原生二十二碳六烯酸純牛奶對小鼠學習記憶功能的輔助改善作用

任吳疆，郭月逸，趙建，郭豫，霍清，劉彥霞*

(1. 北京聯合大學生物化學工程學院, 北京 100023; 2. 北京聯合大學生物活性物質與功能食品北京市重點實驗室,北京 100191)

0 引 言

二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）俗稱“腦黃金”，是一種存在于大腦、神經組織和視網膜中的ω-3 多不飽和脂肪酸，對思維和記憶的形成起著重要作用[10-12]。DHA 在大腦中的含量較低，通過飲食補充已成為獲取DHA 最有效的途徑。臨床研究表明，在新生兒配方中添加DHA 能夠提高認知能力[13-16]。動物實驗同樣證實補充DHA 有助于提高學習記憶等相關機能[17-19]。目前常見的天然食品DHA 補充劑以深海魚油為主，但由于其腥味較大，且對深海魚類的過度捕撈可能會影響生態環境的可持續發展，因此尋找深海魚油的替代品成為近些年的研究方向[20]。通過人工方法增加食品中DHA 的含量成為新的研究方向，乳制品作為嬰幼兒的主要攝入食品，富含DHA 有助于腦部發育、提高學習記憶能力，直接將富含DHA 的產品加入牛奶中會因DHA 的氧化使營養價值低于預期，而將富含DHA 的藻粉經牛的消化系統轉化至牛乳中，得到含有天然DHA 的生牛乳，經過加工后得到原生DHA 純牛奶的方法合理優化了DHA 氧化帶來的風味影響，與普通牛奶相比，不僅讓消費者更容易接受，而且大大提高了營養價值。本研究觀察該原生DHA 純牛奶產品對小鼠學習記憶的影響，以期為DHA 產品的開發提供新的思路和理論依據，從而更好地促進人體健康發育。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品和動物

樣品處理：將原生DHA 純牛奶（市售）經7 500 r/min離心處理后得到乳黃色油狀稀奶油（比重：0.97；DHA含量：0.417 g/100 g），冷藏保存。受試物配置方法：低劑量組：抽取稀奶油樣品0.17 mL 后再添加無菌水至1.00 mL；中劑量組：抽取稀奶油樣品0.33 mL 后再添加無菌水至1.00 mL；高劑量組：使用樣品原液直接灌胃，為了保證受試物均勻不出現分層現象配制均在注射器中進行，供實驗使用。

實驗動物：288 只SPF 級KM 種雄性小鼠18～22 g飼養于北京聯合大學應用文理學院保健食品功能檢測中心SPF 級動物房，飼養室溫度為（20±2）℃、相對濕度為45%～60%，經過適應性飼養觀察后，實驗動物隨機分為3 組，分別進行跳臺實驗、避暗實驗和水迷宮實驗。動物和飼料均由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，實驗動物使用許可證號：SYXK（京）2017-0038，實驗動物質量合格證：No.110322220100118363、No.110322221100886426。

1.1.2 試劑

東莨菪堿（批號：D2017146，純度98%），阿拉丁科技（中國）有限公司。

1.1.3 儀器

Centrifuge 5810R 臺式離心機，德國eppendorf 公司；T1000 電子天平，常熟市雙杰測試儀器廠；BS2202S 電子天平，德國賽多利斯公司；DM1-001 電子秒表，上海精密儀器儀表有限公司；YLB-3TB 跳臺記錄儀，北京眾實迪創科技發展有限責任公司；LE870 系列避暗箱，西班牙PanLab 公司；水迷宮，北京聯合大學生物活性物質與功能食品北京市重點實驗室自制。

《人力資源社會保障部 食品藥品監管總局關于表彰全國食品藥品監督管理系統先進集體和先進工作者的決定》影印件

1.2 方法

1.2.1 動物分組及給藥

每組動物根據實驗需要隨機設置為2 個動物模型，每個模型1 個對照組和3 個劑量組，低、中、高3個劑量組分別為人體推薦劑量的5 倍、10 倍、30 倍，依據《保健食品檢驗與評價技術規范》（2003 版）高劑量相當于人體劑量為80 mg DHA/（人·天）；詳細分組情況如表1 所示。

表1 實驗動物分組設計表mg/kg 體質量

灌胃體積為10 mL/kg 體質量，對照組灌胃相同體積的無菌水，共計30 d，灌胃結束后測定各項指標。模型對照組和模型各劑量組在訓練前10 min 腹腔注射東莨菪堿5 mg/kg 體質量，注射體積為10 mL/kg體質量。本研究動物實驗設計和實施方案通過了北京聯合大學倫理委員會審核和批準。

