Fas/FasL傳導(dǎo)通路研究電針對(duì)慢性萎縮性胃炎小鼠的作用機(jī)制

王樹國(guó) 薛曉捷 張春龍

（1.山西省針灸醫(yī)院針灸四科，山西 太原，030006；2.山西中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)，山西 晉中，030024）

慢性萎縮性胃炎（CAG）是一種常見于脾胃系統(tǒng)的疾病，臨床表現(xiàn)主要為胃脘部疼痛。由于CAG在早期時(shí)無顯著特異的臨床癥狀，使得很多患者在確診時(shí)已處于發(fā)病晚期，很多已經(jīng)進(jìn)展到早期胃癌，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。并且CAG的發(fā)病周期較長(zhǎng)，其發(fā)生與發(fā)展并不是一蹴而就的，加強(qiáng)早期治療具有重要價(jià)值[2-3]。CAG是由各種因素綜合所致的疾病，也與幽門螺桿菌感染、遺傳、精神、膽汁反流、環(huán)境、飲食習(xí)慣等密切相關(guān)[4]。CAG在病理上可表現(xiàn)為胃黏膜上皮細(xì)胞和腺體萎縮、黏膜蒼白，常伴有胃幽門腺化生、不典型增生、腸化生等。西醫(yī)對(duì)于CAG的治療多采用對(duì)癥治療，缺乏特異性，雖然可緩解臨床癥狀，但是長(zhǎng)期治療效果不佳[5-6]。隨著中醫(yī)學(xué)的發(fā)展，CAG的中醫(yī)治療方法在不斷改善，其中電針作為一種刺激穩(wěn)定、效果良好的治療方法，被廣泛地應(yīng)用于臨床中[7]。Fas/FasL系統(tǒng)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號(hào)通路是細(xì)胞凋亡的重要途徑之一，在細(xì)胞凋亡的執(zhí)行過程發(fā)揮重要作用[8]。本文探討基于Fas/FasL傳導(dǎo)通路研究電針對(duì)慢性萎縮性胃炎小鼠的作用機(jī)制，揭示電針治療CAG的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

SPF級(jí)正常雄性C57BL/6小鼠64只，鼠齡6～8周，體質(zhì)量20～23 g，由斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)單位為山西賽沐設(shè)備有限公司[許可號(hào)：SCXK（京）2019-0010]。小鼠居住于固定且安靜通風(fēng)的鼠籠內(nèi)，每日上午8點(diǎn)至晚上8點(diǎn)進(jìn)行12 h光照，其余時(shí)間黑暗，自由攝食、飲水，室溫（24±2）℃，濕度（55±15）%。所有動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，消毒及人員進(jìn)出嚴(yán)格遵循SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室要求。實(shí)驗(yàn)期間，動(dòng)物的處理均符合動(dòng)物倫理要求，研究得到了山西省針灸醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍（MNNG）（生產(chǎn)企業(yè)：上海麥克林生化科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：C12400671）；10.0%中性緩沖福爾馬林固定液（生產(chǎn)企業(yè)：南昌雨露實(shí)驗(yàn)器材有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：210610）；SDZ-II型號(hào)電針儀[生產(chǎn)企業(yè)：蘇州醫(yī)療用品廠有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：蘇食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2013第2270611號(hào)]；華佗牌針灸針[規(guī)格：0.25×13 mm，生產(chǎn)批號(hào)：津（食）藥監(jiān)械生產(chǎn)許20100138號(hào)]；Fas、FasL免疫組化試劑（生產(chǎn)企業(yè)：武漢賽維爾生物科技有限公司）。

1.2 動(dòng)物造模方法

將64只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組10只、造模組54只。對(duì)照組小鼠不做處理。造模組小鼠自由飲用濃度配置為100μg/mL的1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍飲用液，給予饑飽交替失常飲食，并每日予以小鼠0.2 mL（10 mL/kg）濃度為40%的乙醇溶液灌服。13周起，隨機(jī)抽取造模組小鼠，剖殺檢測(cè)是否造模成功。16周后CAG小鼠模型制作成功，成功造模的證據(jù)是在造模小鼠病理切片中出現(xiàn)局部腺體減少或紊亂、間質(zhì)纖維血管增生以及黏膜下淋巴濾泡形成。同時(shí)，剖殺對(duì)照組小鼠進(jìn)行比較。

