Wnt蛋白在皮膚鱗狀細(xì)胞癌與基底細(xì)胞癌中的表達(dá)情況研究

袁燕平 張盧舜

九江學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，九江 332000

非黑色素瘤屬于人類最常見的皮膚惡性腫瘤，包括基底細(xì)胞癌（basal cell carcinoma，BCC）和鱗狀細(xì)胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）兩個(gè)類型。SCC 約占所有皮膚惡性腫瘤的29.4%，而BCC 約占28.0%［1］。BCC 和SCC 的病因及發(fā)病機(jī)制目前尚不十分清楚，但已證實(shí)與紫外線照射、電離輻射、人乳頭瘤病毒、化學(xué)致癌物、器官移植和免疫抑制等有關(guān)。BCC 的臨床特點(diǎn)是具有局部侵襲性，但是遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移并不常見。BCC 的組織形態(tài)有相當(dāng)大的變異性，存在許多病理學(xué)亞型，包括結(jié)節(jié)型、表淺型、囊腫型、腺樣型、色素型、硬斑型、異形型、纖維上皮瘤和痣樣基底細(xì)胞上皮瘤型［2］。SCC 是人類第二常見的皮膚惡性腫瘤。SCC 和BCC 在生物學(xué)行為上有所不同，臨床上常常可見SCC 很早就發(fā)生轉(zhuǎn)移。

Wnt 信號(hào)通路通常分為經(jīng)典和非經(jīng)典信號(hào)通路［3-11］。Wnt10a和Wnt10b是經(jīng)典通路的重要成員，它們可以激活經(jīng)典的Wnt/β-catenin/Tcf信號(hào)通路從而發(fā)揮作用，而Wnt5a蛋白主要介導(dǎo)激活非經(jīng)典Wnt 信號(hào)通路。Wnt 信號(hào)通路已被證明是許多惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素［3-6］。在黑色素瘤、乳腺癌、結(jié)直腸癌、原發(fā)性肝癌、甲狀腺癌、白血病等腫瘤組織中均發(fā)現(xiàn)Wnt 信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白β-catenin 的核內(nèi)聚集現(xiàn)象。對(duì)于Wnt信號(hào)通路在黑色素瘤中的作用研究報(bào)道較多，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)β-catenin 在黑色素瘤細(xì)胞胞質(zhì)和胞核內(nèi)顯示較高的表達(dá)狀態(tài)，當(dāng)黑色素瘤細(xì)胞的β-catenin 基因被敲除后，細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖受到抑制，但是轉(zhuǎn)移能力反而增強(qiáng)，這是因?yàn)棣?catenin 介導(dǎo)的細(xì)胞黏附作用被削弱了［7-8］。為了探索Wnt 信號(hào)通路在非黑色素瘤形成中的作用，本試驗(yàn)同時(shí)檢測(cè)了SCC 和BCC 中Wnt5a、Wntb、β-catenin 和Wnt10a 的表達(dá)情況，結(jié)果顯示4 種蛋白在兩種腫瘤中的表達(dá)情況大不相同，部分蛋白顯示出明顯的差異化表達(dá)。

資料與方法

1.標(biāo)本和試劑來源

收集2021 年1 月至12 月在九江學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚科就診并且經(jīng)過病理科確診的33例BCC和33例SCC標(biāo)本，其中男28例，女38例，年齡45～88歲。

本研究經(jīng)九江學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（L2021023），所獲得的樣本均征得患者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

兔抗人Wnt5a（稀釋比1∶200）多克隆抗體和Wnt10a（稀釋比1∶200）多克隆抗體購(gòu)自Bioss 公司，兔抗人Wnt10a（稀釋比1∶200）多克隆抗體購(gòu)自proteintech 公司，二抗、SP法免疫組化試劑盒和DAB顯色劑均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

2.方法

采用SP 法，操作流程如下：所有標(biāo)本均經(jīng)10%福爾馬林固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，以3 μm 厚度連續(xù)切片，微波修復(fù)，3%雙氧水封閉內(nèi)源性過氧化物酶，之后進(jìn)行血清封閉。依次加入一抗、二抗及鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶，DAB 顯色，蘇木精對(duì)比染色，常規(guī)脫水，透明，中性樹膠封固。磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作為陰性對(duì)照。

3.結(jié)果判定

免疫組織化學(xué)染色判讀采用著色強(qiáng)度積分與數(shù)量積分相加的方法。將陽(yáng)性細(xì)胞百分比分成5 級(jí)。無陽(yáng)性細(xì)胞為0 分，陽(yáng)性細(xì)胞≤25%為1 分，25%～≤50%為2 分，50%～≤75%為3 分，＞75%為4 分。著色強(qiáng)度無色為0 分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。著色強(qiáng)度積分與數(shù)量積分相加：1 分為（-），2～3 分為（+），4～5 分為（++），6～7 分為（+++），其中（-）和（+）定為陰性，而（++）和（+++）定為陽(yáng)性。試驗(yàn)結(jié)果由2 位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理診斷醫(yī)生（副主任醫(yī)師）采用雙盲法獨(dú)立閱片并打分。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.Wnt10a、Wnt10b、Wnt5a、β-catenin在BCC中的表達(dá)

