喉鱗狀細胞癌中HPV與TAP、CD8、HLA表達的相關性及臨床意義

李逸群 易麗君 陳慶勇 李云榮 李紅 安姝憬

1濱州醫學院附屬醫院病理科，濱州 256603；2濱州醫學院附屬醫院醫務處、耳鼻咽喉科，濱州 256603；3濱州醫學院第一臨床醫學院，濱州 256603

頭頸部鱗癌是全球第六大常見癌癥，每年導致超過20 萬人死亡［1］。其中喉鱗狀細胞癌占頭頸部鱗癌的25%～30%，是頭頸部最常見的惡性腫瘤。過去認為吸煙和飲酒是喉鱗狀細胞癌發生的危險因素，但隨著非吸煙和飲酒的喉鱗狀細胞癌患者增加，人們越來越重視其他危險因素的研究，其中包括人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）的感染［2］。抗原加工相關轉運體（transporter associated with antigen processing，TAP）在主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ類抗原途徑中起著至關重要的作用，在腫瘤和病毒感染中，TAP 可將腫瘤性或病毒性抗原提呈給人類白細胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）分子，被CD8+T 淋巴細胞識別后啟動細胞免疫，因此，有研究者認為TAP 可以作為腫瘤免疫治療的靶點［3-4］。本研究通過免疫組化方法檢測P16、TAP1、TAP2、HLA、CD8在喉鱗狀細胞癌中的表達水平，探討P16、TAP1、TAP2、HLA、CD8 與喉鱗狀細胞癌臨床病理特征的關系，以及TAP1、TAP2、HLA、CD8與HPV感染的相關性。

資料與方法

1.一般資料

1.1.臨床資料 收集濱州醫學院附屬醫院2013 年1 月至2018 年12 月行手術切除的84 例喉鱗狀細胞癌患者的組織蠟塊進行臨床研究。所有患者術前均未經過放、化療及生物學治療。其中，男性68 例，女性16 例，年齡45～78 歲，中位年齡63 歲；腫瘤長徑0.6～6.0 cm，中位長徑2.6 cm；組織學類型：角化型43 例，非角化型41 例；有淋巴結轉移者36 例，無淋巴結轉移者48 例；參照美國癌癥聯合會（AJCC）第八版癌癥分期手冊，Ⅰ～Ⅱ期33 例，Ⅲ～Ⅳ期51 例。具有完整隨訪資料的患者73 例，隨訪時間截至2023 年2 月或患者死亡。

本研究通過濱州醫學院附屬醫院醫學倫理委員會審核（KYLL-2022-33）。

1.2.試劑 兔抗人TAP1 多克隆抗體購自abcepta 公司，兔抗人TAP2 多克隆抗體購自Affinity 公司，兔抗人P16、CD8、多克隆抗體和免疫組化試劑盒均購自北京中杉金橋公司，免抗人HLA多克隆抗體購自Proteintech公司。

2.方法

采用免疫組化EnVision 法染色，常規石蠟組織切片經二甲苯脫蠟至水，乙二胺四乙酸修復抗原，3% H2O2孵育，滴加一抗TAP1（1∶100）、TAP2（1∶150）、HLA（1∶100）、CD8（即用型）、P16（即用型），置于4 ℃過夜孵育。磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2 次后滴加二抗，37 ℃孵育30 min，洗滌后二氨基聯苯氨（DAB）顯色，蘇木素復染，分化，脫水透明，中性樹膠封固。

3.結果判定

P16 主要表達于腫瘤細胞核或細胞質，呈棕黃色顆粒，以＞70%的細胞出現核或質的強陽性表達為陽性判讀標準［5］。CD8細胞陽性著色定位于淋巴細胞胞膜，呈棕褐色粗顆粒，先在低倍鏡下觀察整張切片，分別在癌巢及癌旁組織中選取CD8 細胞豐富的5 個高倍視野（×400）計算其陽性細胞數，以癌巢和癌旁組織內CD8 陽性細胞的均數106 作為臨界值，106 以下為CD8 細胞陰性表達，106 以上為CD8 細胞陽性表達［6-7］。HLA 主要表達于腫瘤細胞胞質及胞膜，TAP1、TAP2主要表達于腫瘤細胞質及胞核，呈棕黃色，免疫組化結果綜合染色反應強度和陽性細胞數量兩個方面進行半定量記分法判定：按陽性著色程度評分，0 分為無色，1 分為淺黃色，2 分為棕黃色，3 分為棕褐色。按陽性細胞比例評分，0分：＜5%，1分：5%～10%，2分：＞10%～50%，3分：＞50%～80%，4分：＞80%。將兩項評分結果相乘：≥4 分為陽性，＜4 分為陰性［8-9］。

