乳雙歧桿菌MN-Gup 在發酵乳中的應用及其對血糖的改善作用

李樹森，牛天嬌，康小紅，繆宇思，王然，任發政，肖然*

（1．蒙牛高科乳制品（北京）有限責任公司，北京 101107；2．中國農業大學營養與健康研究院教育部功能乳品實驗室，北京 100083）

0 引 言

益生菌是指足量攝入時對宿主健康有益的活的微生物[1]。近年來，隨著益生菌研究的逐漸深入，其功效作用被逐步探索與證實，除了改善腸道微環境狀態，減輕腸道不良反應外，益生菌還具有緩解機體糖脂代謝異常等功效，被認為是糖尿病輔助治療的潛在性替代產品原料[2-5]。作為益生菌的優質載體，發酵乳不僅有促進胃液分泌、加強消化等基礎功能，添加的益生菌還會在胃腸道中發揮其特殊的功能特性，因此功能性發酵乳將逐漸成為乳品發展的新方向[6-12]。

乳雙歧桿菌Bifidobacterium. animalis. subsp.Lactis.MN-Gup 是分離自巴馬長壽老人腸道并經航天誘變篩選的益生菌菌株（菌種專利保藏號：CGMCC 15578）。該菌株不僅具有良好的耐胃酸、耐膽鹽特性，還具有改善腸道菌群結構，促進短鏈脂肪酸分泌等益生功能[13-14]。前期研究發現MN-Gup 可促進細胞內腸促胰島素胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）的分泌，還可以顯著降低T2D 大鼠的空腹血糖水平、改善胰島素抵抗并調節血脂水平，說明該菌株具有調節血糖血脂代謝，改善二型糖尿病臨床癥狀的益生功能[15-16]。

本研究以乳雙歧桿菌MN-Gup 為研究對象，評估其在發酵乳中的發酵特性及貯藏穩定性，探究該菌株在發酵乳中應用的可能性；同時考察MN-Gup 益生菌發酵乳對T2D 臨床癥狀的改善作用，為乳雙歧桿菌MN-Gup 的工業化應用及益生菌發酵乳多元化開發提供理論依據和數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.2 儀器與設備

YP202N 型電子天平，上海精科儀器有限公司；SW-CJ-1D 型超凈工作臺，蘇州市凈化設備有限公司；DK-98-I 型電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；LRH-250 型生化培養箱，上海一恒儀器有限公司；APV-2000 型高壓均質機，北京同和友德科技有限公司；PB-10 型酸度計，德國賽多利斯集團；3-30 K 型高速離心機，德國Sigma 公司；TA.XT PLUS 型質構儀，英國SMS 公司。

1.3 益生菌酸奶的制備

按圖1 對益生菌酸奶進行制備。

圖1 益生菌酸奶的制備流程

將生牛乳加熱至50～55 ℃預熱后，加入赤蘚糖醇（4%）后攪拌溶解均勻。加熱至60～65 ℃，以20 MPa壓力進行均質。均質后的料液95 ℃殺菌300 s。冷卻至40 ℃左右，在無菌條件下進行接種、充分攪拌溶解均勻，在37 ℃條件下保溫培養；發酵至pH＜4.6，結束發酵后迅速冷卻至19～21 ℃。以300～350 r/min 的轉速進行破乳90～120 s，即時灌裝，并放入2～6 ℃冷庫儲存。

1.4 益生菌酸奶保質期品質的測定

1.4.1 益生菌酸奶活菌數的檢測

采用國標GB/T 4789.35—2016《食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》對MN-Gup 益生菌酸奶中的雙歧桿菌屬活菌數進行測定。

1.4.2 益生菌酸奶pH 值和酸度的測定

采用pH 計對MN-Gup 益生菌發酵乳pH 值測定。

采用滴定法測定發酵乳的酸度，稱取5.00 mL 已攪拌均勻的樣品，置于150 mL 錐形瓶中，加40 mL 新煮沸冷卻至40 ℃的水，混勻后加入3 滴10 g/L 酚酞指示劑，用氫氧化鈉標準溶液滴定至紅色在0.5 min內不消失為終點。消耗的氫氧化鈉標準滴定溶液毫升數乘以20，即為酸度（°T）[17]。

1.4.3 益生菌酸奶黏度的測定

采用將電子黏度計以64 S-1的剪切速率測定10～30 s，重復3 次算出平均值，得到樣品黏度。

1.4.4 益生菌酸奶持水力的測定

離心管稱重，質量為m1；取酸奶10 g 左右，記m2；室溫下5 000 r/min 離心30 min，棄上清液，離心管倒置10 min 后立即稱重，質量為m3，酸奶持水力為酸奶離心后的沉淀物與樣品的百分比，按公式（1）計算持水力（Water holding capacity，WHC）[18]。

