hsa-circ-002179 靶向miR-143-3p 調控自噬-凋亡平衡在胃癌5-氟尿嘧啶化療耐藥性中的作用研究

陶克龍 張振興 徐關根 陶 鋒

胃癌是全球最常見的五大癌癥之一，也是第三大高致死率癌癥[1]。5-氟尿嘧啶（5-Fu）是嘧啶類抗代謝藥物，臨床常用于治療胃癌。在治療初期，大部分胃癌細胞對5-Fu 敏感，腫瘤體積減小，但由于耐藥性的產生，5-Fu 并不能清除所有腫瘤細胞，嚴重影響胃癌的總體治療效果，并限制了其臨床的有效應用。環狀非編碼RNA（circular RNA，circRNA）是一種主要由一個以上外顯子構成的環形RNA 分子，大量存在于真核細胞，是RNA 領域的最新研究熱點。大量的circRNA 在腫瘤發生及發展中發揮重要調控作用[2]，并且circRNA 已被發現參與胃癌細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等重要過程[3]。此外，已有研究發現circRNA 可以影響胃癌細胞對多種化療藥物的敏感性，例如circCUL2 可以通過miR-142-3P/Rock2 軸調節胃癌的順鉑耐藥性[4]。因此，研究circRNA 對胃癌細胞藥物敏感性的功能和機制，有助于改善化療效果。本實驗從細胞水平探究了hsa-circ-002179 靶向miR-143-3p 調控自噬-凋亡平衡對于胃癌細胞5-Fu 化療耐藥性的調控作用，旨在為胃癌治療提供新的靶點和實驗依據。

1 實驗材料

1.1 細 胞 人類胃癌細胞系（AGS）（批號CL-0022），購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 藥物和試劑 自噬抑制劑氯喹（CQ）（Sigma 公司，美國，批號C6628）、TRIzol（Thermo 公司，美國，批號12183555）、Lipofectamine 2000（Invitrogen 公司，美國，批號11668019）、CCK8 細胞檢測試劑盒（Dojindo，日本，批號CK04）、Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒（碧云天公司，中國，批號C1062S）、胎牛血清（Gibco 公司，美國，批號30067334）、RPMI 1640 培養基（Gibco 公司，美國，批號11875093）、TaqMan MicroRNA 逆轉錄試劑盒（Applied Bio 公司，美國，批號4366596）、Revertaid 逆轉錄試劑盒（Thermo Fisher Scientific，美國，批號K1691）、Magna RIP RNA Binding Protein Immunoprecipitation 試劑盒（Millipore 公司，美國，批號17-700）、實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）試劑盒（Sigma 公司，美國，批號71978-3CN）、PrimeScript RT Reagent 試 劑 盒（TaKaRa Bio 公司，中國，批號RR047A）；LC3 抗體（批號ab192890）、Beclin-1 抗體（批號ab207612）、p62 抗體（批號ab109012）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（批號ab8245）、二抗、AGO2 抗體（批號ab287205）、IgG 抗體（批號ab172730）均購自美國Abcam 公司；陰性對照小干擾RNA（si-NC）、hsacirc-002179 小 干 擾RNA （si-002179）、hsa-circ-002179 過 表 達 質 粒（OE-002179） 均 由 中 國GenePharma 公司合成；5-Fu（批號F6627） 購自MedChemExpress；hsa-circ-002179 野生型熒光素酶質粒（002179-WT）、hsa-circ-002179 突變型熒光素酶質粒（002179-MUT）均由中國RiboBio 公司合成；引物均由中國上海生工生物公司合成；miR-143-3p抑制劑和miR-143-3p 模擬物購自中國GenePharma公司。

1.3 主要儀器 酶標儀（MK-3，賽默飛世爾科技上海有限公司）；流式細胞儀（C6，美國BD）；實時熒光定量PCR 儀（CFX-96TOUCH，美國伯樂）；成像系統（日本尼康）；CO2細胞培養箱（賽默飛Thermo Fisher，USA）；高速離心機（上海安亭）。

2 實驗方法

2.1 細胞處理與分組 AGS 細胞使用含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養基、置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養。在AGS 細胞培養基中添加并逐漸升高5-Fu 的濃度（0～30 μg/mL），連續6 個月，以構建AGS/5-Fu 耐藥細胞模型。

細胞分為對照組、耐藥組、耐藥+si-NC 組、耐藥+si-002179 組、002179-WT 組、0002179-MUT 組、耐藥+OE-002179 組、耐藥+si-002179+miR-143-3p抑制劑組、耐藥+CQ 組、耐藥+CQ+OE-002179 組、耐藥+CQ+OE-002179+miR-143-3p 模擬物組。按照不同的組別，使用Lipofectamine 2000 進行相應的轉染。