1.2.2 跳臺實驗

參考文獻[21]的方法，末次給樣后第2 d 開始訓練。訓練過后，記錄跳下平臺的潛伏期和5 min 內跳下平臺的次數。24 h 后再次測試，對小鼠第1 次跳下去的潛伏期、3 min 內受到電擊的次數和動物數進行記錄。訓練間隔7 d 后，重新再測試1 次，為記憶消退實驗。

1.2.3 避暗實驗

參考文獻[21]的方法，末次給樣后第2 d 開始訓練。將小鼠背朝洞口放入明室，對小鼠從明室到暗室遭受電擊所需的時間和5 min 內被電擊的次數記錄下來。間隔24 h 后再次測試，記錄進入暗室的潛伏期和5 min 內遭受電擊的次數。訓練間隔7 d 后，重新再測試1 次，為記憶消退實驗。

1.2.4 水迷宮實驗

參考文獻[21]的方法，末次給樣后第2 d 開始訓練，在訓練期間每天給樣1 次。訓練時間2 min，在訓練時間內沒有到終點的記為2 min。如圖1 所示，每次訓練時，將2 min 內沒有到終點的小鼠引導到終點。末次測試時，對每組動物5 次訓練和測試的總錯誤次數、到達終點總時間和2 min 內到達終點的動物數進行記錄。訓練間隔7 d 后，重新再測試1 次，為記憶消退實驗。

圖1 水迷宮構造示意圖

1.3 數據處理

采用軟件SPSS 26 進行統計學分析，以平均值±標準差（±SD）表示，用單因素方差分析，計數資料采用x2檢驗，P＜0.05 表示有統計學差異。

2 結果與討論

2.1 原生DHA 純牛奶對小鼠體重的影響

由圖2、圖3 可知，小鼠實驗前的初始體重和灌胃受試物30 d 后的體重，不同批次的各劑量組與相應的對照組相比均無統計學差異（P＞0.05），說明初始體重較為均衡，原生DHA 純牛奶對小鼠體重沒有影響。

圖2 各批實驗小鼠的初始體重

圖3 實驗結束后各批小鼠的體重

2.2 原生DHA 純牛奶對小鼠跳臺實驗的影響

在跳臺實驗中，小鼠被絕緣平臺限制了活動范圍，導致跳下平臺遭到電擊，所以在該實驗中的潛伏期和錯誤次數能夠反映出受試物對小鼠學習記憶的改善作用[22]。由表2 可知，與模型對照組相比，模型中劑量組測試期、消退期的潛伏期顯著延長（P＜0.05），模型高劑量組測試期潛伏期顯著延長（P＜0.05）。由圖4可知，與模型對照組相比，模型低劑量組測試期錯誤次數顯著減少（P＜0.05），模型中、高劑量組測試期錯誤次數極顯著減少（P＜0.01），模型中劑量組重測期、消退期錯誤次數均顯著減少（P＜0.05）。由圖5 可知，與陰性對照組相比，各劑量組的測試期、重測期和消退期的錯誤動物數均無顯著性差異（P＞0.05）；與模型對照組相比，模型中劑量組測試期、消退期錯誤動物數顯著減少（P＜0.05）。原生DHA 純牛奶在跳臺實驗中能夠延長潛伏期、減少錯誤次數，表明該受試物可以明顯改善小鼠的學習記憶能力。

圖4 原生DHA 純牛奶對小鼠跳臺實驗錯誤次數的影響

圖5 原生DHA 純牛奶對小鼠跳臺實驗錯誤動物數的影響

表2 原生DHA 純牛奶對小鼠跳臺實驗潛伏期的影響

2.3 原生DHA 純牛奶對小鼠避暗實驗的影響

避暗實驗通過利用小鼠喜暗厭明的習性，使它在進入暗室時遭受到電擊，所以小鼠在避暗實驗中的潛伏期和錯誤次數能夠反映出該受試物對小鼠學習記憶的改善作用[23]。由表3 可知，與陰性對照組相比，中劑量組消退期潛伏期顯著延長（P＜0.05），高劑量組測試期潛伏期顯著延長（P＜0.05）；與模型對照組相比，模型高劑量組訓練期、測試期潛伏期均顯著延長（P＜0.05）。由圖6 可知，與陰性對照組相比，中劑量組消退期錯誤次數顯著減少（P＜0.05）；與模型對照組相比，模型各劑量組不同時期的錯誤次數雖無顯著性差異，但可以看出結果有減少的趨勢。由圖7 可知，與陰性對照組相比，中劑量組消退期錯誤動物數顯著減少（P＜0.05）；與模型對照組相比，模型各劑量組不同時期的錯誤動物數雖無統計學差異，但可以看出結果有減少的趨勢。原生DHA 純牛奶在避暗實驗中能夠延長小鼠錯誤潛伏期、減少小鼠錯誤次數，表明該受試物可以明顯改善小鼠的學習記憶能力。

