4 種食源性致病菌多重PCR 檢測體系的建立及其在乳品檢測中的應用

王珊，高輝明，王雁偉，周思思，龐艷榮，艾鵬飛

（河北科技大學食品與生物學院，石家莊 050018）

0 引 言

近年來食品質量安全事件頻發，屢見不鮮。根據全球數據統計顯示，針對食源性疾病治療的花銷平均每年高達數十億美元[1]。食品安全不斷地受到致病菌的威脅，嚴重影響消費者身體健康，由食源性致病菌引起的疾病也呈上升趨勢[2]。通常，引發疾病的食源性致病菌主要包括志賀氏菌、蠟樣芽胞桿菌、副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌、致病性大腸埃希氏菌等[3-9]。人誤食了食源性致病菌污染的食物后會產生腹痛、腹瀉、惡心嘔吐等癥狀，隨時會對人的生命安全造成不可估量的損害[10-12]。因此，如何快速準確地檢測食源性致病菌是預防食源性疾病暴發的關鍵[13]。

國標法作為食源性致病菌常規的檢測技術，一般情況下需經過復雜繁瑣的過程，如富集培養、形態學觀察、生理生化鑒定等，以致靈敏度低、不易定量[14]、耗時費力[15]，還易引起檢測樣品中菌種的流失，不能第一時間發現并控制潛在風險[16-17]，因此無法高效、精準地評估食品安全[18]。相比之下，聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）作為一項新的分子生物學技術在檢測食源性致病菌中，為檢測致病菌開辟了更加高效準確的新方法[19-20]。多重PCR 檢測技術可以實現在同一PCR 體系中，加入多對引物組合，進行多菌種多樣品的高效分析[21-22]，可以實現在短期內同時篩選多組檢測樣品，極大地縮短檢測時間，提高檢測效率，目前已在多種有害微生物的快速檢測中得到應用[23-25]。如SHI X 等[26]利用多重PCR 技術實現了對牛奶中金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌和單核細胞增生李斯特菌等3 種致病菌的檢測，譚燕等[27]采用多重PCR 檢測食品中鼠傷寒沙門氏菌，WANGZ 等[28]利用多重PCR 檢測方法，快速檢測禽類中鼠傷寒沙門氏菌屬、奇異變形桿菌、大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌、銅綠假單孢菌和金黃色葡萄球菌等6 種致病菌。

目前，針對在食品中同時快速檢測單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）、蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）、腸道出血性大腸埃希氏菌O157:H7（Escherichia coliO157: H7）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella）等4 種食源性致病菌的報道鮮少?；诖耍緦嶒灨鶕鲜? 種食源性致病菌的特異基因設計引物，通過優化多重PCR 反應體系及擴增條件，構建了一套多重PCR 快速檢測方法，并通過對人工污染牛奶檢測來評估該技術的可行性，為當前快速發展的食品安全檢測行業提供了理論指導和技術支持[29]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

4 株目標病原菌。單核細胞增生李斯特氏菌（CMCC 54001）、鼠傷寒沙門氏菌（CMCC 50115），中國醫學菌種保藏中心；蠟樣芽胞桿菌（CICC 21290）、腸道出血性大腸埃希氏菌O157∶H7（CICC 21530），中國工業微生物菌種保藏中心。14 株非目標菌。綠膿桿菌（CMCC 1011）、表皮葡萄球菌（CMCC 26069）、多黏類芽胞桿菌（CMCC 63512），中國醫學菌種保藏中心；副溶血性弧菌（CICC 21617）、蘇云金芽胞桿菌（CICC 22945）、枯草芽胞桿菌（CICC 10002）、福氏志賀菌（CICC 10865）、霍亂弧菌（CICC 23794）、巴氏醋桿菌（CICC 23561），中國工業微生物菌種保藏中心；金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）、阪崎腸桿菌（ATCC 51024）、弗氏檸檬酸桿菌（ATCC 43864）、空腸彎曲菌（ATCC 29428）、結核分枝桿菌（ATCC 25177），美國標準菌種收藏所。