2.2 CCK8 檢測細胞活性 將AGS 細胞接種到96孔板，每孔加入10 μL CCK-8 試劑，置于37 ℃培養箱內1 h，使用酶標儀檢測450 nm 處吸光度。

2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡 使用預冷磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗細胞，離心后去除上清液，在沉淀中加入結合緩沖液，對細胞沉淀進行重懸，按照Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒說明書步驟進行檢測。

2.4 Western blot 檢測相關蛋白表達 向細胞中加入RIPA 裂解液，提取總蛋白，通過SDS-PAGE 電泳分離蛋白并轉移到PVDF 膜上，并加入5%脫脂奶粉溶液封閉2 h，分別使用LC3 抗體（1∶1000）、Beclin-1抗體（1∶1000）、p62 抗體（1∶1000）、GAPDH 抗體（1∶1000）稀釋液在4 ℃孵育24 h，TBST 清洗后，加入二抗稀釋液（1∶1000）孵育1 h，TBST 清洗后，滴加ECL，進行顯影。

2.5 qRT-PCR 檢測細胞中hsa-circRNA 002179 和miR-143-3p 的表達 使用TRIzol 提取細胞總RNA，根據相應試劑盒說明書獲得cDNA。反應體系：2 μL cDNA、10 μL Real-Time Master Mix，正反向引物各1 μL，加RNase-Free ddH2O 至20 μL 總體積；反應條件：95 ℃，2 min；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；72 ℃，30 s（40 個循環）。hsa-circ-002179 以GAPDH為內參，miR-143-3p 以U6 為內參，hsa-circ-002179和miR-143-3p 的相對表達量采用2-ΔΔCt法進行計算。引物序列如下：hsa-circ-002179 F：5'-CGACTCTTAGCTTGTCGGGG-3'，R：5'-GCATTGCCAATCTGGACACC-3'；miR-143-3p F：5'-AAGCGCCTTGAGATGAAGCACT-3'，R：5'-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3'；U6 F：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，R：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；GAPDH F：5'-GATCATCAGCAATGCCTCCT-3'，R：5'-TGTGGTCATGAGTCCTTCCA-3'。

2.6 免疫共沉淀（RIP）檢測 根據Magna RIP RNA Binding Protein Immunoprecipitation 試劑盒說明書步驟進行RIP 實驗。將免疫沉淀的RNA 進行逆轉錄，并使用PrimeScriptTMRT 試劑盒進行RT-PCR。利用特異性引物檢測免疫沉淀物中的miR-143-3p、hsa-circ-002179 水平。

2.7 雙熒光素酶報告實驗檢測靶向關系 StarBase預測結果顯示，hsa-circ-002179 與miR-143-3p 存在結合位點。構建含有結合位點的002179-WT、結合位點突變的002179-MUT，分別將miR-NC 和miR-134-4p mimic 共轉染進AGS 細胞，在37 ℃、5%CO2培養箱中培養24 h 后，檢測相對熒光素酶活性。

2.8 統計學方法 應用SPSS 21.0 統計學軟件進行數據分析，數值以均數±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析進行多組間比較，采用獨立樣本t 檢驗進行兩組間比較，P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結 果

3.1 hsa-circ-002179 在AGS/5-Fu 細胞中表達上調0～30 μg/mL 的5-Fu 處理后，耐藥組的IC50升高，并且對5-Fu 的敏感性降低（見表1）。進一步使用20 μg/mL 的5-Fu 處理AGS 和AGS/5-Fu 細胞后，與對照組比較，耐藥組的細胞活性升高 [（172.33±9.53）%比（106.00±6.16）%，P＜0.01]，凋亡率降低（20.5%比43.8%，P＜0.01），自噬水平增強（見圖1）。與對照組比較，hsa-circ-002179 在耐藥組細胞中的表達升高[（4.46±0.34）比（1.05±0.66），P＜0.01]。這說明hsa-circ-002179 在AGS 的5-Fu 化療耐藥性中可能發揮重要作用。

表1 不同濃度5-氟尿嘧啶處理后的各組細胞活性比較（OD，±s）

表1 不同濃度5-氟尿嘧啶處理后的各組細胞活性比較（OD，±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01