1.3 動(dòng)物分組與處理

將已成模的50只CAG小鼠隨機(jī)分為模型組10只、普通針刺組20只、電針組20只。治療進(jìn)行時(shí)間均選擇上午8:30-11:30，對(duì)照組、模型組不予治療。普通針刺組予以小鼠普通針刺治療，第一次為針刺中脘穴和左側(cè)足三里穴15 min，左側(cè)足三里出針后再針刺右側(cè)足三里穴15 min，第二次先右側(cè)足三里，后左側(cè)足三里，依次交替取穴，隔日進(jìn)行一次針刺治療，共進(jìn)行8周。電針組予小鼠電針治療，第一次用電針儀連接中脘和左側(cè)足三里15 min，左側(cè)足三里出針后針刺右側(cè)足三里穴并連接中脘穴和右側(cè)足三里穴15 min，第二次先連接右側(cè)足三里后左側(cè)足三里，依次交替取穴電針治療，隔日進(jìn)行一次電針治療，共進(jìn)行8周。電針組選用的波形是連續(xù)波，波寬為0.1 ms、電流強(qiáng)度為1 mA，刺激頻率為10 Hz。在穴位定位中，中脘穴位于小鼠的正中線上恥骨上嵴向上9等分處（小鼠的恥骨至胸骨劍突平均劃分為17等分）。足三里穴位于小鼠的膝關(guān)節(jié)下方，腓骨頭下約3 mm處的肌溝中；針刺角度為直刺，進(jìn)針深度約為5 mm。電針組和普通針刺組小鼠接受治療干預(yù)時(shí)，應(yīng)將其以仰臥位固定于自制鼠臺(tái)上。故應(yīng)對(duì)對(duì)照組和模型組小鼠予以相同的束縛方法固定30 min，以排除應(yīng)激反應(yīng)。所有小鼠均治療觀察14 d。

1.4 觀察指標(biāo)

（1）觀察并記錄小鼠的一般行為情況、毛色狀況、活動(dòng)狀況等。同時(shí)記錄所有小鼠治療前、治療14 d后的體質(zhì)量情況。（2）所有小鼠在治療前、治療14 d后抽取空腹尾靜脈血50μL左右，靜置放置30 min后，以2 000轉(zhuǎn)/min離心10 min，取上層血清保存在-80.0℃冰箱，采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)血清白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-1β含量，檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢三鷹公司。（3）所有小鼠在治療14 d后采用脊椎脫臼法處死，解剖摘取全胃，將胃腔沿胃大彎剪開，掏出胃內(nèi)容物并暴露內(nèi)側(cè)面，用生理鹽水沖洗后迅速切取胃組織，將胃黏膜組織分為3份。1份放入10.0%中性緩沖福爾馬林固定液中，存放24 h以上，然后進(jìn)行病理染色分析，胃黏膜組織固定后進(jìn)行沖洗、梯度脫水并進(jìn)行石蠟包埋，常規(guī)切片，進(jìn)行HE染色，二甲苯脫蠟后采用梯度濃度乙醇進(jìn)行脫水并沖洗，蘇木素-伊紅浸染，沖片、干燥。使用顯微鏡采集鏡下胃黏膜組織形態(tài)變化并進(jìn)行評(píng)分，包括炎性反應(yīng)、腺體減少、腸化情況等，分為0～3分，分?jǐn)?shù)越高代表病理狀況越差。（4）取上述胃黏膜組織，采用免疫組化的方法檢測(cè)小鼠Fas蛋白、FasL蛋白表達(dá)水平，以相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行記錄。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用（）表示，兩兩對(duì)比給予LSD檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組小鼠的一般情況

對(duì)照組：小鼠毛色潤(rùn)澤光亮，飲食量正常，抓取小鼠時(shí)掙扎有力，活動(dòng)靈巧。

模型組：大便時(shí)有偏稀，進(jìn)食量明顯減少，小鼠毛色粗糙暗淡，不喜動(dòng)作。

普通針刺組、電針組：小鼠飲食量有所增加，精神狀況好轉(zhuǎn)，毛色開始轉(zhuǎn)變?yōu)楣饬痢?/p>

2.2 四組小鼠治療前后的體質(zhì)量變化比較

治療前普通針刺組、電針組、模型組的體質(zhì)量都顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），治療14 d后普通針刺組、電針組的體質(zhì)量高于模型組（P＜0.05），電針組治療14 d后的體質(zhì)量與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）,見表1。

表1 四組小鼠治療前后的體質(zhì)量變化比較 （ ，g）

表1 四組小鼠治療前后的體質(zhì)量變化比較 （ ，g）

注：與對(duì)照組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05；與普通針刺組比較，③P＜0.05，下同。

組別只數(shù)治療前治療14 d后對(duì)照組1038.48±2.1943.48±2.24模型組10 32.11±1.58① 32.14±2.09①普通針刺組20 32.17±1.17① 38.68±2.73①②電針組20 32.43±0.85① 43.10±1.48②③F 11.184 15.793 P＜0.001＜0.001

