加味生肌玉紅膏對肛瘺模型大鼠術后創(chuàng)面的作用及血清炎癥因子水平的影響

梅蘋蘋,郭修田,馮文哲,林 璐

(1.上海中醫(yī)藥大學附屬市中醫(yī)醫(yī)院,上海 200071;2.陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院肛腸科,陜西 咸陽 712000)

肛瘺病名最早記載于《山海經(jīng)·中山經(jīng)》：“食者不癰,可以為瘺”,指出了肛瘺多是由肛門周圍膿腫破潰后引起的后遺疾患[1],肛瘺的發(fā)病率約占正常人群的1.04%～3.6%,且復發(fā)率較高[2]。目前臨床治療肛瘺主要以手術為主,但是由于手術方式為開放式,創(chuàng)口易被糞便污染,通常不進行縫合,易感染,出現(xiàn)滲液、水腫、炎癥反應及疼痛等影響創(chuàng)面愈合,給患者生活造成巨大不便。因此,減輕肛瘺術后創(chuàng)面的炎性反應,促進創(chuàng)面愈合已經(jīng)成為臨床關注的重點。中醫(yī)學認為濕熱下注是肛瘺的根本病機,而濕熱邪氣的致病特點與炎癥密切相關[3]。本研究針對肛瘺術后創(chuàng)面早期濕熱內蘊明顯的病機特點,在煨膿長肉治法的指導下,我們在生肌玉紅膏原方的基礎上,增加并調整了祛濕清熱功效的藥物及劑量,使祛濕清熱作用更加突出,觀察加味生肌玉紅膏對肛瘺模型大鼠創(chuàng)面愈合率及血清中白介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白介素6(Interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)及血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)表達的變化,現(xiàn)總結如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：60只SPF級雄性SD大鼠,周齡為8～10周,體重175～215 g,均由西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心提供[生產許可證號：SCXK(陜)2018-001]。實驗經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學倫理委員會批準,倫理委員會審批號：SUCMDL20210608001。實驗前開始適應性喂養(yǎng)2周,大鼠飼養(yǎng)于陜西中醫(yī)藥大學動物實驗中心。飼養(yǎng)條件：室溫保持在20～25 ℃,環(huán)境濕度40%～60%,普通飼料喂養(yǎng),自由飲水飲食。

1.1.2 藥物制作：加味生肌玉紅膏藥物(蒼術、黃柏、當歸、白蠟各60 g,白芷15 g,輕粉、血竭各12 g,紫草6 g,甘草36 g)的制備方法：先將蒼術、黃柏、當歸、白芷、紫草、甘草六味入油內浸3 d,然后文火熬枯去渣;再入血竭化盡,次入白蠟微火化開,待油溫后,再入研細輕粉攪勻,冷卻后即凝成膏,4 ℃冰箱保存。由陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院制劑中心生產,符合 GMP標準。

1.1.3 主要試劑：二甲苯(國藥集團,批號：10023418);蘇木素-伊紅染液(南昌雨露實驗器材有限公司,批號：171007);醫(yī)用凡士林紗布(山東安捷高科消毒科技有限公司,批號：2021110219);康復新液(四川好醫(yī)生攀西藥業(yè)有限公司,批號：B220223);ELISA檢測試劑盒(Beyotime,批號：E-TSELH0029);中性樹膠(金華力升實驗器材廠,批號：20171118);4%多聚甲醛組織固定液(Biosharp,批號：70071800);NF-κB信號通路抑制劑(PDTC)(西安灝洋生物技術有限公司,批號：P9701-25g);糞便混懸液：取新鮮大鼠糞便20 g,與0.9%氯化鈉溶液1∶1均勻混合,5000 r/min,離心5 min,取上清液備用。

1.1.4 主要儀器：實驗用電泳儀電源(北京六一儀器廠,型號：DYY-7C);垂直電泳槽(北京六一儀器廠,型號：DYCZ-24DN);電轉儀(北京六一儀器廠,型號：DYCZ-40);切片盒(海門市杰銳思實驗器材廠,型號：20016532);石蠟切片機(沈陽恒松科技有限公司,型號：HS-S7220-B);其他儀器均由陜西中醫(yī)藥大學實驗室提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 造模與分組：在付小兵等[4]制作創(chuàng)面模型的基礎上做適當改良：取 60 只體重達標的大鼠,實驗當天禁食,3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔內注射麻醉。標記4 cm×4 cm面積剔除背部毛發(fā),備皮區(qū)域用乙醇棉球消毒,大鼠背部制備一個2.0 cm×2.0 cm的正方形,按印記制備一個破壞皮膚全層并深達筋膜的正方形創(chuàng)面,避開大血管,查無活動性出血后,于創(chuàng)面滴灑0.5 ml糞便混懸液,并用醫(yī)用紗布覆蓋、包扎。3 d后取下紗布并觀察創(chuàng)面可見較多膿性分泌物,表示傷口已發(fā)生急性感染,即為造模成功。共造模成功60只,按隨機數(shù)字表法分成凡士林組10只,康復新液組10只、加味生肌玉紅膏組10只、PDTC+康復新液組10只、PDTC+凡士林組10只、PDTC+加味生肌玉紅膏組10只。