1.1.2 試劑

2×Rapid Taq Master Mix，南京諾贊維生物科技有限公司；細菌基因組DNA 提取試劑盒，北京索萊寶生物科技有限公司；50×TAE Buffer，上海宇牧博生物科技有限公司；蛋白胨、酵母粉，OXOID 公司；瓊脂凝膠提取試劑盒，Omega 公司；零背景pTOPO-Blunt 平末端克隆試劑盒，艾德萊生物科技有限公司；50 bp DNA Ladder、DH5α，天根生化科技有限公司；其它生化試劑為國產分析純試劑。

1.2 儀器與設備

Veriti PCR 熱循環儀，美國ABI 公司；Gel Doc XR 凝膠成像系統，美國Bio-Rad 公司；DS-11 型超微量核酸測量儀，美國DeNovix 公司；DYY-6D 生化電泳儀，北京六一生物科技有限公司；CT15RE 臺式微量高速離心機，日本Himac 公司；QL-901 Vortex漩渦混合器，海門其林貝爾儀器制造公司；-80 ℃超低溫冰箱，安徽美菱股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種的培養

從-80 ℃冰箱中取出菌種凍存管，解凍回溫后，將4 株目標病原菌和14 種非目標菌分別采用平板劃線法接種到LB 固體培養基中，置于37 ℃培養箱中培養過夜。分別挑取單菌落接種于LB 液體培養基中，置于搖床中37 ℃、180 r/min 培養過夜。

1.3.2 模板的制備

吸取培養過夜的菌懸液2mL 于離心管中，12 000r/min離心2 min，棄上清液提取基因組DNA 作為模板，詳細操作步驟按照細菌基因組DNA 提取試劑盒說明書進行。對提取的DNA 用超微量核酸測定儀測定DNA濃度及純度。測得DNA 濃度均為100～150 ng，OD260/280 比值約為1.83。

1.3.3 引物的設計及合成

通過NCBI-Blastn 對單核細胞增生李斯特氏菌的prfA基因、蠟樣芽孢桿菌的gyrB基因、鼠傷寒沙門氏菌的invA基因和腸道出血性大腸埃希氏菌O157∶H7的stx2A基因進行同源比對，利用Primer 5.0 和Oligo 6.0 軟件對目的基因進行引物設計，選取軟件分析得分高且擴增片段大小不同的4 對引物，委托生工生物工程有限公司（上海）合成。引物序列及擴增片段長度如表1 所示。

表1 多重PCR 引物序列

1.3.4 引物特異性驗證

用表1 中的引物分別對4 種菌進行PCR 擴增。單重PCR 反應體系：2×Rapid Taq Master Mix 10 μL、10 μmol/L 上下游引物各0.8 μL、DNA 模板0.3 μL，添加無菌ddH2O 補足至20 μL；單重PCR 反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性15 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸25 s，32 個循環；72 ℃延伸5 min。PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠對電泳后，采用Omega 膠回收試劑盒對電泳條帶回收，連接到pTOPO-Blunt 載體上，并轉入到DH5α 感受態細胞中，37 ℃過夜培養，選取陽性克隆寄送擎科生物科技有限公司（北京）測序，并對測序結果比對分析。

1.3.5 多重PCR 退火溫度優化

用篩選得到的引物進行多重PCR 退火溫度優化試驗。多重PCR 反應體系：2×Rapid Taq Master Mix 10 μL、10 μmol/L 上下游引物各0.8 μL，DNA 模板各0.3 μL，添加無菌ddH2O 補足至20 μL；多重PCR 反應程序：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性15 s，退火20 s，退火溫度分別設定50、52、54、56、58、60、72 ℃延伸25 s，32 個循環；72 ℃后再延伸5 min。 PCR 擴增產物經3%瓊脂糖凝膠電泳后，采用凝膠成像分析系統觀察結果。

1.3.6 多重PCR 引物濃度確定

用篩選得到的引物進行多重PCR 引物濃度優化試驗。多重PCR 反應體系：2×Rapid Taq Master Mix 10 μL、10 μmol/L 的引物用量按照表2 進行4 因素3水平正交試驗進行優化[30]，DNA 模板各0.3 μL，無菌ddH2O 補足至20 μL。多重PCR 反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性15 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸25 s，32 個循環；72 ℃延伸5 min。PCR 擴增產物經3%的瓊脂糖凝膠電泳后，采用凝膠成像分析系統觀察結果，以確定反應體系中最佳引物濃度。