濃度0 μg/mL 5 μg/mL 10 μg/mL 15 μg/mL 20 μg/mL 25 μg/mL 30 μg/mL孔數3333333對照組108.33±5.35 87.00±2.94 70.33±4.99 99.67±3.86 55.33±4.50 43.33±2.86 43.33±3.40耐藥組109.00±3.56 99.67±3.30a 99.67±4.92b 94.67±3.68b 88.00±3.74b 84.67±2.86b 83.67±3.30b

3.2 下調hsa-circ-002179 增加了AGS/5-Fu 細胞的藥物敏感性 為了探究hsa-circ-002179 對AGS/5-Fu 細胞藥物敏感性的影響，在AGS/5-Fu 細胞中轉染si-002179，進而敲低hsa-circ-002179 的表達水平[（0.45±0.05）比（1.05±0.10），P＜0.01]。與耐藥+si-NC 組比較，耐藥+si-002179 組的細胞活性降低[（80.00±2.45）%比（102.67±7.13）%，P＜0.05]、凋亡水平升高（3.13%比21.8%，P＜0.05），對5-Fu 的敏感性升高，見圖2。

圖1 AGS/5-氟尿嘧啶細胞中hsa-circ-002179 的表達

圖2 下調hsa-circ-002179 對AGS/5-氟尿嘧啶細胞凋亡率的影響

3.3 hsa-circ-002179 靶向miR-143-3p 為了進一步探究hsa-circ-002179 在AGS/5-Fu 細胞中的作用機制，通過StarBase 數據庫分析發現hsa-circ-002179 能夠靶向吸附miR-143-3p（見圖3）。如表2和表3 所示，hsa-circ-002179 與miR-143-3p 存在結合作用。與對照組比較，耐藥組中miR-143-3p 的表達顯著降低[（0.38±0.05）比（1.04±0.07），P＜0.01]。如表4 顯示，與耐藥+NC 組比較，敲除hsa-circ-002179 后細胞中miR-143-3p 水平升高（P＜0.01），而過表達hsa-circ-002179 后細胞中miR-143-3p 水平降低（P＜0.01）。這說明has-circ-002179 靶向抑制miR-143-3p。

圖3 StarBase 預測hsa-circ-002179 與miR-143-3p 的結合位點

表2 各組細胞中hsa-circ-002179 與miR-143-3p 的結合水平（%，±s）

表2 各組細胞中hsa-circ-002179 與miR-143-3p 的結合水平（%，±s）

注：與同組IgG 比較，aP＜0.01

組別hsa-circ-002179 組miR-143-3p 組孔數33 IgG 1.33±0.47 1.33±0.47 Ago2 20.67±1.70a 39.67±2.05a

3.4 hsa-circ-002179 靶向miR-143-3p 調控AGS/5-Fu 細胞的自噬 為了進一步探究hsa-circ-002179 靶向miR-143-3p 在AGS/5-Fu 細胞中的作用機制，本研究分析了hsa-circ-002179 靶向miR-143-3p 對于AGS/5-Fu 細胞自噬的影響。如表5～6所示，與耐藥組比較，耐藥+si-002179 組的hsa-circ-002179 表達水平降低（P＜0.01），而miR-143-3p 表達升高（P＜0.01）。與耐藥+si-002179 組比較，耐藥+si-002179+miR-143-3p 抑制劑組的hsa-circ-002179 表達無顯著變化，而miR-143-3p 表達水平降低（P＜0.01）。圖4 顯示，與耐藥組比較，耐藥+si-002179 組的LC3Ⅱ和Beclin-1 蛋白表達降低，而p62 表達增加，自噬水平顯著降低，而si-002179 對AGS/5-FU 細胞自噬產生的影響能夠被miR-143-3p抑制劑部分逆轉。這說明hsa-circ-002179 可以通過靶向miR-143-3p 調控AGS/5-Fu 細胞自噬。

表3 各組細胞內雙熒光素酶酶活性比較（%，±s）

表3 各組細胞內雙熒光素酶酶活性比較（%，±s）

注：與同組miR-NC 比較，aP＜0.01

組別002179-WT 組002179-MUT 組孔數33 miR-NC 1.17±0.12 1.10±0.08 miR-143-3p mimic 0.50±0.08a 1.2.0±0.08a

表4 各組細胞中miR-143-3p 相對表達量比較（2-ΔΔCt，±s）

表4 各組細胞中miR-143-3p 相對表達量比較（2-ΔΔCt，±s）

注：與耐藥+NC 組比較，aP＜0.01

組別耐藥+NC 組耐藥+si-002179 組耐藥+oe-002179 組孔數333 miR-143-3p 1.00±0.05 1.57±0.09a 0.57±0.05a