1.2.2 實驗給藥：造模成功后,每日清晨于大鼠創(chuàng)面滴灑糞便混懸液 0.5 ml,1 h后用0.9%氯化鈉溶液棉球清創(chuàng),并用無菌干棉球擦拭分泌物。凡士林組(凡士林0.3 g/只)均勻涂抹傷口,康復新液組(康復新液0.3 ml/只)均勻涂抹創(chuàng)面,加味生肌玉紅膏組(加味生肌玉紅膏0.3 g/只)完全覆蓋創(chuàng)面,PDTC+康復新液組、PDTC+凡士林組和PDTC+加味生肌玉紅膏組需在藥物干預基礎上,給予NF-κB信號通路抑制劑 PDTC 100 mg/kg 腹腔注射,每日1次,連續(xù) 5 d。各組換完藥后用醫(yī)用紗布覆蓋,膠帶綁定。

1.2.3 一般情況：每日觀察大鼠進食、飲水及活動情況,換藥前或更換紗布時觀察創(chuàng)面情況：分泌物,感染,水腫,肉芽生長情況等。

1.2.4 創(chuàng)面愈合率：分別在干預3、7、14 d時記錄相關數(shù)據(jù),創(chuàng)面用保鮮膜覆蓋,用記號筆描繪各組大鼠創(chuàng)面圖形,取保鮮膜緊密貼合于心電圖圖紙上,測量創(chuàng)面大小,記錄創(chuàng)面面積(cm2),計算創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率=(初始創(chuàng)面面積-當前創(chuàng)傷面積)/初始創(chuàng)面面積×100%。

1.2.5 血清VEGF、IL-1β、TNF-α、IL-6表達檢測：各組大鼠在給藥3、7、14 d時麻醉大鼠,大鼠尾靜脈抽取血樣2 ml,將血液溫水浴20 min后,5000 r/min離心15 min,留取血清,按ELISA測試試劑盒說明書進行檢測,用酶標儀在450 nm波長測量VEGF、IL-1β、TNF-α、IL-6的OD值,繪出曲線并計算出直線回歸方程式,將OD值代入并計算出蛋白濃度。

2 結 果

2.1 加味生肌玉紅膏對大鼠一般情況及創(chuàng)面愈合情況的影響 全程無樣本脫落,造模后第1天大鼠進食及活動量均較前明顯減少,各組創(chuàng)面情況均較差,水腫明顯,滲液較多,且表面覆有膿性分泌物;治療后第3天,大鼠飲食與活動量比造模當日稍改善,凡士林組與康復新液組可見高度組織水腫,明顯皮膚結構損傷,局部分泌物較多,加味生肌玉紅膏組、PDTC+康復新液組、PDTC+凡士林組和PDTC+加味生肌玉紅膏組創(chuàng)面炎癥比治療前稍減輕;第7～14天,各組大鼠創(chuàng)面逐漸出現(xiàn)痂皮覆蓋,去除痂皮可見康復新液組、凡士林組及PDTC+凡士林組創(chuàng)面水腫,仍有部分炎癥,創(chuàng)面較前縮小不明顯,而加味生肌玉紅膏組、PDTC+康復新液組、PDTC+加味生肌玉紅膏組創(chuàng)面水腫不明顯,創(chuàng)面較前明顯縮小,爬皮明顯;第21天時,各組已趨于愈合,除凡士林組和康復新液組外其余各組大鼠創(chuàng)面愈合較快,大部分PDTC+加味生肌玉紅膏組及加味生肌玉紅膏組大鼠接近完全愈合。

2.2 加味生肌玉紅膏對大鼠創(chuàng)面愈合率的影響 見表1。給藥第3、7、14天,加味生肌玉紅膏組與PDTC+加味生肌玉紅膏組創(chuàng)面愈合率顯著高于其余各組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。給藥第3天,凡士林組、康復新液組、PDTC+凡士林組及PDTC+康復新液組創(chuàng)面愈合率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。給藥第7、14天,凡士林組的創(chuàng)面愈合率最低(P<0.05),PDTC+加味生肌玉紅膏和加味生肌玉紅膏組創(chuàng)面愈合率高于其余各組(P<0.05)。