2.3 四組小鼠治療前后的血清IL-6、IL-1β含量變化比較

治療前普通針刺組、電針組、模型組的血清IL-6、IL-1β含量都高于對(duì)照組（P＜0.05），治療14 d后普通針刺組、電針組的血清IL-6、IL-1β含量低于模型組（P＜0.05），電針組治療14 d后的血清IL-6、IL-1β含量與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 四組小鼠治療前后的血清IL-6、IL-1β含量變化比較（，pg/mL）

表2 四組小鼠治療前后的血清IL-6、IL-1β含量變化比較（，pg/mL）

注：與對(duì)照組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05；與普通針刺組比較，③P＜0.05，下同。

IL-1β治療前治療14 d后治療前治療14 d后對(duì)照組102.57±0.262.51±0.323.11±0.253.06±0.44模型組1013.82±0.77①15.60±1.14①12.01±0.27①13.78±0.25①普通針刺組2013.46±1.13①8.48±0.57①②12.15±0.28①7.84±0.47①②電針組2013.58±1.26①2.57±0.25②③12.33±1.74①3.26±0.28②③F 45.111 49.245 37.794 41.117 P＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001組別只數(shù)IL-6

2.3 四組小鼠治療14 d后的胃黏膜組織病理形態(tài)評(píng)分比較

治療14 d后普通針刺組、電針組、對(duì)照組的胃黏膜組織病理形態(tài)評(píng)分都低于模型組（P＜0.05），電針組與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 四組小鼠治療14 d后的胃黏膜組織病理形態(tài)評(píng)分比較 （ ，分）

表3 四組小鼠治療14 d后的胃黏膜組織病理形態(tài)評(píng)分比較 （ ，分）

注：與對(duì)照組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05；與普通針刺組比較，③P＜0.05，下同。

組別只數(shù)炎癥腺體減少腸化情況對(duì)照組100.32±0.010.26±0.030.28±0.02模型組10 2.33±0.48① 2.34±0.27① 2.41±0.28①普通針刺組20 1.48±0.36①② 1.33±0.27①② 1.57±0.32①②電針組20 0.35±0.04②③ 0.28±0.02②③ 0.29±0.03②③F 43.595 51.104 54.687 P＜0.001＜0.001＜0.001

2.4 四組小鼠治療14 d后的胃黏膜組織Fas蛋白、FasL蛋白表達(dá)水平比較

治療14 d后普通針刺組、電針組、對(duì)照組的黏膜組織Fas蛋白、FasL蛋白相對(duì)表達(dá)水平低于模型組（P＜0.05），電針組與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表4、圖1、圖2。

圖1 四組小鼠治療14 d后的胃黏膜組織Fas蛋白表達(dá)情況

圖2 四組小鼠治療14 d后的胃黏膜組織FasL蛋白表達(dá)情況（比例尺為×200）

表4 四組小鼠治療14 d后的胃黏膜組織Fas蛋白、FasL蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較 （ ）

表4 四組小鼠治療14 d后的胃黏膜組織Fas蛋白、FasL蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較 （ ）

組別只數(shù)Fas蛋白FasL蛋白對(duì)照組101.03±0.141.06±0.24模型組10 5.40±0.54① 5.79±0.35①普通針刺組20 3.49±0.46①② 4.10±0.57①②電針組20 1.12±0.14②③ 1.23±0.17②③F 38.69641.114 P＜0.001＜0.001

