UPLC-MS/MS 測定特殊醫學用途配方乳粉中姜黃素類化合物

公丕學，戴琨，薛霞，徐大瑋，趙寅，王駿，胡梅，張喜琦，劉艷明

（山東省食品藥品檢驗研究院，國家市場監管重點實驗室（肉及肉制品監管技術），產業技術基礎公共服務平臺，山東省特殊醫學用途配方食品質量控制工程技術研究中心，濟南 250101）

0 引 言

姜黃素是一種從姜科、天南星科等植物根莖中獲取的一種二酮類天然化合物，是橙黃色晶體粉末，其味稍苦，不易溶于水[1]。姜黃素具有消炎、降血脂、抗癌、抗腫瘤、利膽、抗氧化、治療耐藥性結核病等作用[2-6]。姜黃素類化合物結構如圖1 所示，含有β-二酮及酚基基團，存在3 種化合物分別是姜黃素（curcumin，CurI）、脫甲氧基姜黃素（demethoxycurcumin，CurII）、雙脫甲氧基姜黃素（bidemethoxycurcumin，CurIII）[7]，3種姜黃素化合物結構相似，具有相似的生物活性，但由于結構上存在微小差異又使它們在抗腫瘤、抗氧化等方面的能力有較大差異[8]，3 種化合物的含量也不同，其中CurI 約為70%，CurII 約為10%～20%，而CurIII約為10%[9]。姜黃色素具有較好的熱穩定性，但耐光性較差，室外光照會使乙醇溶液中的姜黃素類化合物降解[10]。食品中含少量的姜黃素，食用其對人體造成的不良反應較小，但過多食用含姜黃素過量的食品，也會造成一些不利影響，如對人體會造成接觸性皮炎、起紅疹、持續性瘙癢和灼痛；引起腸胃道反應，出現燒心和胃酸過多，導致反胃、嘔吐或腹瀉；可能加重結石病人、貧血患者、孕婦等特殊人群患病風險[11]。目前我國姜黃（以姜黃素計）作為著色劑在調制乳粉和調制奶油粉（包括調味粉和調味奶油粉）中使用最大限量為0.4 g/kg[12]，但在特殊醫學用途配方乳粉中并未查到使用限量，有望作為功能成分在其中使用。

圖1 姜黃素化合物結構式

目前文獻報道的姜黃素檢測方法主要有電化學法[13]、分光光度法（spectrophotometry，SP）[14]、薄層色譜法（thin-layer chromatography，TLC）[15]、毛細管電泳法（capillary electrophoresis，CE）[16]、化學發光法（chemiluminescence method，CL）[17]、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[18-20]、UPLC-MS/MS 法[21-26]，其中HPLC 應用最為廣泛。檢測方法主要針對生物檢材、中成藥居多，行業標準《出口食品中姜黃素的測定》是針對食品中姜黃素類化合物的檢測[27]，檢測范圍包含調制乳粉，并沒有關于特殊醫學用途配方乳粉中姜黃素類化合物含量的測定。特殊醫學用途配方乳粉是適應對母乳和普通奶粉過敏（主要是對牛奶蛋白，如β-乳球蛋白過敏）的孩子，當然常見的嬰兒特殊醫學狀況也包括乳蛋白過敏、乳糖不耐受、早產/低體重、苯丙酮尿癥、營養不良等。其中根據病患情況需要特殊添加某些成分，比如不同水解程度的氨基酸、還有氯化膽堿、礦物質及維生素等多種成份，這些非目標物就成為分析時的干擾物質，在實驗過程中需要盡量降低干擾物的影響[28-29]。本研究針對特殊醫學用途配方乳粉樣品基質復雜、蛋白含量高等特點，選擇通過式固相萃取凈化方式，優化實驗方法，結合超高效液相色譜串聯質譜的定性定量準確的優點，建立UPLC-MS/MS 法測定特殊醫學用途配方乳粉中姜黃素含量。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

ACQUITY UPLC，美國Waters 公司；SCIEX Triple Quad 5500 三重四極桿質譜儀配有電噴霧離子源（ESI）及MultiQuant 數據處理系統，美國SCIEX 公司；UMV-2 多通道漩渦混合器，山東青云實驗耗材有限公司；3-18K 離心機，德國Sigma 公司；恒溫氮吹濃縮儀，美國Organomation 公司。