表1 各組大鼠不同時間創(chuàng)面愈合率(%)

2.3 ELISA法檢測大鼠不同時間血清VEGF、IL-1β、TNF-α、IL-6的表達量 在給藥后第3天IL-1β表達達到峰值,凡士林組含量最高,康復新液組與凡士林組IL-1β表達含量明顯高于加味生肌玉紅膏組(P<0.05),PDTC+加味生肌玉紅膏組、PDTC+康復新液組含量低于其余各組(P<0.05);給藥第7、14天,PDTC+加味生肌玉紅膏組IL-1β表達含量明顯低于其余各組(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠不同時間IL-1β表達情況(ng/ml)

在給藥第3天TNF-α表達達到峰值,凡士林組含量最高,康復新液組與凡士林組TNF-α表達含量明顯高于加味生肌玉紅膏組(P<0.05),PDTC+加味生肌玉紅膏組、PDTC+康復新液組TNF-α含量低于其余各組(P<0.05);給藥第7天,PDTC+加味生肌玉紅膏組TNF-α表達含量明顯低于其余各組(P<0.05);給藥第14天,TNF-α含量較前明顯降低,PDTC+加味生肌玉紅膏組TNF-α含量最低(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠不同時間TNF-α表達情況(ng/ml)

在給藥第3天IL-6表達達到峰值,凡士林組含量最高,康復新液組與凡士林組TNF-α表達含量明顯高于加味生肌玉紅膏組(P<0.05),PDTC+加味生肌玉紅膏組IL-6含量低于其余各組(P<0.05);給藥第7天,PDTC+加味生肌玉紅膏組IL-6表達含量明顯低于其余各組(P<0.05),加味生肌玉紅膏組IL-6表達含量與康復新液組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),但明顯低于凡士林組(P<0.05);給藥第14天,IL-6含量較前明顯降低,PDTC+加味生肌玉紅膏組IL-6含量最低(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠不同時間IL-6表達情況(ng/ml)

給藥第3天,凡士林組的VEGF含量最低(P<0.05);給藥第7天,各組VEGF含量逐漸升高,PDTC+加味生肌玉紅膏組VEGF含量高于其余各組(P<0.05),加味生肌玉紅膏組VEGF含量明顯高于康復新液組與凡士林組(P<0.05);給藥第14天,VEGF含量較第7天稍低,PDTC+加味生肌玉紅膏組與加味生肌玉紅膏組VEGF表達含量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),但高于其余各組(P<0.05),加味生肌玉紅膏組VEGF表達含量明顯高于凡士林組與康復新液組(P<0.05)。見表5。

表5 各組大鼠不同時間VEGF表達情況(ng/ml)

3 討 論

目前肛瘺最普遍采用的治療方式仍是手術,然而肛周皮膚嬌嫩,肛門處痛覺神經(jīng)豐富,肛瘺手術后的創(chuàng)面因糞便污染及排便過程中的機械性損傷,容易出現(xiàn)疼痛、水腫、出血、愈合緩慢等并發(fā)癥,進而嚴重影響患者的休息、進食、活動,從而影響肛瘺患者術后的恢復[5-7]。因此解決肛瘺術后創(chuàng)面愈合這一難題,已成為臨床醫(yī)生關注的重點。

生肌玉紅膏出自《外科正宗》,作為外治創(chuàng)面的經(jīng)典藥方,具有祛腐生肌,活血止痛的功效,臨床療效得到了廣泛的認可。本研究采用陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院制劑中心制備的加味生肌玉紅膏,藥物組成為：蒼術、白芷、輕粉、黃柏、當歸、甘草、白蠟、紫草、血竭等。其中甘草、黃柏有清熱解毒,消腫止痛的作用;蒼術、白芷有祛病除濕,排膿生肌,活血止痛等功效;當歸能活血化瘀,還具有潤燥滑腸的作用;紫草具有活血、涼血、清熱解毒作用,對熱結便秘具有較好療效,與當歸合用可以改善局部組織血液循環(huán);血竭可化瘀止血,活血止痛;白蠟具有止血生肌的作用,輕粉則具有攻毒殺蟲,祛腐斂瘡的作用。諸藥合用制成加味生肌玉紅膏,可生肌止痛,解毒消腫,對紅腫、潰爛、流膿液的肛瘺術后創(chuàng)面具有較好的治療效果。本研究發(fā)現(xiàn)在治療的各個時間點,加味生肌玉紅膏組與PDTC+加味生肌玉紅膏組創(chuàng)面愈合率顯著高于其余各組,差異有統(tǒng)計學意義,且通過對創(chuàng)面觀察發(fā)現(xiàn),凡士林組主要以瘢痕修復為主,且部分伴有創(chuàng)面水腫,加味生肌玉紅膏組與PDTC+加味生肌玉紅膏組創(chuàng)面較前明顯縮小,爬皮明顯,甚至部分創(chuàng)面已有毛發(fā)覆蓋,修復良好。表明加味生肌玉紅膏可以有效促進創(chuàng)面愈合。

