酒杜仲質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究

李靖云 方 磊* 丁 野 羅 艷 孫 輝 裴珂晗

1.湖南省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410001；2.湖南省藥品質(zhì)量評(píng)價(jià)工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410001；3.株洲千金藥業(yè)股份有限公司，湖南 株洲 412000

杜仲始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品[1]。歷代在使用本品時(shí)均強(qiáng)調(diào)炮制后入藥。宋代以前多以切制生用為主，宋代以后多采用加輔料炮炙的方法，有姜汁炒、鹽水炒、酒炒、糯米炒、蜜炙等，其炮制程度各不相同，但去絲或斷絲是一致的。酒炙始載于宋《全生指迷方》“去粗皮，搗爛，酒拌，炒乾”。此后，宋代的《女科百問(wèn)》《濟(jì)生方》及金元3部、明代6部、清代11部醫(yī)藥文獻(xiàn)中有記載，方法基本為“酒浸，炒斷絲”。

目前，《中國(guó)藥典》2020版一部收載了中藥材和飲片的杜仲及鹽杜仲，但未收載酒杜仲[2]。同時(shí)，相應(yīng)的部頒標(biāo)準(zhǔn)和各省中藥飲片炮制規(guī)范也均未收載該品種。酒杜仲質(zhì)量控制缺乏有效鑒別手段和必要的檢查項(xiàng)目，對(duì)酒杜仲的藥材質(zhì)量難以保障，影響用藥安全和臨床療效。

本研究通過(guò)收集湖南省內(nèi)4家飲片生產(chǎn)企業(yè)的13批酒杜仲樣品及其炮制方法，照《中國(guó)藥典》2020版一部“杜仲”的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以外觀性狀、顯微鑒別、水分、總灰分、浸出物及含量測(cè)定作為酒杜仲的質(zhì)量控制指標(biāo)，建立酒杜仲的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，保障其用藥安全，為中藥飲片市場(chǎng)監(jiān)管提供技術(shù)支持。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Nikon50i(日本尼康株式會(huì)社)；Waters e2695高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)，色譜柱為 Capcell Pak-ADME C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；METTLER AE240型電子分析天平(瑞士梅特勒公司)；METTLER TOLEDO XSE 205DU(瑞士梅特勒公司)；BINDERFP115型強(qiáng)制對(duì)流干燥箱(德國(guó)BINDER GmbH)。

1.2 試劑 甲醇(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，甲醇(色譜純，霍尼韋爾貿(mào)易有限公司)，水為超純水；對(duì)照品：松脂醇二葡萄糖苷(批號(hào)：111537-201706；純度：91.7%，供含量測(cè)定用)由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。

實(shí)驗(yàn)所需的酒杜仲由湖南4家生產(chǎn)企業(yè)提供，及2批杜仲藥材。樣品詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表1 樣品信息表

表2 酒杜仲對(duì)應(yīng)藥材信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀 按《中國(guó)藥典》2020年四部通則0212藥材和飲片檢定通則項(xiàng)下藥材的性狀觀察方法。對(duì)4家生產(chǎn)企業(yè)的13批酒杜仲進(jìn)行觀察，將其【性狀】擬定為“本品呈小方塊狀。外表面淡棕色或灰褐色，稍光滑，有的樹(shù)皮較薄，未去粗皮，可見(jiàn)明顯的皮孔。內(nèi)表面棕褐色或黑褐色，光滑。質(zhì)脆，易折斷，折斷時(shí)膠絲彈性較差。略有酒香氣，久置后氣微，味稍苦?！睂?shí)物如圖1所示，具體性狀特征點(diǎn)見(jiàn)表3。

A.企業(yè)A；B.企業(yè)B；C.企業(yè)C；D.企業(yè)D圖1 酒杜仲性狀圖

表3 酒杜仲性狀特征點(diǎn)

2.2 顯微鑒別 按《中國(guó)藥典》2020年四部通則2001顯微鑒別法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果13批次樣品均能觀察到木栓細(xì)胞、石細(xì)胞、橡膠絲等杜仲的顯微特征(如圖2所示)。擬定酒杜仲的顯微鑒別為“本品粉末棕色。橡膠絲成條或扭曲成團(tuán)，表面顯顆粒性。石細(xì)胞甚多，大多成群，類(lèi)長(zhǎng)方形、類(lèi)圓形、長(zhǎng)條形或形狀不規(guī)則，長(zhǎng)約至 180 μm，直徑 20～80 μm，壁厚，有的胞腔內(nèi)含橡膠團(tuán)塊。木栓細(xì)胞表面觀多角形，直徑 15～40 μm，壁不均勻增厚，木化，有細(xì)小紋孔，側(cè)面觀長(zhǎng)方形，壁三面增厚，一面薄，孔溝明顯”。顯微圖如圖2所示。

