基于“肝病實脾”理論探討逍遙散對肝纖維化大鼠肝星狀細胞鐵死亡的影響

胡哲君,湯穆浛,張 銳,金 泓,嚴 倫,何鴻志,曾鳳蘭,周志鵬

(廣州市紅十字會醫院,廣東 廣州 510220)

肝纖維化是各種慢性肝病進展中的共同病理結果,肝炎病毒感染、酒精、藥物損傷等是其主要病因,隨著病情的進展,患者最終會因肝硬化或肝細胞癌而導致肝衰竭,甚至危及生命[1-3]。免疫系統異常激活與脂質毒性等是觸發肝臟炎癥及其纖維化變性的主要病理機制[4],其中肝星狀細胞(Hepatic stellate cell,HSC)受免疫炎癥刺激活化,進而轉變為肌成纖維細胞是肝纖維化的關鍵步驟[5],鐵死亡作為一種細胞死亡形式在該過程中扮演著重要角色,通過誘導HSC鐵死亡可有效減少肝組織細胞外基質的過度增生和沉積,最終延緩肝纖維化進展[6-7]。《金匱要略》里張仲景提出“見肝之病,知肝傳脾,當先實脾”的治療肝病思路,對于肝纖維化引發的肝硬化的臨床治療具有重要指導意義,基于“肝病實脾”理論來調控免疫功能、腸道菌群可有效防治肝硬化[8],運用“實脾”之法以“治肝”,可通過改善腸道菌群與脾胃升降失調來減輕非酒精性脂肪性肝病相關癥狀[9]。逍遙散是始載于《太平惠民和劑局方》中的方劑,具有調和肝脾、補肝疏郁、肝脾同治的功效,可通過“肝病實脾法”恢復腸道菌群正常結構,進而對肝纖維化大鼠起到抗纖維化與肝臟保護作用[10],能對肝郁脾虛型肝纖維化發揮治療作用[11],但HSC鐵死亡在逍遙散對肝纖維化治療中的作用目前還不清楚,本文通過構建肝纖維化大鼠模型,基于“肝病實脾”理論探討逍遙散對其HSC鐵死亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：SD健康大鼠自成都藥康生物科技有限公司購買,生產許可證號SCXK(川)2020-0034,雄性,SPF級,體重215～240 g,鼠齡7周左右,分籠飼養在明暗12 h/12 h交替進行照明屏障環境動物房中,每籠飼養大鼠少于5只,大鼠自由進食飲水且飼養房內溫度為23～25 ℃、濕度為55%～65%。

1.1.2 試劑與儀器：四氯化碳(批號TMST-715875,純度99.4%),自國家標準物質銷售平臺購買;逍遙散方劑組分：柴胡(批號404319T)、當歸(批號406242T)、白芍(批號312267T)、白術(批號405219T)、茯苓(批號405218T)、生姜(批號404245T)、薄荷(批號404395T)、炙甘草(批號404243T),各中藥組分均為顆粒劑,均自廣東一方制藥有限公司購買;水飛薊賓葡甲胺片(規格50 mg/片,國藥準字H14023291),自山西仟源醫藥集團股份有限公司購買;percoll細胞分離液,自上海山進生物科技有限公司購買;抗兔和小鼠HRP-DAB免疫組化檢測試劑盒,自杭州斯達特生物科技有限公司購買;糞便基因組DNA快速提取試劑盒,自上海澤葉生物科技有限公司購買;Nextera XT DNA文庫制備試劑盒、Illumina Miseq測序試劑盒,自美國Illumina公司購買;Masson染色試劑盒、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)含量檢測試劑盒、PCR反應試劑盒、鐵含量檢測試劑盒、丙二醛(MDA)含量檢測試劑盒,自北京索萊寶科技有限公司購買;兔源抗大鼠抗-長鏈脂酰輔酶A合成酶4(ACSL4)一抗、兔源抗大鼠抗-α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)一抗、兔源抗大鼠抗-谷胱甘肽過氧化酶4(GPX4)一抗、兔源抗大鼠抗-β-actin一抗、兔源抗大鼠抗-環加氧酶2(PTGS2)一抗、辣根過氧化物酶(HRP)偶聯小鼠抗兔二抗,自美國CST公司購買等。