圖7 原生DHA 純牛奶對小鼠避暗實驗錯誤動物數的影響

表3 原生DHA 純牛奶對小鼠避暗實驗潛伏期的影響

2.4 原生DHA 純牛奶對小鼠水迷宮實驗的影響

水迷宮實驗通過小鼠的方向感和空間位置感反映學習記憶能力，所以小鼠在該實驗中到達終點的時間和錯誤次數能夠反映出受試物對小鼠學習記憶的改善作用[23]。由表4 可知，與陰性對照組相比，各劑量組不同時期到達終點的總時間雖無統計學差異，但可以看出結果有減少的趨勢；與模型對照組相比，模型中劑量組到達終點的總時間顯著減少（P＜0.05）。由圖8可知，實驗各劑量組與相應對照組比較，錯誤次數雖無統計學差異，但可以看出錯誤次數的結果有減少的趨勢。由圖9 可知，各劑量組與相應對照組比較，到達終點動物數均無統計學差異（P＞0.05）。原生DHA 純牛奶在水迷宮實驗中能夠減少小鼠到達終點的時間，從結果看出錯誤次數有減少的趨勢，表明該受試物在水迷宮實驗中可以改善小鼠的學習記憶能力。

圖8 原生DHA 純牛奶對小鼠水迷宮實驗錯誤次數的影響

圖9 原生DHA 純牛奶對小鼠水迷宮實驗到達終點動物數的影響

表4 原生DHA 純牛奶對小鼠水迷宮實驗到達終點時間的影響

3 結 論

學習記憶是生物體基本的認知功能，也是生物生存和進化的一種復雜高級神經活動[24]。作為“腦黃金”的DHA，由于對大腦中復雜的學習和記憶機制有著關鍵性的作用，所以認知科學領域的相關研究受到世界各國科學家的廣泛關注，而近些年DHA 營養強化型食品成為了研究的重點[25-27]。微藻作為一種未被完全開發的豐富海洋資源，大多數微藻中都含有較為豐富的DHA，包括我國在內的多個國家都已批準可將富含DHA 的藻油添加進嬰幼兒和成人食品中，為人體學習記憶所需的營養提供保障[28-29]。將處理的微藻粉添加進奶牛的飼料，通過脂肪酸代謝進入奶牛的血液和乳汁產出的原生DHA 純牛奶不僅風味、口感和貨架期與普通純牛奶無明顯差異，還在一定程度上成為了富集DHA 牛奶的有效策略[30-31]。腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)是一種被稱為神經營養因子的蛋白質家族，分布在腦內和外周血清，在學習和記憶中起著重要作用，是DHA 潛在的下游靶目標[32-33]。研究表明，溶血磷脂酰膽堿-DHA通過增加BDNF 的水平增強了小鼠的學習記憶能力，但其機制尚不清楚[11]。LI J[34]等通過魚油和膽堿的聯合攝入，上調了關鍵轉運蛋白的表達，增加了小鼠大腦中DHA 的生物利用度，增強了小鼠的學習和記憶能力。

本研究通過跳臺實驗、避暗實驗和水迷宮實驗3項行為學實驗分析了原生DHA 純牛奶對小鼠學習記憶的輔助改善作用，實驗結果表明中、高劑量組和模型中、高劑量組可以延長跳臺實驗潛伏期、減少錯誤次數，延長避暗實驗潛伏期、減少錯誤動物數，減少水迷宮實驗到達終點總時間。小鼠在絕緣跳臺和明室停留的時間越久、錯誤次數越少，水迷宮實驗到達終點時間和錯誤次數越少，說明該樣品改善學習記憶的作用越好[35]。綜上所述，以上行為學實驗結果表明原生DHA 純牛奶具有改善小鼠的學習記憶的功能，但其量效關系和作用機制尚不明確，我們將在后續研究中進一步探究原生DHA 純牛奶改善學習記憶的相關機制。