基于出芽短梗霉發(fā)酵法制備β-聚蘋果酸

譚 昕 ,康建平,2* ,李佳逸 ,何雨靜,2 ,王燕來 ,何 勇

(1.四川省紡織科學(xué)研究院有限公司,成都 610083;2.高技術(shù)有機(jī)纖維四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都 610083)

β-聚蘋果酸(Polyβ-malic acid,β-PMLA)是一種重要的高分子聚合物,以蘋果酸為唯一單體且具有完全生物可降解性,因主鏈上含有酯鍵而被稱為聚酯類化合物,由Shimada等人于1969年首次發(fā)現(xiàn)[1-2]。傳統(tǒng)的聚蘋果酸生產(chǎn)工藝主要依賴化學(xué)合成法,然而這種方法存在著原料有限、環(huán)境污染和工藝復(fù)雜等問題[3-4]。為此,發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸成為了一種可行的替代方案[5-7]。

對出芽短梗霉的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基組分進(jìn)行調(diào)整,可實(shí)現(xiàn)β-PMLA 的發(fā)酵過程優(yōu)化。對出芽短梗霉發(fā)酵生產(chǎn)β-PMLA 的工藝進(jìn)行深入研究和優(yōu)化。通過通過改變出芽短梗霉Aureobasidium pullulans的發(fā)酵、碳源、氮源、p H 值及氨基酸種類,期望優(yōu)化β-聚蘋果酸發(fā)酵生產(chǎn)的工藝條件,實(shí)現(xiàn)β-聚蘋果酸產(chǎn)量的最大化和工藝的最優(yōu)化。研究結(jié)果有助于推動出芽短梗霉發(fā)酵生產(chǎn)β-聚蘋果酸工藝的進(jìn)一步發(fā)展,并為β-聚蘋果酸的工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌 種

出芽短梗霉Aureobasidium pullulans40331,Aureobasidiumpullulans2696,由中國工業(yè)微生物菌種保藏中心提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

(1)斜面培養(yǎng)基:PDA 培養(yǎng)基[8]。

(2)種子培養(yǎng)基/(g·L-1):蔗糖60.0,酵母膏3.0,丁二酸2.0,硫酸銨1.0,K2CO30.4,KH2PO40.1,MgSO4·7 H2O 0.1,ZnSO4·7 H2O 0.005,玉米漿0.1%,CaCO320.0(單獨(dú)滅菌)。

(3)發(fā)酵培養(yǎng)基/(g·L-1):蔗糖100.0,蛋白胨35.0,KH2PO40.1,NaNO32.0,MgSO4·7H2O 0.3,KCl 0.5,MgSO40.05,CaCO320.0(單獨(dú)滅菌)[9]。

1.1.3 主要設(shè)備

LC-2023C高效液相色譜儀(上海納锘實(shí)業(yè)有限公司)、BKQ-B75Ⅱ立式高壓蒸汽滅菌器(博科控股集團(tuán)有限公司)、BHC-1300A2生物安全柜(上海丙林電子科技有限公司)、SN-SPX-150B 生化培養(yǎng)箱(上海尚儀儀器設(shè)備有限公司)、ZWY-2102C搖床(上海智城分析儀器制造有限公司)、XJ620M 分析天平(上海天美天平儀器有限公司)、PHSJ-6L 型酸度計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)、TGL-16M 離心機(jī)(湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 斜面培養(yǎng)

將4 ℃斜面保存的出芽短梗霉菌株轉(zhuǎn)接到新鮮的PDA 斜面上于25 ℃培養(yǎng)4～5 d。

1.2.2 種子培養(yǎng)

將種子培養(yǎng)基分裝在500 m L 錐形瓶中,每瓶90 m L培養(yǎng)基,在121 ℃下滅菌20 min。于無菌條件下,用10 m L無菌生理鹽水洗下培養(yǎng)基表面的孢子,制成孢子懸液,按照10%(V/V)的接種量,取10 m L 接種到裝有90 m L種子培養(yǎng)基的500 m L 錐形瓶中,置于恒溫25 ℃、轉(zhuǎn)速250 r/min的搖床上培養(yǎng)48 h。