全自動生化分析儀(型號DT-480),自盛世東唐江蘇生物科技有限公司購買;冷凍切片機(型號ALQ-2000),自湖北安立信醫療實業有限公司購買;雙目生物顯微鏡(型號XSP-2CA),自華熙昕瑞(青島)分析儀器有限公司購買;全自動酶標分析儀(型號HED-SY96A),自山東霍爾德電子科技有限公司購買;垂直電泳系統(型號XCell SureLock Mini-Cell)、轉印系統(型號XCell Ⅱ Blot Module)、電泳儀電源(型號Power Ease Touch),自賽默飛世爾科技(中國)有限公司購買等。

1.2 實驗方法

1.2.1 肝纖維化大鼠模型制備及分組給藥：參考文獻[12]制備肝纖維化大鼠模型：將四氯化碳與玉米油混合制為40%(質量分數)的溶液,于SD大鼠腹腔內注射,劑量為1 ml/kg,2次/周(相隔3 d),持續8周后隨機選3只大鼠,進行肝臟病理檢測發現其肝組織內形成明顯纖維間隔,且以全自動生化分析儀檢測外周血中肝功能指標：天冬氨酸氨基轉移酶(AST)和丙氨酸氨基轉移酶(ALT),發現其水平相比正常大鼠明顯升高,即表明肝纖維化大鼠模型制備成功,隨機分為模型組、逍遙散組、水飛薊賓葡甲胺組,每組12只,另取12只SD大鼠于其腹腔內注射1 ml/kg的玉米油設為對照組。

逍遙散由柴胡、當歸、白芍、白術、茯苓各15 g,生姜、薄荷各6 g,炙甘草9 g組成,根據顆粒劑與生藥劑量換算關系,取相對應質量的各種單味中藥顆粒劑溶于0.9%氯化鈉溶液配制為0.155 g/ml的藥液備用;將水飛薊賓葡甲胺片研碎溶于0.9%氯化鈉溶液中配成5 mg/ml的藥液備用。各組大鼠于造模成功后進行分組處理：逍遙散組大鼠灌胃10 ml/kg逍遙散藥液(逍遙散劑量達到1.55 g/kg)[10],水飛薊賓葡甲胺組大鼠灌胃10 ml/kg水飛薊賓葡甲胺藥液(水飛薊賓葡甲胺劑量達到50 mg/kg)[12],對照組、模型組灌胃10 ml/kg 0.9%氯化鈉溶液,各組大鼠均處理3周(1次/d)。

1.2.2 檢測各組大鼠肝功能指標、肝指數并采集標本：末次給藥結束后24 h使用乙醚麻醉各組大鼠,采集其腹主動脈血1 ml左右進行離心(4 ℃、3000 r/min、20 min),獲取血清并使用全自動生化分析儀檢測其中肝功能指標AST、ALT水平;再次采集各組大鼠腹主動脈血1 ml左右進行離心(4 ℃、3000 r/min、20 min),獲取其中血清儲存在-20 ℃備用。

自每組大鼠中隨機選出6只大鼠稱量其體重,采集其糞便標本保存在液氮中備用;打開腹腔并取出肝臟,稱量其重量后依據公式算出各組大鼠肝指數,公式：肝指數=肝臟重量/體重×100%;然后以0.9%氯化鈉溶液漂洗稱重后的肝臟,做包埋處理后于液氮內快速冷凍,取出肝冷凍組織塊放入冷凍切片機內切成約4 μm厚的薄片備用。

每組剩余的6只大鼠,整體消毒后在無菌操作臺中打開腹腔,結扎其上腔靜脈,以乙二醇四乙酸、膠原酶和鏈霉蛋白酶溶液從門靜脈灌注肝臟,剪下消化后的肝臟于無菌DMEM/F12培養基中剝碎、漂洗,然后置于膠原酶和鏈霉蛋白酶組成的混合酶溶液中繼續消化,過200目篩后獲得細胞懸液,置于15 ml離心管中離心(37 ℃、1000 r/min、15 min),以30%的percoll細胞分離液8 ml和70%的percoll細胞分離液3 ml重懸細胞,接著離心(37 ℃、2500 r/min、20 min),通過細胞密度區分細胞類型,HSC在上層細胞層中富集,將其小心吸出后離心(37 ℃、1000 r/min、10 min),采用含有20%胎牛血清及1%雙抗的DMEM/F12培養基進行原代培養。

