超高效液相色譜-串聯質譜法檢測乳清蛋白粉中神經節苷脂GD3

宋戈，苗晶，孫立慶，高珊，徐慧，許瑞敏，李筱薇

（1.黑龍江省綠色食品科學研究院，哈爾濱 150028；2.美贊臣嬰幼兒營養品研發中心有限公司，廣州 510000）

0 引 言

神經節苷脂在大腦發育和功能中具有重要作用，與嬰兒免疫系統調節和腸道發育成熟有關，還有細胞黏附、分化和增殖、調節離子通道和神經遞質釋放的細胞功能[1-2]。神經節苷脂是組織和血液中細胞質膜的一部分，其在神經組織如大腦中的濃度最高。在牛奶中，它們是乳脂球膜的一部分[3-4]，雙唾液酸神經節苷脂GD3和單唾液酸神經節苷脂GM3是牛奶和乳制品主要的神經節苷脂，其中神經節苷脂GD3分別占牛乳和牛乳清蛋白粉中神經節苷脂總含量的60%和80%，而GM3僅以微量存在[5-7]。早期采用薄層色譜法，通過間苯二酚反應染色或比色法測定神經節苷脂總量[8]，采用反相高效液相色譜-紫外檢測方法分離直接測定和量化以其過氧化苯甲酰或對硝基苯胺衍生物形式存在的神經節苷脂[9-11]。近年來，飛行時間質譜技術以其可獲得結構信息、高選擇性和高靈敏度等優點，在神經節苷脂的構成和測定中發揮了重要的作用[12-23]，對儀器配備要求高。也有采用串聯四級桿質譜對神經節苷脂定量測定[24-35]，要求標準物質和樣品中神經節苷脂GD3的分子種類一致，需要測定神經節苷脂GD3每個分子類別的含量再加和，樣品中含量占比低的神經節苷脂GD3分子種類可能檢測不到，而且神經節苷脂分子類別繁多，計算復雜，對分離要求高。

本方法針對乳清蛋白粉，通過三氯甲烷甲醇溶液提取，除去樣品中蛋白質，再經甲醇水溶液反萃取，利用硅膠色譜柱分離，超高效液相色譜-串聯質譜多種掃描模式測定神經節苷脂GD3，并在實際樣品的檢測中得以應用，為進一步研究強化神經節苷脂的食品檢測提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

AB4500 超高效液相色譜串聯質譜儀，配有電噴霧離子源，美國AB 公司；TTL-DCⅡ水浴加熱儀，北京同泰聯科技有限公司；pB-10 酸度計，德國Sartorius公司；KQ-250DE 超聲波振蕩器，昆山市超聲儀器公司；VORTEX3 渦旋混合器，德國IKA 公司；SQP 天平，分度值為0.0001 g，德國Sartorius 公司。

1.2 試劑與材料

神經節苷脂GD3，從牛酪乳中分離得到以銨鹽形式存在（純度≥98%），美國Matreya 公司；乙腈、乙酸銨、三氯甲烷、甲醇均為色譜純，購自德國默克公司；冰乙酸和氯化鉀為優級純，天津科密歐公司。所有用水均為電阻率≥18.2 MΩ·cm 的超純水，以上試劑除標注的外均為分析純。

1.3 標準溶液的制備

神經節苷脂GD3標準儲備溶液：稱取適量的（精確至0.1 mg）神經節苷脂標準物質于10 mL 容量瓶中，用甲醇-水溶液(V甲醇：V水=1：1)溶解并定容，折算純度后達到1.0 g/L。-18 ℃保存，有效期1 周。

神經節苷脂GD3標準工作溶液：準確吸取神經節苷脂標準儲備溶液1.0 mL 到10 mL 容量瓶中用甲醇-水溶液(V甲醇：V水=1：1) 定容，搖勻后再吸取0、0.05、0.10、0.50、1.00、2.00、2.50 mL 至10 mL 容量瓶中，用甲醇-水溶液(V甲醇：V水=1：1)定容搖勻。標準工作溶液濃度分別為0、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0 和25.0 μg/mL，臨用前配制。