甲醇、乙腈均為色譜純，德國Merck 公司；甲酸（Formic acid，FA）、氨水（Ammonium hydroxide，AH）、乙酸銨（Ammonium acetate，AA）均為色譜純，美國Fisher 公司；CurI（CAS 號：458-37-7，純度≥98%）、CurII（CAS 號：22608-11-3，純度≥98%）、CurIII（CAS號：33171-05-0，純度≥98%），德國Dr.Ehrenstorfer 公司；實驗用特殊用途配方乳粉，市售。

固相萃取柱C18（200 mg/6 mL）、HLB（200 mg/6 mL）、Oasis PRiME HLB （200 mg/6 mL），美國Waters 公司；色譜柱ACQUITY UPLC HSS T3、色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18、色譜柱ACQUITY UPLC BEH Shield RP18，Waters 公司。

1.2 標準溶液配制

標準溶液配制：分別將3 種姜黃素標準品準確稱取10 mg（精確至0.1 mg）于小燒杯中，先用甲醇溶解，然后轉移到10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，獲得濃度均為1 mg/mL CurI、CurII 和CurIII 的標準溶液。在-18 ℃避光保存6 個月。

標準工作溶液的配制：準確移取一定量的標準儲備溶液，用空白基質配成系列標準工作溶液，質量濃度分別為25、62.5、125、250、625、1 250、2 500 ng/mL，冷凍避光保存，有效期1 個月。

1.3 樣品預處理方法

提取樣品：稱取2.5 g 樣品放置到50 mL 的離心管中，向離心管中加10 mL 80%乙腈，在多通道渦旋混勻器上混勻1 min，在超聲波清洗機中超聲20 min后，在離心機上以8 000 r/min 的轉速高速離心5 min后，將離心管中的上清液取出待凈化。

凈化樣品：取待凈化上清液5 mL，直接過Oasis PRiME HLB 固相萃取柱，收集流出液，用10 mL 乙腈進行洗脫，收集所有流出液，50 ℃氮氣流緩慢吹至近干，用10 mL 含0.1%甲酸的乙腈溶液（V乙腈∶V0.1%甲酸=45∶55）定容，渦旋1 min，超聲5 min，過0.22 μm 混合纖維素膜，待上機。

1.4 試驗條件

1.4.1 色譜條件

HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；樣品室溫度：15 ℃；色譜柱溫度：35 ℃；進樣量：2 μL；流速：0.3 mL/min。流動相條件如表1 所示。

表1 洗脫條件

1.4.2 質譜條件

電噴霧離子源；正離子掃描；多反應監測；霧化氣溫度：450 ℃；噴霧電壓：5 500 v；霧化氣壓力：206 843 Pa；輔助氣壓力：206 843 Pa；碰撞氣壓力：55 158 Pa；3 種姜黃素化合物具體質譜參數如表2 所示。

表2 3 種姜黃素MRM 質譜參數

1.5 數據分析

通過Multi Quant 數據處理系統進行采集數據的處理，并采用Origin 進行繪圖及數據分析。

2 結果與討論

2.1 穩定性研究

姜黃素類化合物溶液在不同pH 值溶液中穩定性直接影響提取實驗效果和定量結果的準確性，分別將標準溶液調節pH 值至1、3、5、7、9、11 后，考察3 種姜黃素在不同pH 值下穩定性，實驗結果如圖2 所示。當pH 值＜5 時，3 種姜黃素類化合物含量逐漸升高，當pH 值=5 時，達到最高，pH 值＞5 時，3 種姜黃素類化合物含量迅速降低，當pH 值繼續增大到11 時，CurI和CurII 幾乎看不到色譜峰。結合姜黃素類化合物結構進行推測分析，可能因為結構中含有鄰甲氧基苯酚的鄰位效應，酸性強于苯酚，因此在酸性環境下，3 種化合物的結構比在堿性條件下更穩定。隨著pH 值升高，3 種化合物降解的反應速率符合一級動力學方程，降解速率明顯加快。當溶液pH 值＞9 時，實驗結果顯示姜黃素類化合物的穩定性為CurIII＞CurII＞CurI，通過觀察溶液顏色由黃色變為紅色。根據結構分析可能是因為苯環上含有羥基和甲氧基，其電子密度較高，增加了親電反應發生的概率。但苯環上沒有這些基團后，其給電子的能力降低，電子密度隨之降低，碳鏈上發生親電反應的活性降低，才導致顏色發生轉變。