1.2.3 以Masson染色檢測各組大鼠肝纖維化：取出上述所得的肝組織冰凍切片在室溫下靜置5 min,然后浸沒在冰丙酮中固定15 min,取出用蒸餾水漂洗后滴加Masson染液進行染色(具體方法如Masson染色試劑盒說明書中所示),用蒸餾水漂洗后采用中性樹脂封片觀察,采用生物顯微鏡采集各組大鼠肝組織圖像,以Image J軟件分析所得圖片,并定量計算各組大鼠肝組織切片中被染成藍色的膠原纖維面積和視野總面積,根據公式算出各組大鼠肝膠原容積分數(CVF),公式：CVF(%)=切片膠原纖維面積/切片視野總面積×100%。

1.2.4 以免疫組織化學染色檢測各組大鼠肝星狀細胞活化：取出上述所得的肝組織冰凍切片以同樣方法固定、漂洗,以3%過氧化氫去除切片內源性過氧化物酶,進行抗原修復后采用5%山羊血清封閉切片,滴加兔源抗大鼠抗-α-SMA一抗溶液覆沒切片,搖動孵育過夜后洗片,滴加相對應二抗溶液覆沒切片,搖動孵育2 h后洗片,采用抗兔和小鼠HRP-DAB免疫組化檢測試劑盒并按其說明書中方法進行染色,封片后觀察,以生物顯微鏡采集各組大鼠肝組織圖像并以Image J軟件進行分析,定量各組大鼠肝組織切片中被染成棕色的α-SMA陽性細胞數和細胞總數,根據公式算出各組大鼠肝組織α-SMA陽性比,公式：α-SMA陽性比(%)=α-SMA陽性細胞數/細胞總數×100%。

1.2.5 通過16SrRNA基因測序檢測各組大鼠腸道菌群改變：取上述采集的各組大鼠糞便標本,采用糞便基因組DNA快速提取試劑盒并按其說明書中方法分別提取其中基因組DNA,進行瓊脂糖凝膠電泳純化,獲得1 ng/μl的DNA采用PCR反應試劑盒并按其說明書中方法對16S V4區進行PCR擴增,引物序列為：Forward-5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3’;Reverse-5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3’,再次進行瓊脂糖凝膠電泳來純化所得PCR產物,將5倍量的每組PCR產物混為一個合并文庫,以Illumina Miseq測序平臺測序后采用Mothur軟件拼接處理,獲取非冗余的有效數據,以Uparse軟件聚類序列為多個操作分類單元,默認97%的一致性,基于R語言對微生物群落組成多樣性進行分析,獲取Alpha多樣性指數ACE,并采用Mothur方法和SILVA132的SSUr RNA數據庫做物種注釋分析來獲取重要腸道菌群(擬桿菌目、梭菌目)豐度。

1.2.6 以試劑盒測定各組大鼠HSC鐵死亡指標：取上述進行原代培養的各組大鼠HSC,分別置于預冷RAPI裂解液內混勻,在冰水浴中進行裂解,2 h后離心(4 ℃、3000 r/min、20 min),獲得各組大鼠HSC樣品液,以BCA法測出其中蛋白總濃度后每組取出0.34 ml采用GSH含量檢測試劑盒、鐵含量檢測試劑盒、MDA含量檢測試劑盒分別測量其中GSH、MDA水平與鐵含量,具體測量方法見各自試劑盒說明書。

1.2.7 以免疫印跡檢測各組大鼠HSC鐵死亡標志蛋白表達：取上述提取的各組大鼠HSC樣品液,放入沸水浴內加熱變性其中蛋白,根據蛋白濃度測定結果每組取出20 μg蛋白樣品,依次進行電泳、濕式轉印,在PVDF膜上獲取各組按分子量大小分離開的蛋白,在5%脫脂牛奶中封閉蛋白非特異抗原,并分別孵育兔源抗大鼠Anti-ACSL4、GPX4、PTGS2、β-actin一抗和HRP偶聯小鼠抗兔二抗,使各組ACSL4、GPX4、PTGS2、β-actin蛋白發生抗原抗體反應后用化學發光試劑使其顯色,攝取其圖像后采用Image J軟件定量各組蛋白灰度值,計算各組ACSL4、GPX4、PTGS2蛋白與內參β-actin蛋白灰度值的比值,即可獲得其相對表達量。