表5 各組細胞中hsa-circ-002179 相對表達量比較（2-ΔΔCt，±s）

表5 各組細胞中hsa-circ-002179 相對表達量比較（2-ΔΔCt，±s）

注：與耐藥組比較，aP＜0.01

組別耐藥組耐藥+si-002179 組耐藥+si-002179+miR-143-3p 抑制劑組孔數333 hsa-circ-002179 0.99±0.03 0.49±0.03a 0.48±0.02

3.5 hsa-circ-002179 靶向miR-143-3p 調控自噬-凋亡平衡影響AGS/5-Fu 細胞的藥物敏感性 接下來，本研究驗證hsa-circ-002179 靶向miR-143-3p通過調控自噬-凋亡平衡對AGS/5-Fu 細胞藥物敏感性產生影響。如表7～8 顯示，與耐藥組比較，CQ 處理對于hsa-circ-002179 和miR-143-3p 的表達水平沒有顯著影響；與耐藥+CQ+OE-002179 組比較，耐藥+CQ+OE-002179+miR-143-3p mimic 組中miR-143-3p 的表達被上調（P＜0.01）。圖5 以及表9 顯示，與耐藥組比較，耐藥+CQ 組自噬被抑制，并且細胞活性降低（P＜0.01），凋亡增加。與耐藥+CQ 組比較，耐藥+CQ+OE-002179 組的自噬增加，并且細胞活性（P＜0.05）和凋亡水平隨之變化。在CQ+OE-002179 處理的耐藥細胞中進一步轉染miR-143-3p mimic，結果發現與耐藥+CQ+OE-002179 組比較，CQ+OE-002179+miR-143-3p mimic 組的自噬和細胞活性降低（P＜0.05）、凋亡升高，5-Fu 藥物敏感性有所恢復。

表6 各組細胞中miR-143-3p 相對表達量比較（2-ΔΔCt，±s）

表6 各組細胞中miR-143-3p 相對表達量比較（2-ΔΔCt，±s）

注：與耐藥組比較，aP＜0.01；與耐藥+si-002179 組比較，bP＜0.01

組別耐藥組耐藥+si-002179 組耐藥+si-002179+miR-143-3p 抑制劑組孔數333 miR-143-3p 1.06±0.09 1.54±0.06a 0.65±0.05b

圖4 Western blot 檢測hsa-circ-002179 靶向miR-143-3p對AGS/5-氟尿嘧啶細胞中自噬相關蛋白表達的影響

表7 各組細胞中hsa-circ-002179 相對表達量比較（2-ΔΔCt，±s）

表7 各組細胞中hsa-circ-002179 相對表達量比較（2-ΔΔCt，±s）

注：CQ 為自噬抑制劑；與耐藥+CQ 組比較，aP＜0.01

組別耐藥組耐藥+CQ 組耐藥+CQ+OE-002179 組耐藥+CQ+OE-002179+miR-143-3p mimic 組孔數3333 hsa-circ-002179 1.03±0.07 1.06±0.06 3.21±0.17a 3.16±0.14

表8 各組細胞中miR-143-3p 相對表達量比較（2-ΔΔCt，±s）

表8 各組細胞中miR-143-3p 相對表達量比較（2-ΔΔCt，±s）

注：CQ 為自噬抑制劑；與耐藥+CQ 組比較，aP＜0.05；與耐藥+CQ+OE-002179 組比較，bP＜0.01

組別耐藥組耐藥+CQ 組耐藥+CQ+OE-002179 組耐藥+CQ+OE-002179+miR-143-3p mimic 組孔數3333 miR-143-3p 1.07±0.10 1.04±0.08 0.82±0.02a 2.19±0.11b

表9 各組細胞活性比較（%，±s）

表9 各組細胞活性比較（%，±s）

注：CQ 為自噬抑制劑；與耐藥組比較，aP＜0.01；與耐藥+CQ 組比較，bP＜0.05；與耐藥+CQ+OE-002179 組比較，cP＜0.05

組別耐藥組耐藥+CQ 組耐藥+CQ+OE-002179 組耐藥+CQ+OE-002179+miR-143-3p mimic 組孔數3333細胞活性102.00±3.56 71.00±2.94a 81.33±3.40b 72.33±2.05c

