction of a T7 phage display nanobody library for bio-panning and identification of chicken dendritic cell-specific binding nanobodies. Scientific Reports，2022，12（1）：12122.

張訓海，朱鴻飛，陳溥言，等. 鴨副粘病毒強毒株的分離和鑒定. 中國動物檢疫，2001 ，18（10）：24-26.

李建軍，丁巧玲，袁" 生，等. 鴨副黏病毒的分離與鑒定. 中國家禽，2006，28（24）：135-136，139.

陳少鶯，胡奇林，陳仕龍，等. 鴨副粘病毒的分離與初步鑒定. 中國預防獸醫學報，2004，26（2）：118-120.

ZHANG S P， WANG X T， ZHAO C G， et al. Phylogenetic and pathotypical analysis of two virulent Newcastle disease viruses isolated from domestic ducks in China. PLoS One，2011，6（9）：e25000.

XIANG B， CHEN L B， CAI J C， et al. Insights into genomic epidemiology，evolution，and transmission dynamics of genotype VII of class II Newcastle disease virus in China. Pathogens，2020，9（10）：837.

唐思靜，哈" 卓，趙艷敏，等. LT粘膜佐劑對雞新城疫疫苗的免疫增強作用研究. 中國動物傳染病學報，2013，21（1）：8-11.

徐" 磊，楊" 慧，劉毅發，等. 豬脾轉移因子對La Sota株雞新城疫弱毒疫苗的免疫增強作用. 微生物學報，2022，62（2）：727-741.

ABRAHA R. Review on the role and biology of cytokines in adaptive and innate immune system. Archives of Veterinary and Animal Sciences，2020 （2）：2.

（責任編輯：陳海霞）