1.4 實驗條件

1.4.1 UPLC-MS/MS 條件

色譜條件：Syncronis HILIC 色譜柱（1.7 μm，100 mm×2.1mm），柱溫為25 ℃，進樣體積為5 μL，流動相體系為（A）95%乙腈5% 0.01 mol/L 乙酸銨溶液pH（5.6±0.5）和（B）50%乙腈50%0.01 mol/L 乙酸銨溶液pH（5.6±0.5）；流速為0.5 mL/min。梯度洗脫程序：0～3 min，99%A；3～6 min，99%A 勻速降至60%A；6～10 min，60%A；10～11 min，60%A 線性升至99%A，保持5 min。

質譜條件：電噴霧離子化（ESI）,負離子模式；離子化電壓，4.5 kV；離子源溫度，450 ℃；氣簾氣，0.22 MPa；霧化氣，0.50 MPa；輔助加熱氣，0.50 MPa；采用多反應監測（MRM）模式采集數據進行定性分析，質譜參數如表1 所示。

表1 多反應監測模式參考質譜參數

采用母離子模式(Precursor Mode)采集數據進行定量測定，質譜參數如表2 所示。

表2 母離子模式參考質譜參數

1.4.2 樣品處理

稱取試樣2.5 g，加入一級水25 mL 超聲溶解，轉移并用一級水定容50 mL，搖勻后準確吸取1.0 mL，加入4 mL 三氯甲烷-甲醇溶液(V三氯甲烷∶V甲醇=1∶2)于帶蓋離心管中渦旋混合，在混搖振蕩器上振蕩10 min，取出在4 000 r/min 下離心10 min，移取上清液于另一帶蓋離心管中，剩余沉淀物加1.0 mL 去離子水，振蕩混勻后再加4 mL 三氯甲烷-甲醇溶液(V三氯甲烷∶V甲醇=1∶2)，渦旋混合后在混搖振蕩器上振蕩10 min，取出在4 000 r/min 下離心10 min 移出上清液，合并的上清液中加入2.0 mL 一級水，渦旋混合后在4 000 r/min下離心10 min，轉移上層水相層于10 mL 容量瓶中，下層有機溶液再加入0.25 mL、0.01 mol/L 氯化鉀水溶液和0.35 mL 甲醇，渦旋混合后在4 000 r/min 下離心10 min，轉移上層水相層合并于10 mL 容量瓶中用甲醇定容，混勻后用0.22 μm 的有機膜過濾后上機測定。

1.4.3 定量測定

神經節苷脂GD3標準工作液和試樣提取液注入超高效液相色譜串聯質譜儀中測定，神經節苷脂多反應離子監測子離子色譜圖如圖1 所示，神經節苷脂GD3母離子掃描色譜圖如圖2 所示。

圖1 神經節苷脂GD3 多反應離子監測子離子色譜

圖2 神經節苷脂GD3 母離子掃描色譜

2 結果與討論

2.1 色譜條件的選擇與優化

神經節苷脂GD3是一類鞘糖脂，由疏水性神經酰胺核和2 個唾液酸殘基的親水性寡糖鏈組成。該神經酰胺由鞘氨醇基主干和具有不同鏈長及飽和程度的脂肪酸組成[14-20]。通過質荷比在300～2 000 掃描范圍內的神經節苷脂GD3標準溶液的母離子掃描，發現產生了一系列雙電荷[M-2H]2-離子簇如圖3 所示，占主導的離子有707.8、715.1、721.0、728.0、734.9、742.0、748.9、756.0、763.0、770.1、777.1、784.1，例如m/z 為770.1 的GD3分子在神經酰胺部分可能含有具備23 個碳原子和0 個雙鍵的酰基脂肪酸、具備18 個碳原子和1 個雙鍵的二羥基鞘氨醇堿基脂肪酸（表示為d23:0/18:1）[14-21]。基于結構中的神經酰胺部分，神經節苷脂GD3可以在反相柱上分離[18,24-25]，但需要將神經節苷脂GD3混合物中的不同脂肪酸構成的每一個神經節苷脂GD3分子種類分離，不能存在重疊現象才能準確定量，而且要求不同脂肪酸構成的每一個神經節苷脂GD3分子種類的標準溶液濃度準確。由于沒有不同脂肪酸構成的每一個神經節苷脂GD3分子種類的標準品，只能通過對神經節苷脂GD3混合物標準溶液進行分離后采用面積歸一化法確定標準溶液中不同脂肪酸構成的每一個神經節苷脂GD3分子種類的濃度，定量樣品中對應的分子，最后把每種分子的含量加和，得到總神經節苷脂GD3的含量。