圖5 hsa-circ-002179 靶向miR-143-3p 調控自噬-凋亡平衡對AGS/5-氟尿嘧啶細胞藥物敏感性的影響

4 討 論

胃癌是全球最常見的高死亡率消化道惡性腫瘤[6-7]。5-Fu 化療是最常用的胃癌臨床治療手段，然而，胃癌細胞對5-Fu 的耐藥性會限制其臨床療效[8]，甚至導致化療失敗。因此，深入研究5-Fu 獲得性耐藥的機制對了解臨床化療耐藥及提供腫瘤治療的新策略十分重要。

大量的circRNA 已被發現作為抑癌基因或促癌基因參與胃癌的發生發展進程。Wang 等[9]研究發現，circ-10029 可以通過miR-29b-3p/ITGA11 軸調控胃癌細胞的增殖和侵襲；Yuan 等[10]發現，上調circ-102231 可以促進胃癌進展，然而在胃癌中，hsa-circ-002179 的作用及其機制研究較少。

自噬有助于維持組織內穩態和新陳代謝，但自噬的改變也會導致細胞正常功能受損[11]。有研究顯示，低氧、饑餓等多種應激刺激時，細胞將啟動自噬機制降解受損細胞器，從而防止觸發凋亡途徑，避免細胞凋亡或壞死[12]。自噬和凋亡在抗腫瘤治療中具有相互影響的關系。凋亡是腫瘤細胞死亡的主要途徑之一。自噬和細胞凋亡在腫瘤中具有協同和拮抗的雙層作用[13]。有研究顯示，腫瘤治療中產生的阿霉素耐藥可以通過調節自噬來逆轉[14]。Hu 等[15]提到，調控自噬有助于改善卵巢癌治療中的順鉑耐藥。王婷[16]研究顯示，抗腫瘤藥物曲古霉素A 可以誘導卵巢癌細胞系SKOV3 產生活性氧使細胞內保護性自噬增加，從而使細胞凋亡率降低，而抑制活性氧的產生可以降低自噬水平，使細胞凋亡率增加。控制腫瘤細胞中自噬和凋亡之間的串擾，是治療癌癥的一個關鍵點[17]。然而目前hsa-circ-002179 對于胃癌細胞中自噬-凋亡平衡的影響尚不清楚。本研究顯示，相比于AGS細胞，AGS/5-Fu 細胞的凋亡率降低、自噬水平升高，并且hsa-circ-002179 也明顯升高。而敲除hsa-circ-002179 后，耐藥細胞對于5-Fu 的敏感性增加，并且細胞凋亡水平升高。這說明AGS 細胞對5-Fu 作用的敏感性很可能與hsa-circ-002179 具有密切關聯。

circRNA-miRNA 作用機制在胃癌細胞的化療藥物耐受中也發揮著重要作用，Huang 等[18]提出，circ-AKT3 通過抑制miR-198 來升高胃癌細胞的順鉑耐藥性。本研究通過starbase 數據庫分析和相關實驗，驗證了hsa-circ-002179 可以通過靶向吸附miR-143-3p。miR-143-3p 是一種重要的腫瘤調控基因[19-21]。并且在胃癌中也發揮調控作用，Wang 等[22]研究發現，miR-143-3p 在幽門螺桿菌陽性胃癌中的表達上調，并通過直接靶向AKT2 抑制腫瘤的生長、遷移和侵襲。Wu 等[23]證明，miR-143-3p 可以通過靶向環氧化酶-2（COX-2）抑制胃癌細胞生長并促進其凋亡。miR-143-3p 還可以作為circRNA 的靶點在胃癌的發生、發展過程中發揮作用，例如，circ-0006089 可以通過調控miR-143-3p/PTBP3/PI3K/AKT 途徑促進胃癌進展[24]。circ-FOXO3 可以通過靶向miR-143-3p 來上調USP44 進而促進胃癌細胞增殖和遷移[25]。然而，目前miR-143-3p 在胃癌細胞的5-Fu 化療耐藥性中的作用和機制尚不清楚。本研究發現，hsacirc-002179 靶向吸附miR-143-3p 對AGS/5-Fu 自噬的上調，會導致AGS/5-Fu 細胞凋亡水平降低，造成自噬-凋亡失衡，進而降低了AGS 細胞的5-Fu 藥物敏感性。

綜上所述，本研究闡述了hsa-circ-002179 靶向miR-143-3p 對AGS 細胞的5-Fu 藥物敏感性的調控機制，hsa-circ-002179 通過靶向miR-143-3p 影響自噬-凋亡平衡以升高AGS 細胞對于5-Fu 的耐藥性。因此，hsa-circ-002179 有可能成為改善胃癌治療中5-Fu 化療耐藥性的新靶點。