表2 正交試驗

1.3.7 多重PCR 特異性試驗

為了檢測建立的多重PCR 擴增的特異性，利用優化得到的多重PCR 檢測體系對非目標菌DNA 模板進行擴增。取金黃色葡萄球菌等14 種非目標菌DNA 各0.3 μL 混合作為陰性對照，4 種目標菌按照表3 添加模板DNA 于同一個反應管中進行擴增反應，根據擴增條帶分析有無反應內交叉錯配現象[31]。

表3 特異性驗證試驗

1.3.8 多重PCR 檢出限確定

用無菌的ddH2O 分別對單核細胞增生李斯特氏菌、蠟樣芽胞桿菌、鼠傷寒沙門氏菌和腸道出血性大腸埃希氏菌O157:H7 的菌懸液進行10 倍梯度的稀釋，通過平板計數來確定其濃度。分別提取DNA 作為多重PCR 反應的模板，在優化的多重PCR 反應體系中進行擴增以確定各目標菌的最低檢出限。

1.3.9 多重PCR 檢測方法檢驗人工污染乳制品

目前，我國食品中致病菌的檢測基本上采用的是“國標法”[32]。為了驗證四重PCR 檢測方法的有效性，分別用多重PCR 方法和GB 4789.30—2010《食品微生物學檢驗單核細胞增生李斯特菌檢驗》、GB4789.14—2003《食品微生物學檢驗蠟樣芽胞桿菌檢驗》、GB 4789.4—2016《食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗》、GB 4789.36—2016《食品微生物學檢驗大腸埃希氏菌O157∶H7 菌檢驗》對不同人工接種污染新鮮牛奶處理樣品（樣品中各種致病菌濃度為102CFU/mL）進行檢測。以人工接種病原菌新鮮牛奶在37 ℃下恒溫振蕩培養3 h 作為DNA 提取的試驗樣品。

2 結果與分析

2.1 引物特異性驗證結果

用表1 中的引物分別對單核細胞增生李斯特氏菌、蠟樣芽胞桿菌、鼠傷寒沙門氏菌和腸道出血性大腸埃希氏菌O157∶H7 進行擴增，以14 種非目標菌和ddH2O 作為對照。擴增結果如圖1 所示，在各添加目標菌DNA 的反應中均能擴增出目的條帶，分別為274、221、482、108 bp，而對非目標菌均無擴增條帶，說明設計的4 對引物都只對目標菌的模板DNA 具有特異性擴增。將目的片段純化回收、構建重組質?？寺?、送公司測序，經序列比對發現擴增片段與GenBank 數據庫中序列完全一致。

圖1 引物特異性擴增結果

2.2 多重PCR 退火溫度優化結果

在PCR 反應中，退火溫度過低會因引物的錯配而產生非特異性擴增，退火溫度過高會抑制引物與模板的結合從而導致擴增效率下降[30]。本試驗中對PCR退火溫度優化結果如圖2 所示，退火溫度較低（1、2 泳道）時，單增李斯特菌和蠟樣芽胞桿菌中沒有擴增出目的條帶，且出現了非特異條帶；隨著退火溫度升高（3～5 泳道），各目標菌模板DNA 逐漸擴增出清晰可見的條帶；當退火溫度上升到60 ℃時，單增李斯特菌和蠟樣芽胞桿菌中又沒有擴增出目的條帶。綜上分析，選取泳道5 中4 條目的條帶清晰、明亮的58 ℃作為最佳退火溫度進行后續試驗。