圖2 pH 值對3 種姜黃素穩定性的影響

2.2 樣品處理條件優化

2.2.1 提取溶劑的優化

姜黃素類化合物的結構中含有酚羥基，微溶于水，易溶于甲醇、乙醇等有機溶劑和酸堿溶液中。酸堿溶液能導致其結構發生變化，因此選擇甲醇、乙醇和乙腈3 種有機溶劑進行提取實驗，由于特殊醫學用途配方乳粉中含對檢測有影響的蛋白質、脂肪等物質，乙腈比甲醇和乙醇提取液更澄清，提取效率高。選擇20%、40%、60%、80%和100%乙腈不同比例進行提取實驗，結果見圖3 所示，隨著乙腈比例增加，3 種化合物的提取效率也逐漸提高，但當達到100%時回收率反而降低，當乙腈比例低于80%時，回收率不高，可能是因為樣品中干擾物因為水相比例過高導致沉淀不完全，干擾測定結果，當乙腈比例為100%時，乙腈的加入可能導致蛋白質立即變性，在樣品表面形成沉淀層，阻止提取劑進入內部，導致目標物無法被完全提取，提取回收率低。因此選擇80%乙腈作為實驗提取溶劑。

圖3 乙腈比例對3 種姜黃素提取效率的影響

2.2.2 凈化方式的選擇

在質譜分析中，特殊醫學用途配方乳粉中蛋白質、脂肪等干擾物可能與目標物在噴霧液滴表面發生離子化競爭，在競爭時能夠增強或減弱離子化效率和強度，干擾檢測結果的準確性，選擇合適的凈化方式除去干擾組分。實驗比較了QuEChERS、C18固相萃取柱、HLB 固相萃取柱和PRiME HLB 固相萃取柱4 種凈化方式，結果如圖4 所示，3 種姜黃素化合物通過PRiME HLB 固相萃取柱回收率最好，其他3 種凈化方式回收率較低，因此樣品凈化選擇PRiME HLB。

圖4 不同凈化方式對3 種姜黃素的影響

2.2.3 洗脫體積的優化

Oasis PRiME HLB 固相萃取柱無需活化、淋洗和洗脫，操作簡便。實驗中發現，若不進行洗脫，柱中還有殘留的姜黃素類化合物，導致回收率偏低。因此實驗選擇1、2、5、8、10、12 mL 乙腈進行洗脫，實驗結果如圖5 所示，隨著洗脫體積增大，洗脫回收率逐漸提高，當達到10 mL 時，回收率到90%以上，能夠將目標物洗脫完全，因此選擇洗脫體積為10 mL。

圖5 洗脫體積對3 種姜黃素的影響

2.2.4 濾膜的選擇

實驗發現不同材質的濾膜對姜黃素類化合物有吸附，考察混合纖維素（MCM）膜、聚四氟乙烯膜（PTFE）、尼龍膜（Nylon）和聚醚砜（PES）膜四種濾膜對姜黃素類化合物的影響，結果如圖6 所示，發現Nylon 膜和PES 膜對CurIII 有很強的吸附，回收率低。聚四氟乙烯膜對CurIII 也有一定吸附作用，可能是因為姜黃素類化合物分子與濾膜表面產生范德華力相互作用，從而使微濾膜對姜黃素類化合物產生了吸附作用。混合纖維素膜對3 種化合物回收率穩定，定量結果準確，過濾效果好，選用混合纖維素膜對樣品處理液進行過濾。

圖6 濾膜對3 種姜黃素化合物的影響

2.3 色譜條件的優化

2.3.1 色譜柱的選擇

通過分子結構分析，CurI、CurII 和CurIII 都屬于非極性化合物，能夠在反相色譜柱上保留。姜黃素有3種同系物，需要選擇適宜的色譜柱進行分離分析，實驗選擇并比較了ACQUITY UPLC HSS T3，ACQUITY UPLC BEH C18，ACQUITY UPLC BEH Shield RP183種類型色譜柱，實驗結果如圖7 所示，姜黃素類化合物在BEH C18和BEH Shield RP18色譜柱上存在拖尾現象，不能準確定量。在HSS T3色譜柱上3 種姜黃素化合物峰形對稱，達到基線分離，能夠準確用于定量。因此實驗選擇ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱作為分離姜黃素類化合物的分析柱。