1.4.5 感官分析

消費者喜好度小組組成：消費者喜好測試志愿者小組共44 人（女性40 人，男性4 人），年齡在30～40 歲之間，這些成員均存在較高的飲用發酵乳率，有一定的飲品評鑒資格和水平。

發酵乳喜好度測試實驗：酸奶飲品感官實驗的檢測標準參考GB 7101—2015《食品安全國家標準飲料》和GB 16321—2003《乳酸菌飲料衛生標準》，根據其中所述感官關鍵點對樣品進行整體喜好度和風味喜好度，以及稀稠度、順滑度、澀感、甜感和酸感合適度的品評實驗。酸奶的喜好度采用7 分制，喜好度得分越高代表喜好度越好，合適度指標4 分最合適，小于4 分表示指標偏弱，大于4 分表示指標偏強。

1.5 益生菌酸奶對血糖的改善作用

1.5.1 T2D 動物模型及分組

以成年雄性Wistar 大鼠（150±20）g 作為實驗對象，利用高脂飼料（HFD）和鏈脲佐菌素（STZ）誘導的建立二型糖尿病（T2D）模型。購入健康大鼠后，進行1 周適應性喂養，并隨機分成對照組和模型組。STZ誘導前，模型組進行HFD 飼喂。4 周后禁食不禁水12 h，測定大鼠體重，造模組大鼠按30 mg/kg 體質量進行STZ 腹腔注射，正常組大鼠注射等量緩沖液。注射1 周后測定大鼠空腹血糖，空腹血糖≥11.1 mmol/L為造模成功。造模成功的大鼠按空腹血糖隨機分為6組，每組8 只。

根據圖2 分組進行灌胃，胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）是由腸道L 細胞分泌的腸道激素，由于其對血糖的調節作用且副作用小，被當作是治療T2D 的新療法[19]。因此本研究中陽性治療組選擇GLP-1 為大鼠注射藥物。干預組灌胃不含MN-Gup 的普通酸奶和劑量不同的益生菌MN-Gup 酸奶。6 周實驗期間，對照組飼喂基礎飼料，造模組飼喂高脂飼料，所有實驗大鼠給予自由飲水和自由采食。

圖2 動物實驗分組

圖3 MN-Gup 益生菌酸奶在貯藏期的雙歧桿菌活菌數

1.5.2 大鼠血糖指標

實驗大鼠每周測定1 次體重、空腹血糖和餐后2 h血糖。每2 周對大鼠的血清胰島素（Insulin ELISA Kit,Thermo Fisher Scientific） 和血清GLP-1 （GLP-1 ELISA Kit, Thermo Fisher Scientific）進行檢測；同時按公式（2）計算胰島素抵抗指數（HOMA-IR）。

HOMA-IR=空腹血糖值×禁食胰島素含量/22.5 （2）

1.5.3 口服糖耐量試驗（OGTT）

測定大鼠造模后干預前（7 周）和干預結束（14 周）的口服糖耐量。大鼠禁食不禁水16 h 后，以2 g/kg 體質量劑量灌胃葡萄糖水溶液（按照質量濃度40%配制），然后分別在第0 、30、60、90、120 min 時用取大鼠尾靜脈血，利用血糖儀和配套的血糖試紙測定血糖值并記錄。取血后，用碘伏擦拭大鼠被針刺的部位，以防感染。采用origin 軟件繪制血糖變化曲線并計算出糖耐量曲線下面積（area under curve，AUC）[16]。

1.5.4 血清中血脂4 項

采用全自動生化分析儀檢測血清中總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDLC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）。

1.6 數據處理

測定樣品均進行3 次平行實驗，數據用平均值±標準差表示。數據進行單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05 為有統計學差異。

2 結果與討論

2.1 益生菌酸奶在保質期內的雙歧桿菌存活度

益生菌產品在食用時必須含有足夠數量的活菌（至少達到106～107CFU/g）才可達到相應的健康效果[20]。在4 ℃貯藏條件下，發酵后28 d 益生菌酸奶的雙歧桿菌活菌數仍可保持在（8.66±7.99）log10CFU/g，說明MN-Gup 在整個冷藏過程中比較穩定；但在脫冷條件下（15 ℃），乳雙歧桿菌MN-Gup 活菌數下降較快，14 d 下降至（7.22±6.62）log10CFU/g，28 d 貯存期末時活菌數下降到（6.63±5.64）log10CFU/g。