1.3 統計學方法 采用SPSS 26.0統計學軟件進行分析。以均數±標準差進行表示,多組間數據的差異比較進行單因素方差分析,組間兩兩差異進一步比較進行SNK-q檢驗;P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠血清AST、ALT水平比較 見表1。與對照組相比,模型組大鼠血清AST、ALT水平均明顯升高(P<0.05);與模型組相比,逍遙散組、水飛薊賓葡甲胺組大鼠血清AST、ALT水平均降低(P<0.05);與逍遙散組相比,水飛薊賓葡甲胺組大鼠血清AST、ALT水平和肝指數差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠血清AST、ALT水平比較(U/L)

2.2 逍遙散對大鼠肝指數與肝纖維化的影響 與對照組相比,模型組大鼠肝指數與肝CVF明顯升高(P<0.05);與模型組相比,逍遙散組、水飛薊賓葡甲胺組大鼠肝指數與肝CVF均降低(P<0.05);與逍遙散組相比,水飛薊賓葡甲胺組大鼠肝指數與肝CVF均無明顯變化(P>0.05)。見表2(圖1)。

A：對照組;B：模型組;C：逍遙散組;D：水飛薊賓葡甲胺組

表2 各組大鼠肝指數與肝CVF比較(%)

2.3 各組大鼠肝星狀細胞活化比較 見圖2。對照組、模型組、逍遙散組、水飛薊賓葡甲胺組大鼠肝組織α-SMA陽性比分別為(5.31±1.63)%、(54.93±3.75)%、(8.52±2.43)%、(7.16±2.10)%。與對照組相比,模型組大鼠肝組織α-SMA陽性比明顯升高(P<0.05);與模型組相比,逍遙散組、水飛薊賓葡甲胺組大鼠肝組織α-SMA陽性比均降低(P<0.05);與逍遙散組相比,水飛薊賓葡甲胺組大鼠肝組織α-SMA陽性比差異無統計學意義(P>0.05)。

A：對照組;B：模型組;C：逍遙散組;D：水飛薊賓葡甲胺組

2.4 各組大鼠ACE指數、梭菌目豐度、擬桿菌目豐度比較 見表3。與對照組相比,模型組大鼠ACE指數、梭菌目豐度均明顯升高(P<0.05),擬桿菌目豐度明顯降低(P<0.05);與模型組相比,逍遙散組、水飛薊賓葡甲胺組大鼠ACE指數、梭菌目豐度均降低(P<0.05),擬桿菌目豐度均升高(P<0.05);與逍遙散組相比,水飛薊賓葡甲胺組大鼠ACE指數、梭菌目豐度、擬桿菌目豐度差異無統計學意義(P>0.05)。

表3 各組大鼠ACE指數、梭菌目豐度、擬桿菌目豐度比較

2.5 各組大鼠HSC鐵死亡指標鐵含量、GSH及MDA水平比較 見表4。與對照組相比,模型組大鼠HSC鐵死亡指標鐵含量、MDA水平均明顯降低(P<0.05),GSH水平明顯升高(P<0.05);與模型組相比,逍遙散組、水飛薊賓葡甲胺組大鼠HSC鐵死亡指標鐵含量、MDA水平均升高(P<0.05),GSH水平均降低(P<0.05);與逍遙散組相比,水飛薊賓葡甲胺組大鼠HSC鐵死亡指標鐵含量、GSH及MDA水平差異無統計學意義(P>0.05)。

表4 各組大鼠HSC鐵死亡指標鐵含量、GSH及MDA水平比較

2.6 各組大鼠HSC鐵死亡標志蛋白表達比較 見表5(圖3)。與對照組相比,模型組大鼠HSC鐵死亡標志蛋白ACSL4、PTGS2表達明顯降低(P<0.05),GPX4蛋白表達明顯升高(P<0.05);與模型組相比,逍遙散組、水飛薊賓葡甲胺組大鼠HSC鐵死亡標志蛋白ACSL4、PTGS2表達均升高(P<0.05),GPX4蛋白表達均降低(P<0.05);與逍遙散組相比,水飛薊賓葡甲胺組大鼠HSC鐵死亡標志蛋白ACSL4、PTGS2、GPX4表達差異無統計學意義(P>0.05)。

