甘肅地區(qū)遺傳代謝病疾病譜及致病基因分析

張釧 惠玲 周秉博 鄭雷 王玉佩 郝勝菊 達振強 馬瑩 郭金仙 曹宗富 馬旭

（1.甘肅省婦幼保健院/甘肅省中心醫(yī)院/甘肅省缺省缺陷與罕見病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，甘肅蘭州 730050；2.國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所/國家人類遺傳資源中心，北京 100081）

遺傳代謝病（inherited metabolic disorder,IMD）作為出生缺陷重要組成部分，是由于編碼物質(zhì)代謝所必需的酶或輔酶基因變異引起相應(yīng)功能蛋白活性降低或喪失，導(dǎo)致機體代謝紊亂的一組疾病［1-2］，目前已報道的IMD 有1 450 多種［3］。新生兒IMD 篩查可及時對IMD 患兒進行早期診斷和及時干預(yù)，對改善預(yù)后十分重要［4］，具有重大社會效益［5-6］。

對IMD 患兒進行基因分型意義重大，明確基因分型后可以精準地指導(dǎo)后續(xù)治療、遺傳咨詢及婚育問題。IMD 的疾病譜及患病率存在地域性差異［7］。甘肅地處我國西北地區(qū)，醫(yī)務(wù)人員整體對遺傳病尤其是IMD 的認識非常有限，許多IMD 的患病率沒有數(shù)據(jù)，以及治療規(guī)范沒有建立。臨床上經(jīng)常出現(xiàn)IMD 患兒因不能及時得到診斷造成干預(yù)治療不及時的嚴重后果。截至目前，尚未見甘肅地區(qū)IMD疾病譜及患病率的相關(guān)研究報道。

本研究進行了甘肅地區(qū)IMD 疾病譜及致病基因研究，以期實現(xiàn)對本地區(qū)IMD 患兒的早期診斷和及時干預(yù)，改善預(yù)后，為本地區(qū)建立精準的IMD篩查、診斷、預(yù)防體系提供基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)與策略。

1 資料與方法

1.1 研究對象

回顧性收集2018 年1 月—2021 年12 月甘肅省婦幼保健院286 682 例新生兒IMD 篩查的串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，受檢者按人口基數(shù)比例來自甘肅省的12 個地級市、2 個自治州的23 個縣，占2018—2021 甘肅省出生人口的26.42%（108.5萬）。

本研究獲得家屬知情同意并簽署知情同意書，并通過甘肅省婦幼保健院倫理委員會審查［（2021）GSFY倫審65號］。

1.2 基因組DNA提取

采集患兒及其父母外周靜脈血2～3 mL，EDTA抗凝。應(yīng)用北京天根生化科技有限公司生產(chǎn)的血液基因組DNA 提取試劑盒（貨號：DP348）提取基因組DNA。

1.3 高通量測序分析

采用全外顯子組測序技術(shù)（北京智因東方轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心）進行檢測，目標區(qū)域20×以上，覆蓋度達95%。檢測區(qū)域包括外顯子區(qū)和剪接區(qū)、部分內(nèi)含子區(qū)；可檢測變異類型包括非重復(fù)區(qū)域的單堿基變異、小片段插入/缺失（≤20 bp），以及部分外顯子缺失/重復(fù)和拷貝數(shù)變異。

1.4 數(shù)據(jù)分析

高通量測序結(jié)果與參考基因組（GRCh37/hg19）比對得到所有變異的SNP_INDEL 文件，對檢測到的堿基改變進行篩選，最后依據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會（American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG）指南［8］判讀新變異的致病性。

1.5 Sanger測序驗證

基因外顯子擴增引物由上海生工生物工程股份有限公司完成。PCR 擴增體系為25 μL：2×Taq PCR Mastermix（北京天根生化科技有限公司）12.5 μL，基因組DNA模板1.5 μL（濃度20～50 ng/μL），上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，ddH2O 10 μL。PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，對單一目的條帶的產(chǎn)物采用PCR 產(chǎn)物純化試劑盒（北京天根生化科技有限公司）純化后，由ABI 3500 型（ABI，美國）測序儀進行測序，使用SeqMan 軟件與標準序列對測序結(jié)果進行比對分析。