1.2.3 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

將制備好的種子液混合均勻,在無菌環(huán)境下按10%(V/V)的接種量,取10 m L接種到裝有90 m L發(fā)酵培養(yǎng)基的500 m L 錐形瓶中,置于恒溫25℃、轉(zhuǎn)速250 r/min的搖床上培養(yǎng)時間6 d。

1.2.4 發(fā)酵工藝條件優(yōu)化

考察發(fā)酵p H 值、碳源、氮源、氨基酸等因素對β-PMLA 產(chǎn)量及分子量的影響,得出出芽短梗霉發(fā)酵產(chǎn)β-PMLA 的優(yōu)化工藝條件。

1.3 分析方法

1.3.1 β-PMLA的測定方法[10]

取10 m L 發(fā)酵液,經(jīng)轉(zhuǎn)速12 000 r/min 離 心10 min除去菌體,取5 m L上清液加入等體積1 mol/L的H2SO4溶液,調(diào)節(jié)溫度90 ℃,水解12 h,將聚蘋果酸完全水解為單體蘋果酸。高效液相色譜法(HPLC)檢測水解前后蘋果酸的含量,兩者之差即為聚蘋果酸的產(chǎn)量。

式中:C聚為聚蘋果酸的質(zhì)量濃度,g/L;C后為蘋果酸水解后的質(zhì)量濃度,g/L;C前為蘋果酸水解前的質(zhì)量濃度,g/L。

1.3.2 β-PMLA分子量的測定方法

采用凝膠滲透色譜法進(jìn)行分子量的測定。GPC檢測β-PMLA 分子量的條件:色譜柱為凝膠色譜柱(8.0 mm×300 mm);柱溫25 ℃;參比池溫度30 ℃;流動相為5 mmol/L Na2SO4溶液;進(jìn)樣量20μL;p H自然;流速0.5 m L/min。

1.3.3 pH值的測定方法

采用p H 計(jì)進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 出芽短梗霉合成β-PMLA的產(chǎn)量及分子量

圖1為蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線,將不同濃度的蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行測定,以蘋果酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),色譜峰面積為縱坐標(biāo)做線性回歸,得到L-蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)樣品線性方程y=428x+287.78(R2=0.998 8)。

圖1 L-蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖2 和圖3 可知,通過液相色譜法檢測得到Aureobasidium pullulans2696 和Aureobasidium pullulans40331兩株菌株所產(chǎn)蘋果酸的出峰時間及峰面積,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算,得到濃度分別為13.46 g/L和9.51 g/L。

圖2 Aureobasidium pullulans 2696所產(chǎn)蘋果酸水解前后液相色譜圖

圖3 Aureobasidium pullulans 40331所產(chǎn)蘋果酸水解前后液相色譜圖

采用凝膠滲透色譜法測試發(fā)酵上清液,得到Aureobasidiumpullulans2696和Aureobasidiumpullulans40331所產(chǎn)β-PMLA 的分子量分別為6 532 Da和7 457 Da。

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化對β-PMLA產(chǎn)量及分子量的影響

根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果,Aureobasidium pullulans2696所產(chǎn)β-PMLA產(chǎn)量為13.46 g/L,分子量為7 457 Da,均優(yōu)于Aureobasidiumpullulans40331。選取Aureobasidiumpullulans2696作為優(yōu)化發(fā)酵條件的試驗(yàn)菌株。