本研究針對肛瘺術后創(chuàng)面早期濕熱內蘊明顯的病機特點,在煨膿長肉治法的指導下,在生肌玉紅膏原方的基礎上,增加并調整了祛濕清熱功效的藥物及劑量,使祛濕清熱作用更加突出。中醫(yī)學認為濕熱下注是肛瘺的根本病機,而濕熱邪氣的致病特點與炎癥密切相關。張旭峰等[8]研究發(fā)現(xiàn)濕熱體質的患者體內炎癥因子水平高于平和體質患者。有學者[9]證實,濕熱下注證患者的腫瘤壞死因子、白細胞介素-4、白細胞介素-10等炎性指標可明顯增高。濕熱流注肛門而致創(chuàng)面難斂,炎性反應又是肛瘺術后恢復緩慢的重要原因。NF-κB作為重要的轉錄因子,在炎癥性應激反應中占有重要的地位。已有研究證實NF-κB可高效誘導多種細胞因子,包括IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白的表達[10-12]。TNF-α、IL-6是最常見的炎性因子,可導致肛瘺術后多種并發(fā)癥的發(fā)生[13-14]。IL-6是一種由多種細胞合成并分泌的炎性因子,在機體免疫調節(jié)中發(fā)揮關鍵作用,是機體關鍵炎癥遞質和調節(jié)因子[15]。IL-1是炎性反應和免疫應答中的重要細胞因子,其中,IL-1β在宿主對抗炎性反應的開始和發(fā)展階段,可啟動炎癥的級聯(lián)反應,激活絲裂原活化蛋白酶通路,對創(chuàng)面愈合造成不良影響[16-17]。TNF-α具有廣泛的功能,它可以促進抗炎呈遞,誘導炎癥細胞活化、聚集,刺激機體局部炎性反應,還可與IL-1β相互作用加重炎性反應[18]。本研究結果顯示,在給藥后第3天IL-1β、TNF-α、IL-6表達達到峰值,凡士林組含量最高。治療各時間點加味生肌玉紅膏組的IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白的表達顯著低于凡士林組與康復新液組。給予NF-κB信號通路抑制劑PDTC 100 mg/kg腹腔注射后,治療第7、14天PDTC+加味生肌玉紅膏組IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白表達含量最低,表明加味生肌玉紅膏可有效抑制肛瘺術后創(chuàng)面的炎性反應。創(chuàng)面增生的關鍵階段,需要傷口內基底部肉芽組織的新血管生成[19],而生長因子參與細胞的生長、增殖、分化和遷移,從而促進肉芽的生長,加速上皮化[20-21]。VEGF作為目前已知最強的促血管內皮生長因子,在受損傷組織中發(fā)揮重要作用[22-23]。有研究證實,VEGF高表達的同時可刺激血管內皮細胞增殖,促進血管生成,加速創(chuàng)面愈合[24-25]。本研究結果顯示,VEGF在治療后第3天,凡士林組表達含量最低,之后各組VEGF含量逐漸升高,治療后第14天,VEGF含量較第7天稍低,而治療各時間點PDTC+加味生肌玉紅膏組與加味生肌玉紅膏組VEGF表達含量顯著高于凡士林組與康復新液組,證實了加味生肌玉紅膏可以促進VEGF蛋白的表達,促進血管形成,從而促進創(chuàng)面愈合。

綜上所述,加味生肌玉紅膏可能通過NF-κB 信號通路來抑制IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白的表達,且證實了其可上調VEGF蛋白的表達,從而促進血管內皮細胞新生,減輕炎性反應,加速創(chuàng)面組織的恢復,從而縮短愈合時間。以上研究表明,加味生肌玉紅膏對于肛瘺術后創(chuàng)面的恢復具有良好作用。然而加味生肌玉紅膏是否可通過其他作用機制促進創(chuàng)面愈合,需在以后的研究中進行更深入的探討。