槲芪方加減對肝癌化療栓塞術后大鼠一氧化氮合酶、血管內皮生長因子、乏氧及免疫功能的影響

孔慶旭,陳桂云,陳自力,李 俊

(1.鐘祥市中醫院,湖北 鐘祥 431900;2.安徽醫科大學附屬醫院,安徽 合肥230032)

肝癌在臨床上較為常見,主要是由肝細胞等發生癌變引發的惡性腫瘤,其發病率及病死率均較高[1]。在我國肝癌主要由乙型肝炎誘發,早期多以肝移植的方法進行治療,中晚期多采用肝動脈化療栓塞術 (Hepatic artery chemoembolization,TACE)治療[2]。TACE創傷小,但臨床發現單純進行TACE治療未能完全消滅腫瘤細胞,有近95%的腫瘤胞膜外可見到殘存的腫瘤細胞,殘留病灶通過得到新的供血、供氧繼續生長或轉移[3]。有學者認為這一現象與腫瘤乏氧微環境有關[4]。多種因子參與血管新生與乏氧過程,其中一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)、血管內皮生長因子(Vascular epidermal growth factor,VEGF)具有促進腫瘤細胞供氧、供血的作用,加快腫瘤生長[5-6]。另外有研究發現[7]TACE術后還會導致機體免疫功能降低。在腫瘤產生及發展的過程當中,免疫系統通過多種途徑發揮著腫瘤細胞殺傷作用,其中T淋巴細胞在免疫系統中發揮重要作用。調節性T細胞是機體內對免疫反應具有調節作用的細胞,維持機體免疫平衡,其一方面幫助機體對抗疾病,另一方面抑制腫瘤細胞生長。在TACE術后免疫功能降低,會使機體對抗疾病的能力降低并增加腫瘤細胞生長。因此,尋找改善局部乏氧狀態、免疫功能,抗血管新生以及促進細胞凋亡的藥物對于TACE術后治療至關重要。中醫認為肝癌屬于“肝積”“臌脹”范疇,以本虛標實為病機,因虛致病,因邪致實,具體表現為肝郁脾腎氣血虛、痰濕疫毒殘未盡[8]。槲芪方是由錢英教授總結出的治療肝癌的中藥方,具有滋補肝腎、和血調肝、益氣健脾、祛風利濕和解毒通絡的作用,與上述肝癌病機相契合。目前已有研究證實槲芪方對于治療肝癌動脈化療栓塞術后患者效果顯著,但具體作用機制尚未完全掌握,基于此,本實驗研究槲芪方加減對肝癌化療栓塞術后大鼠iNOS、VEGF、乏氧及免疫功能的影響,為相關研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞：肝癌細胞株HepG2購自上海研生實業有限公司。SPF級SD雄性大鼠,購自蘇州市顧秀實驗動物設備公司,許可證號SCXK(蘇)-2021-0203,本次實驗已通過我院動物倫理委員會批準,批號20210204。

1.1.2 藥物：槲芪方由槲寄生、黃芪、白花蛇舌草各30 g,丹參20 g,莪術6 g等藥物組成。槲芪方藥材均購自亳州市六順堂藥業有限公司,由我院中醫室煎制。

1.1.3 試劑與儀器：全自動生化分析儀(深圳瑞沃德生命科技有限公司,型號Pinnacle),流式細胞儀(貝克曼庫爾特商貿有限公司,型號CytoFLEX ),蘇木素-伊紅染色液(上海古朵生物科技有限公司,貨號GD-K4042),TUNEL試劑盒、HIF-1α、VEGF(北京百奧萊博科技有限公司,貨號GS0248、YT788-TUV、YT848-SNU),iNOS一抗(上海冠導生物工程有限公司,貨號GD-A079581),辣根過氧化物酶二抗(上海研卉生物科技有限公司,貨號127-035-099)。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型建立、分組及干預：于50只大鼠中隨機抽取12只作為健康組進行對照,37只大鼠建立肝癌模型。取1只小鼠,將瘤株注入小鼠腹部,7～10 d腹水形成后,傳代備用。取1只大鼠,麻醉后將0.5 ml(約5×106個腫瘤細胞)的傳代腹水注入大鼠體內,10 d后長出1.5 cm的腫瘤結節,后麻醉大鼠去除結節,剪成約1 mm3的小塊備用。將需建模的大鼠備皮,于腹部正中切開,暴露肝左葉,切開部分肝組織等并擴張肝內切口,止血后將一小塊腫瘤結節置入,止血后將肝臟送回原位并關腹,縫合。術后,將大鼠安置于安靜、舒適的飼養籠里。建模過程中意外死亡1只大鼠,剩余36只大鼠建模成功,隨機分為模型組、肝動脈化療栓塞術組以及聯合組,每組12只。肝動脈化療栓塞術組大鼠給予肝動脈栓塞治療[9]：將自制的微導管插入肝動脈內,注入5-Fu 20 mg/kg,加超液態碘油0.5 ml/kg,術后拔管,縫合,消毒,分籠飼養。聯合組：根據人與動物用藥量換算公式,在肝動脈化療栓塞術組基礎上給予模型大鼠27 ml/kg槲芪方灌胃,2次/d,共24周[10]。健康組與模型組大鼠給予同體積 0.9%氯化鈉溶液灌胃。