2.2 貯藏期益生菌酸奶的pH 值和酸度變化

隨著貯藏時間的延長，產品的pH 值逐漸降低，這是由于貯存期間乳酸菌繼續利用酸奶中的碳源繼續發酵產酸。在4 ℃冷藏條件下，21 d 內2 種發酵乳的pH 值下降無差異，28 d 時，MN-Gup 益生菌酸奶的pH 值繼續下降（圖4a～4b），這是由于酸奶中的MNGup 活菌持續性產酸的原因，但2 種發酵乳的pH 值仍然在理想發酵乳的最佳pH 值之間（4.0～4.6）[21]。

圖4 益生菌酸奶樣品在4 ℃和15 ℃條件下貯藏期的pH 值和滴定酸度

圖5 益生菌酸奶樣品在在4 ℃和15 ℃條件下貯藏期的黏度值和持水率

益生菌酸奶和普通酸奶在28 d 各貯藏時間點滴定酸度逐漸上升，2 種發酵乳滴定酸度均達到國家標準（＞70 °T），益生菌酸奶的酸度略高于普通酸奶，說明益生菌MN-Gup 會給發酵乳帶來一定的后酸效果，但不同益生菌發酵乳中保加利亞乳桿菌的過度酸化程度不同，乳雙歧桿菌產后酸的效果并不強烈，不會在發酵乳產品的貨架期產生影響產品口感的強后酸現象[22]。

2.3 貯藏期益生菌酸奶的黏度及持水度

黏度和持水度在冷藏過程中的變化也是評價酸奶品質穩定性的重要指標。攪拌和均質會對酸奶的凝膠結構造成破壞，可能導致產品在冷藏期間黏度不穩定、乳清析出[23]。

酸奶持有全部或部分自身水的能力被定義為酸奶的持水力[24]。隨著儲藏時間的延長，普通酸奶和益生菌酸奶乳清析出率均出現上升趨勢，冷藏條件下酸奶的持水率優于脫冷條件，這是由于冷藏保存使部分由于加工過程而分離的凝乳微粒重新凝聚到凝乳微粒的網狀結構中，同時變性的乳清蛋白膨潤化而使得保水率上升。4 ℃條件下益生菌酸奶的析出率低于普通酸奶，可能是乳雙歧桿菌MN-Gup 分泌的胞外多糖增強酸奶的持水能力，有利于防止貯藏過程中乳清的析出，改善發酵乳的產品品質[25-27]。

2.4 益生菌酸奶的感官評價

不同酸奶樣品的喜好度評價如表1 所示，MNGup 益生菌酸奶的整體喜好度和風味喜好度都優于普通酸奶，說明乳雙歧桿菌MN-Gup 發酵產生風味物質，賦予益生菌酸奶獨特的風味口感；由于添加了MN-Gup，益生菌酸奶的酸感較強，這一結果與理化指標相一致。

表1 普通酸奶和MN-Gup 益生菌酸奶的喜好度測試結果

2.5 益生菌酸奶對T2D 大鼠血糖的影響

STZ 干預后，糖尿病模型組體重顯著降低，對照組空腹血糖值為(4.29±0.33) mmol/L，模型組的空腹血糖值分別為 (16.98±3.93) 、(16.91±1.50) 、(17.86±3.34) 、(18.52±4.57) 、(16.49±4.13) mmol/L 和(18.48±2.49) mmol/L，均大于11.1 mmol/L，說明糖尿病模型造模成功。

各組大鼠空腹血糖值如圖6（a）所示，模型組大鼠的空腹血糖值顯著高于對照組（P＜0.05），經干預后GLP-1 組和高劑量益生菌酸奶組T2D 大鼠的空腹血糖顯著降低（P＜0.05），且干預后兩組大鼠空腹血糖值無顯著性差異，普通酸奶組的干預對T2D 大鼠空腹血糖并無改善作用（P＞0.05）。