4.統計學方法

采用SPSS 25.0 軟件進行統計學分析，計數資料用率表示，資料分組間比較采用χ2檢驗或Fisher 精確檢驗，相關性分析采用Spearson 關聯性分析，生存曲線采用Kaplan-Meier 法繪制，采用Cox比例風險回歸模型進行多因素生存分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1.喉鱗狀細胞癌及癌旁正常組織P16、TAP1、TAP2、HLA、CD8的表達

免疫組化結果顯示，P16主要表達于腫瘤細胞核或細胞質，在喉鱗狀細胞癌組織中的陽性率為11.9%，在癌旁正常組織中陰性表達（圖1A、圖1B）；CD8 主要表達于淋巴細胞胞膜，在喉鱗狀細胞癌組織中的陽性率為38.1%，低于癌旁正常組織（56%），見圖1C、圖1D；HLA 主要表達于腫瘤細胞胞質及胞膜，在喉鱗狀細胞癌組織中的陽性率為42.8%，低于癌旁正常組織（57.1%），見圖1E、圖1F；TAP1、TAP2 主要表達于腫瘤細胞胞質及胞核，在喉鱗狀細胞癌組織中的陽性率分別為41.7%、29.8%，均低于癌旁正常組織（69%、56%），見圖1G、圖1H、圖1I、圖1J。其中，TAP2 在癌和癌旁正常組織中的表達，差異有統計學意義（χ2=5.08，P＜0.05）。見表1。

表1 P16、TAP1、TAP2、HLA、CD8在喉鱗狀細胞癌及癌旁正常組織中的表達[例（%）]

2.喉鱗狀細胞癌中TAP1、TAP2、HLA、CD8 和P16 表達與臨床病理特征的關系

喉鱗狀細胞癌組織中浸潤淋巴細胞CD8的表達與臨床分期有關，Ⅲ期-Ⅳ期腫瘤中淋巴細胞CD8陽性表達率高于Ⅰ期～Ⅱ期，差異有統計學意義（P＜0.05），而TAP1、TAP2、HLA、P16的表達與臨床病理因素無關。見表2。

表2 84例喉鱗狀細胞癌患者P16、TAP1、TAP2、HLA、CD8的表達與臨床病理特征的關系（例）

3.喉鱗狀細胞癌中P16 與TAP1、TAP2、HLA、CD8 表達的相關性

根據P16 免疫組化染色結果，將84 例喉鱗狀細胞癌分為P16 陽性組和陰性組，并分析其與TAP1、TAP2、HLA、CD8 表達的相關性。Spearman 相關性分析顯示，CD8 與P16表達呈負相關，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 喉鱗狀細胞癌P16與TAP1、TAP2、HLA、CD8表達的相關性

4.喉鱗狀細胞癌中TAP1、TAP2、HLA、CD8 表達的相關性

Spearman 相關性分析顯示，喉鱗狀細胞癌組織中TAP1 表達與TAP2、CD8 均呈正相關（r=0.295，r=0.232），HLA 的表達與CD8 的表達呈正相關（r=0.232），差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表4、表5、表6。

表4 喉鱗狀細胞癌患者TAP1與TAP2、HLA、CD8表達的相關性

表5 喉鱗狀細胞癌患者TAP2與HLA、CD8表達的相關性

表6 喉鱗狀細胞癌患者HLA與CD8表達的相關性

5.TAP1+/TAP2+與TAP1-/TAP2-組P16、HLA、CD8 表達的相關性

根據免疫組化染色結果，將喉鱗狀細胞癌分為TAP1+/TAP2+與TAP1-/TAP2-組，分析其與P16、HLA、CD8表達的相關性。TAP1+/TAP2+組中CD8 的陽性率高于TAP1-/TAP2-組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表7。