1.2.2 全自動生化分析儀檢測各組大鼠肝功能指標水平：末次治療后,取各組大鼠頸動脈血5 ml,3000 r/min(半徑10 cm)離心15 min,取上清。全自動生化分析儀檢測血清丙氨酸轉氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸轉氨酶 (Aspartate transaminase,AST)、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)水平。

1.2.3 流式細胞儀檢測各組大鼠免疫功能指標水平：干預結束后取各組大鼠頸動脈血5 ml,提200 μl外周血單核細胞置于RPMI 1640培養基中培養,加入刺激劑佛波醇乙酯、離子霉素、莫能霉素等工作液混勻,常規培養6 h,PBS清洗,離心5 min,800 r/min,離心半徑10 cm,收集細胞,加入5 μl異硫氰酸熒光素標記CD3+、CD4+、CD8+并檢測其水平,具體步驟按照試劑盒說明書進行。

1.2.4 HE染色觀察各組大鼠肝組織病理變化：取各組大鼠肝組織,甲醛固定,脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋、常規切片,蘇木素伊紅(HE)染色,進行常規組織學檢查。

1.2.5 原位末端標記法(TUNEL)檢測各組大鼠肝癌細胞凋亡：取各組大鼠肝組織石蠟切片脫蠟,加入蛋白酶工作液,常溫孵育15 min,磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌后加入TUNEL液,常溫無光孵育1 h,PBS清洗,加50 μl convertr-POD,無光孵育0.5 h。PBS清洗,3,3-二氨基苯聯胺液顯色,PBS沖洗,蘇木素復染,脫水透明,封片。熒光顯微鏡下觀察并計數發熒光的陽性細胞。凋亡率=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.2.6 免疫印跡檢測各組大鼠VEGF、iNOS、缺氧誘導因子1α(HIF-1α)蛋白表達：肝組織采用0.125%胰蛋白裂解液,勻漿,4000 r/min離心后,進行電泳,轉至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,PBS沖洗,5 min/次,加入VEGF、iNOS、HIF-1α(1∶500)一抗及 GAPDH抗體(1∶1000 )、過氧化物酶標記二抗(1∶2000),雜交處理4 h后,沖洗,將膜浸入電化學發光(ECL)工作液,檢測獲取圖像。

2 結 果

2.1 各組大鼠肝功能水平比較 見表1。與健康組比較,模型組、肝動脈化療栓塞術組與聯合組ALT、AST、ALP水平均升高(P<0.05),與模型組比較,肝動脈化療栓塞術組與聯合組ALT、AST、ALP水平均降低(P<0.05),肝動脈化療栓塞術組ALT、AST、ALP水平均高于聯合組(P<0.05)。

表1 各組大鼠肝功能水平比較(U/L)

2.2 各組大鼠免疫功能水平比較 見表2。與健康組比較,模型組、肝動脈化療栓塞術組與聯合組CD3+、CD4+、CD4+/CD8+均降低,CD8+升高(P<0.05),模型組與聯合組比較差異無統計學意義(P>0.05),與模型組及聯合組比較,肝動脈化療栓塞術組CD3+、CD4+、CD4+/CD8+均降低,CD8+升高(P<0.05)。

表2 各組大鼠免疫功能水平比較

2.3 各組大鼠肝組織病理變化比較 健康組大鼠肝組織結構正常;模型組大鼠肝細胞排列雜亂無章,細胞腫脹,胞質呈空泡狀;肝動脈化療栓塞術組大鼠肝細胞排列不規則,有少量空泡;聯合組大鼠肝細胞排列緊密,僅見少量腫脹(圖1)。

A：健康組;B：模型組;C：肝動脈化療栓塞術組;D：聯合組

2.4 各組大鼠肝癌細胞凋亡比較 見圖2。健康組、模型組、肝動脈化療栓塞術組與聯合組大鼠肝癌細胞凋亡率分別為(1.25±0.14)%、(3.17±0.36)%、(14.35±1.48)%、(19.62±2.05)%。健康組細胞凋亡率低于模型組、肝動脈化療栓塞術組與聯合組(P<0.01),模型組細胞凋亡率低于肝動脈化療栓塞術組與聯合組(P<0.01),肝動脈化療栓塞術組細胞凋亡率低于聯合組(P<0.01)。

A：健康組;B：模型組;C：肝動脈化療栓塞術組;D：聯合組

2.5 各組大鼠VEGF、iNOS、HIF-1α蛋白表達比較 見表3(圖3)。與健康組比較,模型組、肝動脈化療栓塞術組與聯合組VEGF、iNOS、HIF-1α表達均升高(P<0.05),與模型組比較,肝動脈化療栓塞術組VEGF、iNOS、HIF-1α表達均升高(P<0.05),與模型組及肝動脈化療栓塞術組比較,聯合組VEGF、iNOS、HIF-1α表達均降低(P<0.05)。