圖6 益生菌酸奶對T2D 大鼠表觀指標的影響（n=8）

圖7 益生菌酸奶對T2D 大鼠血清胰高血糖素樣肽-1含量的影響（n=8）

糖耐量受損是T2D 胰島素抵抗的直接反映，因此臨床診斷中常用口服葡糖糖耐受試驗（OGTT）作為評價胰島素抵抗的重要指標[28]。實驗對干預前后的大鼠分別進行一次OGTT 測試，如圖6（b），干預前模型組大鼠的OGTT 顯著高于對照組，說明T2D 導致機體葡萄糖耐受能力顯著降低，不同劑量益生菌酸奶干預顯著改善了二型糖尿病大鼠受損的OGTT（P＜0.05）。值得注意的是，普通酸奶組一定程度上降低了T2D 大鼠的OGTT，酸奶屬于低升糖指數食品，具有緩解血糖迅速上升的功效，同時酸奶中含有的鎂和脂肪酸等營養素可以改善機體胰島素抵抗，從而改善血糖異常的情況[29]。

模型組大鼠的血清胰島素與對照組相比沒有顯著差異（P＞0.05）如圖6（c）。STZ 可引起胰島β 細胞破壞和胰島素分泌耗竭，其與長期HFD 聯合誘導可導致二型糖尿病進入終末期狀態，阻止GLP-1 干預逆轉胰島素分泌，這可能是GLP-1 干預不能促進胰島素水平顯著增加的原因[30]。高低劑量的MN-Gup 發酵乳均未顯著升高胰島素水平，表明促進胰島素分泌并不是GLP-1 和乳雙歧桿菌MN-Gup 緩解T2D 的機制。但益生菌酸奶干預組可以顯著改善模型組的胰島素抵抗水平（P＜0.05），高低劑量益生菌酸奶組的HOMA-IR 與GLP-1 組效果無顯著性差異（P＞0.05），但普通酸奶的干預對T2D 大鼠的胰島素抵抗水平并沒有明顯改善（P＞0.05）。

糖代謝可直接與血脂相互作用，T2D 胰島素作用不足會引發脂代謝紊亂，導致血中甘油三酯、膽固醇和高、低密度脂蛋白異常[31]。如圖6（d）所示，模型組大鼠血清中甘油三酯（TC）含量相比于對照組有明顯升高（P＜0.05），但GLP-1 干預和益生菌酸奶干預均可顯著改善T2D 大鼠的甘油三酯水平（P＜0.05），其中高劑量益生菌酸奶組與陰性對照組無統計學差異（P＞0.05）。模型組大鼠血清中總膽固醇（TG）含量比對照組明顯升高（P＜0.05），益生菌酸奶干預組和GLP-1組降低總膽固醇效果顯著（P＜0.05），但普通酸奶組與陽性對照組無統計學差異（P＞0.05）。益生菌酸奶干預可以顯著提高T2D 大鼠血清中高密度脂蛋白（HDLC）含量的同時降低大鼠血清中低密度脂蛋白（LDLC）含量（P＜0.05），表明益生菌MN-Gup 酸奶可明顯改善糖尿病大鼠的脂質代謝紊亂，有助于預防糖尿病心血管疾病并發癥的發生。

2.6 益生菌酸奶對T2D 大鼠血清GLP-1 的影響

GLP-1 主要由回腸和結腸的L 細胞分泌，通過與β 細胞特異性結合刺激胰島素分泌，并在肝臟中促進肝糖元合成抑制糖異生，對體內葡萄糖穩態起到調節作用[32]。

STZ 誘導后，T2D 大鼠血清GLP-1 含量顯著降低（P＜0.05），高低劑量益生菌酸奶干預組可刺激機體GLP-1 分泌水平恢復到對照組水平（P＞0.05），說明益生菌MN-Gup 發酵乳可改善T2D 造成的GLP-1 的分泌降低。

3 結 論

考察了乳雙歧桿菌MN-Gup 在發酵乳中的發酵特性，通過復配基礎發酵劑，制備得到益生菌功能性發酵乳。追蹤實驗顯示，MN-Gup 益生菌酸奶在貯藏期內具有良好的菌株存活度，在4 ℃條件下，保質期末（28 d）雙歧桿菌活菌數仍可維持在108CFU/g，同時保持了良好的酸度及質構狀態，且感官評估中整體喜好度和風味喜好度明顯優于普通酸奶。

通過HFD/STZ 誘導的T2D 大鼠模型進一步驗證了含有乳雙歧桿菌MN-Gup 的益生菌酸奶可以顯著改善二型糖尿病大鼠的空腹血糖、糖耐量受損情況和胰島素抵抗水平，調節脂代謝的同時，刺激體內GLP-1 分泌，說明該益生菌酸奶具有調節血糖代謝，改善二型糖尿病臨床癥狀的潛在益生功能，為乳雙歧桿菌MN-Gup 的產業化應用及功能性發酵乳產品的開發提供了基礎。