在所有BCC 病例中，腫瘤細(xì)胞區(qū)域均可見Wnt10b、Wnt5a 和β-catenin 的強(qiáng)烈表達(dá)（圖1A、B、C）；部分病例中Wnt10b、Wnt5a 也微弱地表達(dá)在間質(zhì)細(xì)胞中（圖1B、C 箭頭所示）；但是，所有病例均未見Wnt10a 的表達(dá)，在無論是腫瘤區(qū)域還是其他區(qū)域均為陰性（圖1D）。

圖1 基底細(xì)胞癌（BCC）樣本中β-catenin、Wnt10b、Wnt5a 和Wnt10a的免疫組織化學(xué)染色表達(dá)情況（免疫組織化學(xué) ×400）。癌組織巢細(xì)胞中可見明顯的β-catenin、Wnt10b、Wnt5a 表達(dá)（A、B、C），而Wnt10a 則為陰性表達(dá)（D）。在腫瘤間質(zhì)細(xì)胞（黑色箭頭）可見Wnt10b、Wnt5a的表達(dá)

2.Wnt10a、Wnt10b、Wnt5a和β-catenin在SCC中的表達(dá)

在所有SCC 病例中，腫瘤細(xì)胞區(qū)域均可見Wnt10b、Wnt5a 和β-catenin 的強(qiáng)烈表達(dá)（圖2A、B、C）；在病例中Wnt10b、Wnt5a 也微弱地表達(dá)在間質(zhì)細(xì)胞中（圖2B、C 箭頭所示）；Wnt10a在所有SCC 病例中呈陰性表達(dá)的有23例，呈現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)有10例，陽(yáng)性表達(dá)率為30.3%（10/33）。

圖2 鱗狀細(xì)胞癌（SCC）樣本中β-catenin、Wnt10b、Wnt5a 和Wnt10a 的免疫組化染色表達(dá)情況（免疫組織化學(xué) ×400）。癌組織細(xì)胞中可見明顯的β-catenin、Wnt10b、Wnt5a 和Wnt10a 表達(dá)（A、B、C、D），表達(dá)部位包括細(xì)胞核和細(xì)胞漿。在腫瘤間質(zhì)細(xì)胞（黑色箭頭）可見Wnt10b、Wnt5a 的表達(dá)，而未見β-catenin 和Wnt10a表達(dá)

3.Wnt10a在BCC和SCC中的表達(dá)

Wnt10a 在BCC 中的陽(yáng)性表達(dá)率為0，而在SCC 中出現(xiàn)4例中等強(qiáng)度表達(dá)，6例強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率為30.3%（10/33）。在SCC 中，Wnt10a 主要表達(dá)在腫瘤細(xì)胞的胞漿，極少表達(dá)在胞核區(qū)，在腫瘤間質(zhì)未見表達(dá)。Wnt10a 在BCC 和SCC 中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=11.785 7，P＜0.05）。見表1、圖3。

圖3 不同鱗狀細(xì)胞癌（SCC）樣本中的Wnt10a 的免疫組織化學(xué)染色表達(dá)情況（A2-C2免疫組織化學(xué) ×400）。絕大部分樣本中未見Wnt10a 表達(dá)（A1、A2），個(gè)別樣本中可見微弱的Wnt10a 表達(dá)于癌巢邊緣腫瘤細(xì)胞內(nèi)（B1、B2），另有少部分樣本中癌組織細(xì)胞中可見明顯的Wnt10a 表達(dá)（C1、C2），主要位于細(xì)胞的胞漿和胞核

表1 Wnt10a在BCC和SCC樣本中的表達(dá)情況比較

討論

Wnt 信號(hào)通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和分化以及胚胎發(fā)育過程中起著重要作用。Wnt 蛋白家族成員的異常表達(dá)可導(dǎo)致Wnt 信號(hào)通路激活，進(jìn)而參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［8，12］。對(duì)于Wnt信號(hào)通路的最新研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)Wnt信號(hào)通路至少有3個(gè)分支。⑴經(jīng)典型Wnt/β-catenin 信號(hào)通路：β-catenin 是一種細(xì)胞質(zhì)蛋白，分子量95 kD，它直接與E-鈣黏蛋白的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域結(jié)合，控制著細(xì)胞的附著、增殖和分化等功能；⑵JNK 信號(hào)通路（planar cell polarity）；⑶Wnt/Ca2+信號(hào)通路［12-13］。