圖3 神經節苷脂GD3 標樣一級質譜掃描離子

對比反相色譜柱分離，利用結構中2 個唾液酸殘基的親水性寡糖鏈組成的共性，親水相相互作用分離模式[29-31]，能夠使神經節苷脂GD3混合物中的不同脂肪酸構成的每一個神經節苷脂GD3分子種類保留相同，共流出形成一個色譜峰，不需要確定不同脂肪酸構成的每一個神經節苷脂GD3分子種類的標準溶液濃度，從而便于定量。試驗比對氨丙基團 (Thermo APS-2 HYPERSIL 150 mm×2.1 mm，3 μm)、兩性離子基團(Agilent Poroshell 120 HILIC-Z 100 mm×4.6 mm，2.7 μm)和純硅膠(Thermo Syncronis HILIC 100 mm×2.1 mm,1.7 μm) 色譜柱，采用1.4.1 色譜條件測定神經節苷脂GD3混合物標準溶液，如圖4 所示。根據文獻[14-15,29-31]采用乙腈和乙酸銨緩沖液作為流動相，基于硅膠色譜柱的親水相相互作用分離模式，流動相的pH 會影響神經節苷脂的電離，影響峰形、響應和保留時間。為保證每種神經節苷脂GD3分子的充分離解，與硅膠色譜柱固定相產生的色譜行為和親水作用力一樣，共流出形成一個色譜峰，試驗比對了1.4.1 色譜條件中流動相A 和B 的pH 為3 時與pH 為5.6 時測定神經節苷脂GD3混合物標準溶液，如圖5 所示。當流動相pH 過大時，硅膠色譜柱固定相可能會發生流失。將有機相和水相進行預混，再分為流動相的兩路，可以避免純有機相和純水相在梯度洗脫混合時帶來的化學環境波動，保證整個分離過程中流動相的pH 穩定，所以確定了1.4.1 色譜條件。

圖4 不同色譜柱分離神經節苷脂GD3 標樣多反應離子監測離子色譜

圖5 不同pH 的流動相分離神經節苷脂GD3 標樣多反應離子監測離子色譜

2.2 質譜參數的選擇與確定

根據MA L 等[14-15]，THAKKAR S K 等[25]和GIUFFFRIDA F 等[18]的研究，神經節苷脂GD3是一類化合物的混合物，有共同的子離子290/581，可以利用硅膠色譜柱的親水相互作用分離模式共流出，試驗采用質譜儀母離子掃描方式對神經節苷脂GD3定量，優化確定參數，如表2 所示。利用質譜儀對不同脂肪酸構成的每一個神經節苷脂GD3分子種類具有分離分辨的能力，同時采用了多反應通道選擇性掃描方式對神經節苷脂GD3定量，優化確定參數，如表1 所示。試驗采用母離子掃描方式和多反應通道選擇性掃描方式同時對9 個乳清蛋白粉進行定量測定，并得到不同掃描方式測定的回收率和精密度。結果表明，樣品采用母離子掃描方式定量測定的含量比多反應通道選擇性掃描方式定量測定的含量偏高10%左右，但兩者的回收率和精密度差別不大。根據MA L 等[14-15]，LEE H 等[16]和FONG B 等[29]的研究，乳清蛋白粉樣品中不同脂肪酸構成的神經節苷脂GD3分子種類與神經節苷脂GD3標準物質有差異，導致多反應通道選擇性掃描方式沒有涵蓋樣品中某一些神經節苷脂GD3分子種類，測定結果偏低。采用母離子掃描方式定量測定能準確測定乳清蛋白粉樣品中神經節苷脂GD3的含量，可以將標準品和樣品中所有可能的分子種類包括在內，不會漏檢，再利用多反應通道選擇性掃描方式進行定性。