2.2.1 碳源對β-PMLA發(fā)酵結(jié)果的影響

選取蔗糖、葡萄糖和木糖分別作為碳源進(jìn)行發(fā)酵,濃度100 g/L,培養(yǎng)時間6 d。測定β-PMLA 的產(chǎn)量和分子量,結(jié)果如圖4、5 所示。碳源的添加均對β-PMLA 的產(chǎn)量和分子量有促進(jìn)作用。其中葡萄糖發(fā)酵生產(chǎn)β-PMLA 的產(chǎn)量和分子量分別為16.84 g/L、7 920 Da,發(fā)酵效果最好,較空白組產(chǎn)量提高了25.11%,分子量提高了6.21%;蔗糖的促進(jìn)效果次之,木糖的更低。這一結(jié)果與文獻(xiàn)[11-12]報(bào)道一致。

圖4 不同碳源對β-PMLA 產(chǎn)量的影響

圖5 不同碳源對β-PMLA 分子量的影響

2.2.2 氮源對β-PMLA發(fā)酵結(jié)果的影響

分別選取硝酸鈉、尿素、硫酸銨和丁二酸銨作為氮源進(jìn)行發(fā)酵,濃度2 g/L,培養(yǎng)時間6 d。測定β-PMLA的產(chǎn)量和分子量,結(jié)果如圖6、7所示。丁二酸銨作為氮源時,β-PMLA產(chǎn)量為15.89 g/L,分子量為7 680 Da,其他3種次之,且添加硫酸鈉時發(fā)酵所產(chǎn)β-PMLA 的分子量相較于空白組更低。

圖6 不同氮源對β-PMLA 產(chǎn)量的影響

圖7 不同氮源對β-PMLA 分子量的影響

2.2.3 pH值對β-PMLA發(fā)酵結(jié)果的影響

參考已有文獻(xiàn)[13],出芽短梗霉產(chǎn)聚蘋果酸的最適p H 值偏酸。通過設(shè)置發(fā)酵液的初始p H 值為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0,探究其對發(fā)酵效果的影響,結(jié)果如圖8所示。p H 值在4.0時β-PMLA 產(chǎn)量最高,達(dá)到15.31 g/L。p H 值為4.0～4.5之間分子量變化不大,并在此后逐漸降低。故選取4.0作為出芽短梗霉產(chǎn)β-PMLA 的 最適p H 值。

圖8 p H 對β-PMLA 產(chǎn) 量及分子量的影響

2.2.4 氨基酸對β-PMLA發(fā)酵結(jié)果的影響

通過預(yù)試驗(yàn)選取了亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、蘇氨酸及丙氨酸5種對出芽短梗霉發(fā)酵有促進(jìn)作用的氨基酸,按照搖瓶發(fā)酵法進(jìn)行培養(yǎng),結(jié)果如圖9、10所示。分別添加5種氨基酸的培養(yǎng)基所產(chǎn)β-PMLA 的產(chǎn)量及分子量均有一定程度提升,其中添加亮氨酸和天冬氨酸效果最佳。添加亮氨酸較優(yōu)化前產(chǎn)量提升了28.75%,分子量較優(yōu)化前提升了15.4%,添加天冬氨酸較優(yōu)化前產(chǎn)量提升了20.43%,分子量較優(yōu)化前提升了15.94%。

圖9 不同氨基酸對β-PMLA 產(chǎn)量的影響

圖10 不同氨基酸對β-PMLA 分子量的影響

3 結(jié)束語

優(yōu)化了出芽短梗霉Aureobasidium pullulans發(fā)酵產(chǎn)β-PMLA 的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基組分,通過調(diào)控發(fā)酵初始p H、碳源、氮源及氨基酸種類,得到最佳培養(yǎng)條件和培養(yǎng)組分為:100 g/L葡萄糖,35 g/L蛋白胨,2 g/L丁二酸銨,0.1 g/L KH2PO4,0.3 g/L MgSO4·7H2O,0.5 g/L KCl,0.05 g/L MgSO4,0.5 g/L 亮氨酸,20 g/L CaCO3,p H 為4.0,發(fā)酵溫度25℃,培養(yǎng)時間6 d。在該條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),PMLA 的產(chǎn)量較優(yōu)化前提高了80.53%,最終為24.3 g/L,分子量提高了20.0%,最終為8 948 Da。