1.6 IMD診斷

根據(jù)《新生兒疾病串聯(lián)質(zhì)譜篩查技術(shù)專家共識》［9］，基于本實驗室建立的特定疾病的關(guān)鍵生物標志物的檢測值及臨界值，根據(jù)串聯(lián)質(zhì)譜檢測結(jié)果，結(jié)合基因分型及患兒臨床表現(xiàn)綜合確定IMD種類。IMD種類的確定由實驗室數(shù)據(jù)分析人員與臨床醫(yī)生共同決定。

2 結(jié)果

2.1 新生兒IMD分布

286 682 例新生兒經(jīng)基因檢測明確診斷IMD 180 例，包含28 個致病基因?qū)е碌?3 種IMD，總患病率為0.63‰（1/1 593）。苯丙酮尿癥（phenylketonuria,PKU）患病率最高，為0.32‰（1/3 083）；其次是甲基丙二酸血癥（methylmalonic acidemia,MMA）（0.11‰，1/8 959）、四氫生物蝶呤缺乏癥（tetrahydrobiopterin deficiency,BH4D）（0.06‰，1/15 927）、希特林蛋白缺乏癥（0.02‰，1/47 780）。本地區(qū)前11 種IMD（患兒數(shù)≥2）的累計患病率達93.3%。見表1。

表1 甘肅地區(qū)286 682例新生兒IMD疾病譜

2.2 IMD遺傳方式分布

23 種IMD 中，21 種（91%）為常染色體隱性遺傳，肉堿軟脂酰轉(zhuǎn)移酶2缺乏癥為常染色體顯性遺傳，鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶缺乏癥為X連鎖隱性遺傳，見表1。180 例患兒中，177 例（98.3%）致病變異均來自父母；1例致病變異來自母親和自發(fā)變異；2 例為自發(fā)變異（X 連鎖隱性遺傳和常染色體顯性遺傳患兒）。

2.3 新變異及其致病性分析

28 個致病基因中，共發(fā)現(xiàn)166 種變異，其中9個基因的13種變異為ClinVar（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/）和HGMD（https://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php）數(shù)據(jù)庫未報道的新變異。根據(jù)ACMG 指南，5 種新變異為致病變異，7 種為可能致病變異，1種為臨床意義未明。見表2。

表2 甘肅地區(qū)IMD致病基因新變異位點及致病性分析

3 討論

新生兒IMD 篩查目標是預(yù)防或降低IMD 病死率，對社會和兒童個人都是有益的［9-10］。新生兒IMD篩查并不具有診斷性，結(jié)果異常時應(yīng)進行基因診斷，對新生兒進行精準評估，有利于早期干預(yù)治療，可有效降低包括脂肪酸氧化缺陷、尿素循環(huán)障礙等在內(nèi)疾病的患病率和病死率［5，10-13］。

IMD 疾病譜及患病率在全國存在地域性差異。河南地區(qū)IMD 總患病率為0.48‰（1/2 085），其中患病率最高的為MMA，其次為高苯丙氨酸血癥（hyperphenylalaninemia,HPA）、原發(fā)性肉堿缺乏癥（primary carnitine deficiency,PCD）、3-甲基巴豆酰輔酶A 羧化酶缺乏癥（3-methylcrotonyl-coenzyme a carboxylase deficiency,MCCD）、短鏈酰基輔酶A 脫氫酶缺乏癥（short-chain acyl-coenzyme a dehydrogenase deficiency,SCADD）、希特林蛋白缺乏癥、戊二酸血癥Ⅰ型等［14］。浙江地區(qū)新生兒IMD 總患病率為0.22‰（1/4 535），患病率最高的為HPA，其次為PCD、MMA、SCADD、MCCD、希特林蛋白缺乏癥、高甲硫氨酸血癥等［15］。廣州地區(qū)IMD 總患病率為0.41‰（1/2 451），患病率最高的為PCD，其次為MMA、PKU、SCADD、希特林蛋白缺乏癥［16］。陜西地區(qū)IMD 總患病率為0.65‰（1/1 545），患病率最高的為HPA，其次為MMA、希特林蛋白缺乏癥、PCD、中鏈酰基輔酶A脫氫酶缺乏癥［17］。