表7 喉鱗狀細胞癌患者TAP1+/TAP2+、TAP1-/TAP2-與P16、HLA、CD8表達的相關性

6.預后

隨訪結果顯示，喉鱗狀細胞癌患者中位生存期為60 個月，平均5 年生存率為68.5%。Kaplan-Meier 生存分析顯示，喉鱗狀細胞癌患者的預后與腫瘤長徑、脈管侵犯、淋巴結轉移有關（P＜0.05），見圖2。Cox 多因素回歸模型分析顯示，脈管侵犯、淋巴結轉移均是喉鱗狀細胞癌預后的獨立危險因素（P＜0.05），見表8。

表8 84例喉鱗狀細胞癌患者預后Cox多因素分析

圖2 84例喉鱗狀細胞癌患者預后生存曲線。A：腫瘤長徑的生存分析；B：脈管侵犯的生存分析；C：淋巴結轉移的生存分析

討論

喉鱗狀細胞癌是上呼吸道常見的癌癥，占所有惡性腫瘤的4.5%，其發生與長期接觸酒精或煙草等化學物質有關［10-11］。近年來，越來越多的研究表明喉鱗狀細胞癌的發生與HPV 感染密切相關［12］。HPV 是一類雙鏈環狀DNA 病毒，具有感染皮膚和黏膜的能力。當機體免疫力低下或免疫功能受損時，HPV 可通過受損的上皮細胞感染進入宿主細胞，其病毒核酸整合進入宿主細胞基因組，引起相應的基因表達異常，促使細胞惡性轉化［13］。HPV 有約179 種基因亞型，根據其致病能力不同，可分為低危型和高危型。研究表明，高危型HPV 與腫瘤發生關系最密切，包括HPV16、18、31、33、35、45、51、52 和56 等，能引起宮頸癌、頭頸癌、肛門癌、陰道癌、外陰癌和陰莖癌等。喉鱗狀細胞癌中最常見的亞型是HPV16，約占HPV陽性喉鱗狀細胞癌的84%［14］。

HPV 約含8 000 個堿基對，分為早期區、晚期區和非編碼區，其中早期區含有6個基因（E1-E7），編碼與病毒復制、轉錄調控、翻譯和細胞轉化等有關的蛋白［15］。機體感染HPV后，HPV病毒的基因組整合到宿主細胞的基因組中，導致E6和E7蛋白的過度表達，從而導致P53的降解和視網膜母細胞瘤蛋白（retinoblastoma protein，Rb）功能的失活［16］。同時，E7 干擾Rb1 的功能導致P16INK4A反饋性上調，引起P16 蛋白的過度表達，因此，檢測P16 蛋白的表達情況可評估高危型HPV感染狀態，目前已廣泛應用于臨床［17］。

Valls-Onta?ón 等［18］研究表明，在口腔及口咽鱗狀細胞癌中，P16 的陽性率為16.8%，在吸煙和飲酒少的年輕男性人群中多發，且P16 陽性患者的6 年生存率較高。Tumban［19］研究表明，在口咽鱗癌中HPV 的陽性率高達為33.6%，而在喉鱗狀細胞癌中HPV 感染率相對較低，為20.2%。本研究采用免疫組化方法檢測P16 在喉鱗狀細胞癌中的表達水平，其在喉鱗狀細胞癌組織中的陽性表達率為11.9%，表明喉鱗狀細胞癌中存在高危型HPV 感染，與相關文獻報道的口咽鱗癌的HPV 感染率相比，喉鱗狀細胞癌中HPV 感染率相對較低［20］。究其原因，可能是口咽部扁桃體的隱窩和不規則表面以及舌根部的淋巴組織為HPV感染的持續存在創造了有利的環境。