3 討論

正常胃黏膜對(duì)鹽酸及消化性損傷具有顯著抗拒性，胃黏膜的防御因子、攻擊因子失衡可導(dǎo)致胃黏膜受損，從而誘發(fā)胃炎的發(fā)生[9]。西醫(yī)對(duì)CAG的治療主要為藥物治療和手術(shù)治療，雖然短期內(nèi)有較好的治療效果但從長(zhǎng)期來看，療效維持性并不令人滿意[10]。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，中醫(yī)學(xué)對(duì)CAG病機(jī)進(jìn)行了深入的研究，并認(rèn)為CAG是由于脾胃虛弱，運(yùn)化失常，氣機(jī)壅滯，導(dǎo)致邪濁內(nèi)生，進(jìn)一步損害脾胃，屬于中醫(yī)“胃脘痛”范疇。CAG歸屬于胃經(jīng)，而足三里既是胃的下合穴也是足陽(yáng)明胃經(jīng)合穴，故治療CAG可選足三里穴。中脘穴與胃脈相通，亦是胃之募穴、六腑之會(huì)[11]。中脘穴具有調(diào)節(jié)脾胃升降兼化痰濁等作用[12-13]。本研究顯示治療14 d后普通針刺組、電針組的體質(zhì)量高于模型組（P＜0.05），電針組治療14 d后的體質(zhì)量與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；治療14 d后普通針刺組、電針組的血清IL-6、IL-1β含量低于模型組（P＜0.05），電針組治療14 d后的血清IL-6、IL-1β含量與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明電針在CAG小鼠的應(yīng)用能抑制血清IL-6、IL-1β的表達(dá)，還可促進(jìn)恢復(fù)小鼠的體質(zhì)量。從機(jī)制上分析，電針不僅可疏通經(jīng)絡(luò)、暢調(diào)氣機(jī)、扶正祛邪、和血止痛，更可以彌補(bǔ)普通針刺刺激持續(xù)性較差的缺點(diǎn)[14]。相關(guān)研究表明，電針能通過改善炎性反應(yīng)、調(diào)控細(xì)胞增殖凋亡、增加胃黏膜血流量、調(diào)節(jié)代謝物等方式促進(jìn)CAG機(jī)體的胃黏膜修復(fù)，從而有利于機(jī)體恢復(fù)正常的胃部功能[15-16]。

CAG與胃癌有著密不可分的關(guān)系，CAG一旦出現(xiàn)腸化生，其癌變率可在10.0%以上。故而對(duì)于預(yù)防胃癌的發(fā)生，對(duì)CAG及腸化與異型增生進(jìn)行控制及逆轉(zhuǎn)具有重要價(jià)值。根據(jù)臨床表現(xiàn)及體征，CAG以脾胃氣陰虛弱為本，毒郁、瘀血、氣滯為標(biāo)[17]。本研究顯示，治療14 d后普通針刺組、電針組、對(duì)照組的胃黏膜組織病理形態(tài)評(píng)分都低于模型組（P＜0.05），電針組與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明電針在CAG小鼠的應(yīng)用能改善病理狀況。當(dāng)前有研究顯示，電針處理可抑制全身炎性反應(yīng)，降低機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)，有效防止有害物質(zhì)對(duì)胃黏膜的損傷，促進(jìn)黏膜修復(fù)及胃蛋白酶活性恢復(fù)，提高胃黏膜保護(hù)能力[18]。

CAG的發(fā)病是胃黏膜細(xì)胞凋亡和增殖失調(diào)導(dǎo)致的。細(xì)胞調(diào)亡是一種受凋亡相關(guān)蛋白調(diào)節(jié)的細(xì)胞自殺機(jī)制。其中凋亡相關(guān)蛋白包括Fas家族、caspase家族和Bcl-2家族等，Bcl-2屬于抑制凋亡的因子。而Fas作為腫瘤殺傷因子（TNF）的超家族成員，主要分布于糖基化的細(xì)胞表面，作用是促進(jìn)細(xì)胞凋亡。相關(guān)研究表明，F(xiàn)as和FasL因子調(diào)控的細(xì)胞異常凋亡是導(dǎo)致胃黏膜細(xì)胞增殖與凋亡功能失調(diào)的主要原因，其中FasL是Fas的配體，一旦結(jié)合，就會(huì)激活細(xì)胞凋亡的信號(hào)并進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，同時(shí)抑制Bcl-2對(duì)細(xì)胞凋亡的影響[19]。李楠等[20]通過研究表明電針可通過調(diào)節(jié)胃黏膜細(xì)胞中Bcl-2、P53的表達(dá)來抑制其凋亡。本研究結(jié)果顯示，治療14 d后普通針刺組、電針組、對(duì)照組的黏膜組織Fas蛋白、FasL蛋白相對(duì)表達(dá)水平低于模型組（P＜0.05），電針組與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明電針在CAG小鼠的應(yīng)用能抑制Fas/FasL傳導(dǎo)通路的表達(dá)，從而抑制胃黏膜細(xì)胞凋亡，以達(dá)到改善胃黏膜萎縮的目的。不過本研究?jī)H研究了電針對(duì)于Fas/FasL信號(hào)傳導(dǎo)通路的調(diào)控，其他相關(guān)因子及其對(duì)應(yīng)mRNA的表達(dá)仍需要進(jìn)一步的研究探索。

綜上所述，電針在CAG小鼠的應(yīng)用能介導(dǎo)Fas/FasL傳導(dǎo)通路的表達(dá)，抑制血清IL-6、IL-1β的表達(dá)，還可促進(jìn)恢復(fù)小鼠的體質(zhì)量，能改善小鼠的胃黏膜病理狀況。