圖3 免疫印跡檢測各組大鼠HSC鐵死亡標志蛋白表達

表5 各組大鼠HSC鐵死亡標志蛋白相對表達比較

3 討 論

因代謝紊亂、病毒感染或藥物刺激等引發的慢性肝病是世界范圍內主要的公共衛生問題,肝纖維化作為慢性肝病的共同病理結果,一直是臨床研究熱點,現有治療手段均以延緩纖維化進展為主,對于肝纖維化的進展難以逆轉,因此還需探索更有效的抗肝纖維化方法[13-15]。本文采用腹腔注射四氯化碳的方法建立肝纖維化大鼠模型,結果顯示,造模大鼠肝組織內形成明顯纖維間隔,血清AST與ALT水平、肝指數、肝CVF相比對照組大鼠明顯升高,表明四氯化碳可引發大鼠肝組織纖維化變性并損害其肝功能,提示肝纖維化大鼠模型構建成功。

中醫臟腑學說認為肝脾在病理生理上聯系密切,“見肝之病,知肝傳脾,當先實脾”就是張仲景基于“肝病實脾”理論提出的肝病治療原則,是中醫“治未病”思想的具體體現,現代醫學研究證實腸-肝軸參與脂肪肝的發病機制,腸道菌群失衡作為脾虛的微觀表現,是基于“肝病實脾”理論進行肝脾同病治療的病理基礎,促進腸道菌群穩態恢復可有效延緩脂肪肝的發展[16],并可減輕肝臟炎癥與保護非酒精性脂肪性肝病大鼠腸黏膜屏障功能[17];遵從“肝病實脾”理論還可在肝硬化的治療中發揮重要作用[18]。逍遙散由柴胡、當歸、白芍、白術等組成,柴胡作為君藥,可疏肝解郁、條達肝氣。當歸、白芍同為臣藥,能柔肝養血。白術、甘草、茯苓共起健脾益氣、生化營血之效,薄荷疏郁散熱,生姜溫胃和中,共為佐藥。眾藥合用既補肝解郁又兼顧氣血,肝脾同治,作為調和肝脾之名方可通過恢復腸道菌群正常結構來減少內毒素,進而改善大鼠肝纖維化[10,19],還能通過抑制氧化應激、炎癥級聯反應和凋亡信號激活而顯著減輕四氯化碳誘導的急性肝損傷[20]。本文結果顯示,以逍遙散處理肝纖維化大鼠,可升高其擬桿菌目豐度,降低其血清AST與ALT水平、肝指數、肝CVF、肝組織α-SMA陽性比、ACE指數、梭菌目豐度,表明逍遙散可降低腸道菌群豐富度,恢復腸道菌群正常結構,抑制四氯化碳誘導的大鼠HSC活化及肝纖維化,改善其肝功能,進一步證實了逍遙散可基于“肝病實脾”理論治療肝纖維化。

HSC的活化是肝纖維化發生發展的細胞學基礎,抑制其活性并促進活性HSC死亡是防治肝纖維化的有效策略[21-22],鐵死亡作為一種新型的程序性細胞死亡方式,在包括肝纖維化在內的多種生理病理過程中起到重要調節作用,通過誘導HSC鐵死亡可有效抑制HSC活化,進而減輕肝纖維化[23-25]。本文結果顯示,肝纖維化大鼠HSC鐵含量、MDA水平、ACSL4與PTGS2蛋白表達相比對照組大鼠明顯降低,GSH水平與GPX4蛋白表達明顯升高,表明四氯化碳可導致大鼠HSC鐵死亡水平降低;以逍遙散處理肝纖維化大鼠可升高其HSC鐵含量、MDA水平、ACSL4與PTGS2蛋白表達,并降低其GSH水平與GPX4蛋白表達,表明逍遙散可增強四氯化碳誘導的大鼠HSC鐵死亡,揭示促進HSC鐵死亡可能是逍遙散治療肝纖維化的藥理機制之一。

綜上所述,逍遙散可降低腸道菌群豐富度并恢復其正常結構,促進HSC鐵死亡,進而減輕四氯化碳誘導的大鼠HSC活化及肝纖維化,改善大鼠肝功能,增強HSC鐵死亡可能是其藥理機制之一。