2.3 樣品提取條件的優化

根據SVENNERHOLM L 等[28]和FONG B 等[29]所述方法對樣品提取進行了優化。試驗對比相同體積的樣品溶液用相同體積的提取劑提取，提取劑中三氯甲烷與甲醇的體積對比不同乳清蛋白粉樣品沉淀蛋白、分層以及轉移操作的效果，如圖6 所示，得到樣品溶液用三氯甲烷與甲醇的體積比為1∶2 時，沉淀在底部便于轉移上清液，提取效果較好。取1 mL 樣品溶液用不同體積的三氯甲烷甲醇溶液(V三氯甲烷∶V甲醇=1∶2)提取, 在2.3 方法的條件下進行回收率的測定，如圖7 所示，加入4 mL 三氯甲烷甲醇溶液(V三氯甲烷∶V甲醇=1∶2)時的回收率趨于穩定。提取后的提取液是三氯甲烷、甲醇與水的混合溶液，含有大量親脂化合物。利用神經節苷脂的親水性，以水為萃取劑，向提取液中加入水破壞相平衡而分層，促使親脂化合物轉移到三氯甲烷層中，神經節苷脂轉移到甲醇水溶液層中，棄去下層三氯甲烷除脂，比較加入不同體積的水的效果，如圖8 所示，同時按2.3 方法進行回收率的測定，得到加入2 mL 水時分層明顯除脂效果較好，回收率也趨于穩定，如圖9 所示。最后對轉移完上層甲醇水溶液剩下的下層三氯甲烷進行第二次萃取，用少量0.01 mol/L氯化鉀水溶液和甲醇有利于分層轉移，完全提取目標物，又不影響定容，試驗最終確定了1.4.2 樣品處理方法。

圖6 不同三氯甲烷與甲醇體積比的提取劑在提取樣液中產生的效果

圖7 不同體積的三氯甲烷-甲醇提取劑(V 三氯甲烷∶V 甲醇=1∶2)對回收率的影響(n=2)

圖8 提取液中加入不同體積的水產生的效果

圖9 提取液中加入水的體積對回收率的影響(n=2)

2.4 標準曲線和檢出限

取不同濃度0、0.5、1.0、5.0 、10.0、20.0 和25.0 μg/mL的神經節苷脂GD3標準工作溶液，用超高效液相色譜串聯質譜儀測定,采用母離子掃描方式定量和多反應通道選擇性掃描方式定量，記錄目標峰峰面積。以峰面積與標準溶液濃度繪制線性回歸曲線，并以3 倍信噪比計算出樣品稱取2.5 g 的檢出限，結果如表3 所示。

表3 不同掃描方式的線性和檢出限

2.5 精密度和回收率

以同一個乳清蛋白粉為實驗材料，稱取2.5 g 樣品后，再分別加入2.5 mg 和5.0 mg 的神經節苷脂GD3標樣，對樣品及2 個不同濃度的加標樣品進行6 次平行測定，計算樣品測定的精密度和回收率。超高效液相色譜串聯質譜法采用母離子掃描方式測定和多反應通道選擇性掃描方式測定的回收率和精密度如表4 所示。

表4 不同掃描方式在2 個水平下的加標回收率和精密度(n=6)

2.6 實際樣品的測定

按照本方法對市售的乳清蛋白粉9 個樣品進行神經節苷脂GD3含量的測定，結果如表5 所示。從實際樣品的檢測結果來看，超高效液相色譜串聯質譜法無論采用母離子掃描方式測定，還是多反應通道選擇性掃描方式測定，靈敏度和準確都可以滿足實際測試的需求。

表5 不同掃描方式測定樣品中神經節苷脂GD3 的含量(n=2)

3 結 論

研究了乳清蛋白粉樣品中神經節苷脂GD3的提取條件、色譜分離條件和質譜檢測參數，建立了超高效液相色譜-串聯質譜測定乳清蛋白中雙唾液酸神經節苷脂GD3的方法。該方法測定結果重現性好，準確度高，簡單快捷，不要求標準物質和樣品中神經節苷脂GD3的分子種類一致，樣品中含量占比低的神經節苷脂GD3分子種類也能檢測出，不需要測定神經節苷脂GD3每個分子類別的含量再加和，能簡單方便地直接測定神經節苷脂GD3總量，能為乳清蛋白粉樣品中神經節苷脂GD3含量的測定提供參考。