圖7 3 種姜黃素在不同色譜柱上分離色譜

2.3.2 流動相的優化

姜黃素類分子結構中含有羥基，而且存在共同的共軛苯環結構，能夠吸電子，因此氫氧鍵上的電子偏向氧端，使得氫很容易解離，因此不同的流動相，會影響目標物的色譜分離效果，并造成響應值的變化。實驗比較了乙腈-10 mmol/L 乙酸銨（10 mmol/L AA）、乙腈-10 mmol/L 含0.1%甲酸的乙酸銨（AA contain 0.1%FA）、乙腈-水、乙腈-0.1%氨水溶液（0.1%AH）、乙腈-0.1%甲酸溶液（0.1%FA）5 種不同流動相條件，實驗結果如圖8 所示，當流動相中含有乙酸銨時，峰面積響應降低，可能由于乙酸銨抑制了姜黃素類化合物的離子化所造成的；當流動相為乙腈-0.1%氨水時，化合物保留時間減小，色譜峰分離度低，峰形很差；當流動相為乙腈-水時，色譜峰產生拖尾，加入0.1%甲酸后，色譜峰形得到改善，推測是因為甲酸溶液提供了氫離子，提高了姜黃素類化合物離子化效率。將選擇乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相，用于下一步分析實驗。

圖8 3 種姜黃素在不同流動相中分離色譜

2.4 質譜條件的優化

目標化合物在進入質譜后，形成[M+H]+的準分子離子峰，因此選擇使用正離子電離模式。將50 ng/mL 的姜黃素混合溶液注入質譜儀，在電噴霧正離子模式下同時對3 種化合物做母離子掃描，選擇不產生干擾且其對應的準分子離子峰豐度達到最大時，得到CurI、CurII 和CurIII 母離子質核比分別為369、339 和309；優化相關質譜儀器參數，選擇無干擾且豐度較高的子離子，將離子豐度高的子離子369＞177.2、339＞147.3和309＞147.1 作為定量離子，以豐度相對低的子離子作為輔助定性離子，具體優化結果見表2 所示。

2.5 方法學評價

2.5.1 線性范圍和檢出限

將質量濃度分別為25、62.5、125、250、625、1 250、2 500 ng/mL 的混合基質標準工作液注入UPLCMS/MS，以定量離子的色譜峰峰面積（y）為縱坐標，混合基質標準溶液質量濃度（x）作為橫坐標，繪制得到標準曲線及線性結果，如表3 所示。

2.5.2 回收率和精密度

選用特殊醫學用途配方乳粉空白試樣進行回收率和精密度試驗，添加目標物的質量濃度分別為25、250、1 000 μg/kg 3 個不同水平分別做6 平行進行測定，加標樣品計算結果見表4 所示。可見姜黃素類化合物加標水平在25～1 000 μg/kg 時的回收率在87.9%～102.8%之間，精密度RSD 為1.31%～4.94%。

表4 目標物回收率和精密度（n=6）

3 結 論

本研究使用非選擇性固相萃取前處理凈化技術，從目標物穩定性、提取和凈化不同影響因素分別進行研究，結合高靈敏的超高效液相色譜串聯質譜儀，建立了適合特殊醫學用途配方乳粉中姜黃素類化合物的快速定性定量檢測方法。目前，對特殊醫學用途配方乳粉中姜黃素類化合物含量的測定的相關方法研究較少，本方法采用的是超高效液相色譜-質譜法檢測特殊醫學用途配方乳粉中姜黃素類化合物的含量，同時針對特殊醫學用途配方乳粉蛋白含量高的特點，利用通過式固相萃取法快速凈化樣品提取液，去除蛋白質等干擾組分，并優化了實驗方法。前處理方法簡單快速、靈敏度高、準確性好，能夠在寬質量濃度范圍內準確對特殊醫學用途配方乳粉中姜黃素類化合物進行定性及定量，同時為監管部門提供技術支持和數據積累。