目前，對(duì)Wnt 信號(hào)通路的研究較為深入。Wnt 蛋白是一類分泌糖蛋白，共有19 種，其中屬于經(jīng)典途徑的有Wnt10a、Wnt8A、Wnt3A、Wnt3、Wnt2、Wnt1、Wnt8B、Wnt10b［12］。Wnt 蛋白與卷曲蛋白和LRP5/6 形成復(fù)合物后活化胞內(nèi)DVL，從而導(dǎo)致降解復(fù)合體中GSK-3β 的活性喪失，阻斷β-catenin 的磷酸化進(jìn)程，這導(dǎo)致β-catenin 逃避活性酶的識(shí)別和降解，由此引起細(xì)胞內(nèi)β-catenin 出現(xiàn)堆積，堆積到一定程度后入核結(jié)合核轉(zhuǎn)錄因子，暴露下游靶基因的啟動(dòng)子，至此靶基因被激活并且表達(dá)，致使細(xì)胞異常增殖。筆者在BCC 和SCC 中都發(fā)現(xiàn)了β-catenin 的過表達(dá)和聚集現(xiàn)象，表明經(jīng)典Wnt信號(hào)通路參與了兩種腫瘤的發(fā)生，其與皮膚惡性腫瘤關(guān)系密切，這一點(diǎn)也與之前的文獻(xiàn)報(bào)道相同［8］。

利用轉(zhuǎn)染的方法抑制多種結(jié)直腸癌細(xì)胞系中Wnt10a基因表達(dá)后，細(xì)胞的代謝被明顯抑制，腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)速度也明顯降低［14］。其他研究也發(fā)現(xiàn)，Wnt10a 蛋白在食管癌、胃癌、腎癌、結(jié)直腸癌以及子宮內(nèi)膜樣癌中也發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用［15-17］。本研究發(fā)現(xiàn)，所有BCC 中均未見Wnt10a 表達(dá)，而SCC 病例中則有部分樣本出現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)，這說明Wnt10a 積極參與了SCC 的癌變過程。與正常皮膚中的角質(zhì)形成細(xì)胞相比，皮膚SCC 細(xì)胞中的β-catenin 表達(dá)水平顯著增加［18］，本研究也觀察到相同情況。這表明Wnt10b的高表達(dá)激活了Wnt/β-catenin/Tcf 信號(hào)通路，細(xì)胞內(nèi)β-catenin不斷累積后，不但促進(jìn)癌細(xì)胞的快速增殖，還導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

人們?cè)谘芯啃∈笕橄倌[瘤病毒時(shí)發(fā)現(xiàn)，激活Wnt10b 基因后可導(dǎo)致小鼠產(chǎn)生乳腺腫瘤，由此發(fā)現(xiàn)了Wnt 蛋白家族新成員——Wnt10b。1997 年Bui等［19］首次發(fā)現(xiàn)并描述了與鼠類Wnt10b 同源的人類基因，人類的Wnt10b 基因與鼠類基因在核苷酸和氨基酸水平的一致性分別達(dá)到了88%和95%。Wnt10b在人類乳腺癌、前列腺癌骨轉(zhuǎn)移瘤、原發(fā)性肝癌和結(jié)腸癌中均出現(xiàn)異常高表達(dá)［20］，提示W(wǎng)nt10b基因的過表達(dá)可能和這些腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究觀察到，Wnt10b 在兩種皮膚腫瘤中的表達(dá)都是明顯增多的，而在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)量是高于間質(zhì)細(xì)胞的，說明Wnt10b 積極參與兩種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。

Wnt5a也是Wnt蛋白家族重要成員之一，可以激活經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，使下游β-catenin蛋白表達(dá)增加，進(jìn)而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但在某些情況下它也可以抑制經(jīng)典Wnt 信號(hào)通路［21-23］。研究發(fā)現(xiàn)，Wnt5a 在多種腫瘤中出現(xiàn)異常表達(dá)，如骨肉瘤、肝癌、前列腺癌、肺癌等［7，24-25］，Wnt5a 的mRNA 與腫瘤的轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，而且也與預(yù)后相關(guān)。Wnt5a在人體內(nèi)的表達(dá)和作用具有組織器官特異性。因此，它既可以發(fā)揮促癌作用，又可發(fā)揮抑癌作用。結(jié)合本研究結(jié)果分析，筆者認(rèn)為其對(duì)皮膚非黑色素腫瘤的促進(jìn)作用是占主導(dǎo)地位的。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路在腫瘤中的作用已經(jīng)被眾多研究所證實(shí)［26-29］，但是筆者查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)其在皮膚非黑色素中的作用的研究相對(duì)較少。本研究顯示，多種Wnt 蛋白高表達(dá)于SCC 和BCC 中，同時(shí)發(fā)現(xiàn)Wnt10a 在SCC 組織中的表達(dá)高于BCC 組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明經(jīng)典和非經(jīng)典Wnt 信號(hào)通路都參與了二者的發(fā)生發(fā)展過程，而其中Wnt10a 在兩種腫瘤中發(fā)揮的作用不同，其更多地參與了SCC 的癌變過程。Wnt10a 在BCC 和SCC 中有著不同的作用，其內(nèi)在的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明袁燕平：醞釀和設(shè)計(jì)試驗(yàn)，實(shí)施研究，采集數(shù)據(jù)，分析/解釋數(shù)據(jù)；張盧舜：起草文章，對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