圖2 不同退火溫度的多重PCR 擴增結果

2.3 多重PCR 引物濃度優化結果

每對引物在單重PCR 擴增時表現出清晰明亮的條帶，當多對引物進行多重PCR 擴增時由于引物間彼此干擾會出現條帶亮度不一現象，引物濃度過低時目標條帶暗淡，引物濃度過高時目標條帶過于明亮而彌散[30]。本試驗對引物濃度優化的結果如圖3 所示，在泳道1～5 中，由于單增李斯特菌引物prfA加入量過低，擴增的目的條帶暗淡；在泳道9 中，由于大腸桿菌O157∶H7 引物stx2A加入量過低，擴增的目的條帶也較暗；在泳道6～8 中，4 條目標條帶都清晰明亮。綜合考慮條帶明亮度的均一性及最大限度提高擴增效率，確定泳道6 中invA基因引物添加量0.6 μL、prfA基因引物添加量0.8 μL、gyrB基因引物添加量1 μL 和stx2A基因引物添加量0.8 μL 為較佳的引物用量組合。

圖3 不同引物濃度的多重PCR 擴增結果

2.4 多重PCR 特異性試驗結果

利用建立的四重PCR 反應體系，進行擴增的特異性驗證試驗，結果如圖4 所示，對比泳道1 和2，在同一反應中只要添加有4 種目標菌模板DNA 時都能擴增出4 條特異性目的條帶（482、274、221、108 bp），其它非目標菌DNA 沒有表現出對PCR 擴增結果的干擾和假陽性影響；在泳道3～6 中，分別只擴增出對應的3 種目標菌的目的片段，沒有出現非特異性擴增條帶。綜合上述試驗結果表明，基于檢測4 種目標致病菌設計引物而建立的四重PCR 擴增體系具有良好的特異性。

圖4 多重PCR 體系的特異性驗證

2.5 多重PCR 檢出限結果

分別將4 種致病菌的菌懸液（單增李斯特菌1.2×107CFU/mL，蠟樣芽胞桿菌1.8×107CFU/mL，鼠傷寒沙門氏菌3.4×107CFU/mL，腸道出血性大腸埃希氏菌O157∶H7 2.5×107CFU/mL）進行100～10-7梯度稀釋，提取DNA 后進行同一稀釋梯度等級的多重PCR擴增試驗，結果如圖5 所示，4 種致病菌的最低檢出限分別為單核細胞增生李斯特氏菌1.2×102CFU/mL，蠟樣芽胞桿菌1.8×102CFU/mL，鼠傷寒沙門氏菌3.4 CFU/mL，腸道出血性大腸埃希氏菌O157∶H7 2.5×102CFU/mL。

圖5 不同稀釋梯度下多重PCR 擴增結果

2.6 多重PCR 檢測方法檢驗人工污染乳制品

采用多重PCR 檢測方法和國標法分別對17 份樣品檢測。結果由表4 可知，多重PCR 檢測方法和菌株分離培養法2 種方法的檢測結果完全一致，符合率均為100%。但是傳統的菌株分離培養法需要5～7 d，本多重PCR 檢測方法僅需要5～6 h，大大提高了檢測效率。

表4 多重PCR 方法和菌株分離培養法檢測染菌牛奶樣品的結果比較

3 結 論

建立了乳品中單增李斯特菌、蠟樣芽胞桿菌、鼠傷寒沙門氏菌和腸道出血性大腸埃希氏菌O157∶H7四重PCR 檢測方法。采用4 對引物在一個反應體系中擴增出可鑒別4 種目標菌的特異性基因片段，縮短了檢測時間，提高了檢測效率。通過對4 種目標菌和14 種非目標菌的特異性驗證試驗，證明了本方法具有良好的特異性。此外，本方法具有良好的靈敏度，最低檢出限為10～102CFU/mL，比馮可等[30]檢出限105CFU/mL提高了103倍，一定程度上說明本研究設計的引物與靶標序列具有良好的匹配性和建立的多重PCR 擴增體系優良。對17 份人工染菌牛奶樣品進行檢測，檢測結果與國標法中分離培養檢測符合率達到100%，說明本多重PCR 方法應用于乳品中致病菌檢測是可行的。檢測時間由國標法的5～7 d 縮減到5～6 h，極大縮短了檢測周期、提高了檢測效率。綜上可知，本研究建立的多重PCR 檢測方法具有良好的特異性、敏感性和穩定性，為快速、高效檢測乳品中多種致病菌提供了切實可行的技術手段，在保障食品安全方面具有重要實踐意義。