TAP 由TAP1 基因、TAP2 基因編碼的2 個亞單位組成，其在HLA 分子抗原提呈過程中起著重要作用，可將內源性抗原從細胞質轉運到內質網腔［21-22］。在內質網中，它與其他成分一起形成多肽負載復合體，負載到新生的HLA 分子上，然后轉運到細胞表面，從而被CD8+T 細胞識別，從而引發免疫反應［23］。由于TAP蛋白在將多肽轉運到內質網中起關鍵作用，因此，TAP 的表達會影響抗原遞呈的功能［24］。Yang 等［25］研究表明，膠質瘤干細胞通過下調TAP 或使TAP蛋白表達缺陷，從而降低T 細胞的認知能力，逃避免疫系統的監視，且TAP 表達下調與膠質瘤干細胞中Wnt 途徑的激活有關。Ling 等［26］研究表明，TAP 的下調是結直腸腫瘤免疫逃逸的機制，也是Ⅰ～Ⅱ期結直腸腫瘤患者預后不良的因素。TAP 表達異常會影響腫瘤細胞HLA 的表達。CD8分子是T 淋巴細胞表面的糖蛋白，結合HLA 提呈的腫瘤抗原后，T 淋巴細胞活化并分化為細胞毒性T 細胞，從而發揮殺傷腫瘤細胞的作用［27］。本研究通過免疫組化方法檢測TAP1、TAP2、HLA、CD8 在喉鱗狀細胞癌中的表達，發現TAP1、TAP2、HLA、CD8 在喉鱗狀細胞癌中均呈低表達，TAP1 的表達與TAP2、CD8 的表達呈正相關，且CD8 的表達與HLA 呈正相關。由此可見，TAP 蛋白的表達下調會抑制機體的免疫應答，進而使腫瘤細胞逃避機體的免疫監視。此外，TAP1+/TAP2+組中CD8 的陽性率高于TAP1-/TAP2-，表明當TAP1、TAP2 均表達陽性時，能激活更多的CD8+T 細胞參與免疫應答的調節。

病毒感染亦可影響TAP 的表達狀態。Steinbach 和Riemer［28］研究發現宮頸癌中TAP1 的表達被抑制，在HPV16陽性的宮頸癌中，HPV16 E7可抑制TAP1的轉錄，并使其啟動子高度甲基化。在口腔鱗狀細胞癌中研究發現HPV介導的免疫逃避主要是通過淋巴毒素途徑的信號轉導網絡介導的，特別是淋巴毒素（LT）α1β2 和LTβR，HPV16 E6 促進LTα1β2 和LTβR 的表達，從而激活LT 信號通路，并抑制TAP 的功能［29］。由于受樣本量少的影響，雖然本研究統計學分析P16 的表達與TAP1、TAP2 無相關性，但是在P16 陽性組中，TAP1、TAP2 均有表達降低趨勢，且Spearman相關性分析結果表明P16 與CD8 的表達呈負相關。因此，在喉鱗狀細胞癌中，HPV感染后抑制癌細胞TAP的表達，降低HLA分子抗原提呈過程，從而抑制CD8+T細胞數量，但本研究中樣本量有限，有關P16 和TAP 表達的相關性及具體的免疫調控機制有待于進一步試驗證實。

影響喉癌患者預后的因素諸多，Cavalieri 等［30］研究表明年齡、TNM 分期是喉鱗狀細胞癌預后的獨立危險因素。Zhu 等［31］研究表明，低分化LSCC 患者的預后明顯低于高分化和中分化LSCC患者，因此，組織病理學的差異是LSCC的一個重要預后因素。相關研究表明，P16的表達是喉鱗狀細胞癌患者長期總生存期和疾病特異性生存期的獨立危險因素，頭頸部鱗癌轉移灶中HLA 和TAP 的下調是預后不良的標志，頭頸部鱗癌腫瘤微環境中CD8+T 細胞的衰竭決定了預后不良［32-34］。本研究結果顯示，腫瘤長徑、脈管侵犯、淋巴結轉移與患者預后相關；Cox 回歸模型分析顯示脈管侵犯、淋巴結轉移是喉鱗狀細胞癌預后的獨立危險因素，而P16、TAP、HLA 和CD8 的表達與喉癌預后的不相關，可能與本研究組樣本量少有關。

綜上所述，喉鱗狀細胞癌中存在HPV感染，但由于受樣本量限制，本研究結果未發現HPV 感染與臨床病理因素及預后之間的相關性。通過檢測TAP、HLA 及CD8的表達，顯示喉鱗狀細胞癌組織中TAP 及HLA 表達下調，從而抑制HLA 抗原提呈功能，降低腫瘤內CD8+T 細胞數量，抑制機體的免疫應答，促使腫瘤細胞逃避免疫監視。雖然本研究結果顯示TAP 的表達與HPV 感染無相關性，可能是本研究中采用的臨床樣本量較少，不足以說明HPV 感染狀態與TAP之間的關系，有待于擴大樣本量后進一步證實。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明李逸群：研究設計與實施、數據采集與分析、撰寫文章、統計分析；易麗君、李云榮、安姝憬：研究實施；陳慶勇：研究設計與指導；李紅：研究設計、對文章的知識性內容作批評性審閱、指導