圖3 各組大鼠HIF-1α、iNOS、VEGF蛋白表達電泳圖

表3 各組大鼠VEGF、iNOS、HIF-1α蛋白表達比較

3 討 論

肝癌是世界范圍內常見的惡性腫瘤之一,早期無明顯癥狀但疾病進展較快,術后復發較高,嚴重威脅患者生命安全[11]。而TACE術是一種常見的肝癌治療方法,雖然可提高臨床療效,但該治療方法仍存在局限性,如易導致肝組織損傷、免疫功能下降等。槲芪方作為一種傳統中藥方劑被廣泛應用于肝癌治療,并取得了一定的療效。因此,本研究通過對比肝動脈化療栓塞術組和聯合組的指標水平,旨在探究槲芪方加減對肝癌化療栓塞術后大鼠的影響,為肝癌治療提供新的思路。

腫瘤缺氧環境中,會使得HIF-1α水平增加,促進iNOS含量增加并產生一定的一氧化氮,增加VEGF表達,促進腫瘤血管生成[12-14]。VEGF是促血管新生的重要因子,與其受體結合后通過磷酸肌醇等途徑調控iNOS表達,誘導一氧化氮產生,促進腫瘤細胞增殖,誘導血管新生,形成惡性循環[15]。研究提示[16],TACE術后,腫瘤并未完全壞死,癌中心及癌周仍有大量存活的癌細胞,這些癌細胞存在于不同程度的乏氧環境中。已有研究表明[17],HIF-1α能夠誘導VEGF、iNOS促進血管新生,加快腫瘤的增殖及轉移。中醫認為肝癌的病機為本虛標實,治療肝癌應重視氣血、臟腑間的關系,并主張將“補肝體” 和 “益肝用”運用于肝癌治療中。槲芪方具有補氣養血、溫陽健脾、滋補肝腎、祛風通絡等功效,符合上述病機。該方中以黃芪、槲寄生、丹參為君藥,益氣固表、滋補肝腎;白花蛇舌草、莪術為臣藥,清熱解毒、活血化瘀。研究提示,槲芪方可有效提高肝癌患者臨床療效[18]。本研究與上述結果相似,也證實了槲芪方可改善肝癌大鼠的肝功能,另外TUNEL結果也顯示槲芪方加減可促進腫瘤細胞凋亡。此外,現代醫學也表明黃芪、莪術[19]、白花蛇舌草[20]均可通過調控HIF-1α、VEGF治療腫瘤。本研究結果顯示術后HIF-1α、VEGF、iNOS水平升高,認為可能是由于TACE刺激,HIF-1α、iNOS被激活,產生腫瘤致癌基因,誘發癌變,使得VEGF增加,加重癌變。槲芪方治療后HIF-1α、VEGF、iNOS水平降低,提示TACE增加了腫瘤局部微環境的乏氧,而槲芪方則顯著降低HIF-1α、iNOS的表達,提示槲芪方對于術后腫瘤乏氧微環境具有改善作用;VEGF水平也顯著降低,提示槲芪方通過改善術后乏氧環境,抑制腫瘤血管新生,間接起到抑制侵襲的作用。

TACE的臨床應用發現其會導致患者的免疫功能降低并損壞肝臟組織,嚴重者會促進病情發展。文獻報道[21],肝癌術后患者的免疫功能與遠期轉移風險密切相關。T淋巴細胞在免疫系統中發揮著重要作用。其中CD3+、CD4+、CD8+是T淋巴細胞的重要成員,參與機體的免疫調節。CD4+具有抗腫瘤的作用,CD8+是機體發揮免疫抑制的關鍵,CD4+/CD8+可反映患者機體免疫抑制程度[22]。行TACE術治療后機體氣血耗損狀態進一步加重,槲芪方以滋補肝腎、益氣健脾、和血調肝等為主要治療原則,符合氣血耗損的治療。槲芪是桑寄生科槲寄生屬植物,性平味苦,歸肝、腎經,功可祛風濕、補肝腎、強筋骨、養血[23]。槲芪方不僅具有輔助抗腫瘤及免疫調節作用,而且還具有直接抗腫瘤和抑制腫瘤轉移作用。槲寄生提取物多糖及總堿可抑制肝癌細胞的增殖,促進其凋亡。生黃芪健脾益氣,丹參和血養肝,郁金解郁化痰,白花蛇舌草祛疫解毒,莪術化瘀消癥,水紅花子化瘀通絡,苦參利濕解毒,全方調補肝脾腎氣血為主,利濕解毒活血通絡消癥為輔?，F代研究提示,槲芪方中黃芪、莪術、槲寄生、丹參等中藥材均具有提高免疫功能的作用[24-25]。在本實驗中經過TACE治療后免疫功能降低,經過槲芪方治療后免疫功能顯著增加,提示槲芪方具有提高TACE術后患者免疫功能的作用,這與上述研究結果相似。

綜上所述,槲芪方加減可提高肝癌TACE術后大鼠的免疫功能,通過抑制肝癌大鼠乏氧微環境中HIF-1α、iNOS及VEGF水平,改善乏氧微環境,促進腫瘤細胞凋亡。