本地區(qū)IMD 疾病譜及患病率與國內(nèi)以上地區(qū)［14-17］不同。在本研究286 682例新生兒中，經(jīng)基因檢測共診斷IMD 180 例，包含28 個致病基因?qū)е碌?3 種IMD，患病率最高的是PKU，其次是MMA、BH4D、希特林蛋白缺乏癥、MCCD、鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶缺乏癥及楓糖尿病（maple syrup urine disease,MSUD），總患病率為0.63‰（1/1 593），本地區(qū)IMD總患病率低于同為西北地區(qū)的陜西，但要高于國內(nèi)其他地區(qū)。推測這可能是由于西北地區(qū)經(jīng)濟水平欠發(fā)達，人口流動性有限，由于當?shù)厝巳旱慕⒄咝?yīng)所致，需要擴大樣本量進一步研究。

有效的IMD 治療隨訪可降低對患兒的危害，MSUD為氨基酸代謝病的一種，患兒尿液會出現(xiàn)類似楓糖漿的氣味［18］。該病是一種致死、致殘的常染色體隱性遺傳疾病，治療困難，預(yù)后不良。本研究3 例MSUD 患兒中2 例來自同一家系，該家系在第1胎患兒明確診斷后沒有進行產(chǎn)前診斷，導(dǎo)致第2 胎也為MSUD，因此，對患兒家庭進行有效的遺傳咨詢及生育指導(dǎo)十分重要。

攜帶者篩查技術(shù)可以檢出攜帶同一種隱性遺傳病致病基因的高風(fēng)險夫妻，攜帶同一致病基因的高風(fēng)險夫妻可通過產(chǎn)前診斷或胚胎植入前診斷來避免患兒的出生。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，擴展性攜帶者篩查病種已經(jīng)有上百種［19］。但由于遺傳病的疾病譜及患病率存在地域性差異，因此，不同地區(qū)應(yīng)制定不同的篩查疾病種類。本研究結(jié)果顯示，如果在擴展性攜帶者篩查的病種中添加PKU、MMA、BH4D、希特林蛋白缺乏癥、MCCD、鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶缺乏癥、MSUD、極長鏈酰基輔酶A脫氫酶缺乏癥、瓜氨酸血癥1型、黏脂貯積癥、肉堿酰基轉(zhuǎn)移酶缺乏癥這11 種IMD 時，可覆蓋甘肅地區(qū)93.3%的IMD，可有效降低本地區(qū)IMD發(fā)生率。

綜上所述，本研究對甘肅地區(qū)286 682 新生兒的IMD 疾病譜進行分析，發(fā)現(xiàn)28 種IMD。PKU、MMA、BH4D為本地區(qū)患病率最高的IMD。本研究在9個基因中發(fā)現(xiàn)了13個新變異位點，豐富了IMD相關(guān)致病基因變異數(shù)據(jù)庫，為IMD 的分子遺傳學(xué)診斷、干預(yù)治療、生育指導(dǎo)及遺傳咨詢提供了理論依據(jù)與技術(shù)支持。

作者貢獻聲明：張釧負責實驗操作、數(shù)據(jù)分析、論文撰寫與修改、經(jīng)費支持，惠玲、周秉博、鄭雷、王玉佩、郝勝菊、達振強、馬瑩、郭金仙負責實驗操作、數(shù)據(jù)分析、論文撰寫與修改，曹宗富、馬旭負責指導(dǎo)研究、論文修改、經(jīng)費支持。

利益沖突聲明：所有作者聲明無利益沖突。