圖2 酒杜仲的顯微鑒別圖

2.3 檢查

2.3.1 水分 按《中國(guó)藥典》2020年版四部通則0832水分測(cè)定法第二法烘干法進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定13批酒杜仲的水分，最低值為2.29%，最高值為8.95%，平均值為4.54%。結(jié)果見(jiàn)表4。

2.3.2 總灰分 按《中國(guó)藥典》2020年版四部通則2302灰分測(cè)定法，測(cè)定13批酒杜仲的總灰分，最低值為4.66%，最高值為6.17%，平均值為5.58%。同時(shí)測(cè)定2批藥材中的總灰分，計(jì)算相應(yīng)酒杜仲飲片的總灰分轉(zhuǎn)移率。結(jié)果見(jiàn)表5，兩個(gè)生產(chǎn)企業(yè)7批次樣品的平均轉(zhuǎn)移率為120.29%。

表4 檢查和浸出物測(cè)定結(jié)果

表5 酒杜仲對(duì)應(yīng)藥材總灰分結(jié)果

2.4 浸出物 按《中國(guó)藥典》2020年版四部通則2201浸出物測(cè)定法水溶性浸出物熱浸法進(jìn)行測(cè)定。13批酒杜仲的浸出物，最低值為14.38%，最高值為17.29%，平均值為15.67%。測(cè)定2批藥材中的水溶性浸出物，計(jì)算相應(yīng)酒杜仲飲片的浸出物轉(zhuǎn)移率。結(jié)果見(jiàn)表6，兩個(gè)企業(yè)7批次樣品的平均轉(zhuǎn)移率為90.43%。

表6 酒杜仲對(duì)應(yīng)藥材浸出物結(jié)果

2.5 含量測(cè)定

2.5.1 色譜條件 色譜柱為 Capcell Pak-ADME C18(250 mm×4.6 mm，5μm)；流動(dòng)相：甲醇-水(25∶75)；檢測(cè)波長(zhǎng)：277 nm；流速1.0 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.5.2 溶液的制備 對(duì)照品溶液：精密稱(chēng)取松脂醇二葡萄糖苷對(duì)照品13.13 mg，精密稱(chēng)定，置25 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液①(0.4816 mg/mL)。精密稱(chēng)取松脂醇二葡萄糖苷對(duì)照品9.08 mg，精密稱(chēng)定，置10 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品儲(chǔ)備液②(0.8326 mg/mL)。精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液，加甲醇依次稀釋成濃度為0.1665 mg/mL、0.0333 mg/mL的對(duì)照品溶液。精密稱(chēng)取松脂醇二葡萄糖苷對(duì)照品5.90 mg，精密稱(chēng)定，置10 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品液③(0.5410 mg/mL)。供試品溶液：取本品，剪成碎片，揉成絮狀，取約2 g，精密稱(chēng)定，置索氏提取器中，加入三氯甲烷適量，加熱回流6 h，棄去三氯甲烷液，藥渣揮去三氯甲烷，再置索氏提取器中，加入甲醇適量，加熱回流6 h，提取液回收甲醇至適量，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。對(duì)照品溶液和供試品溶液色譜圖如圖3所示。

圖3 對(duì)照品、供試品溶液色譜圖重疊圖

2.5.3 線性關(guān)系 分別精密吸取濃度為0.8326 mg/mL、0.1665 mg/mL、0.0333 mg/mL的對(duì)照品溶液5 μL、10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為(ng)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其回歸方程為：y=516.63X+8547.8，R2=1。結(jié)果表明：松脂醇二葡萄糖苷對(duì)照品在166.53～8326.36 ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。如圖4所示。

2.5.4 精密度試驗(yàn) 取同一份酒杜仲供試品溶液(批號(hào)19090305-1)，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10μL，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算RSD(n=6)為0.63%，表明儀器精密度良好。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份酒杜仲供試品溶液(批號(hào)19090305-1)，分別于配制后的0 h、3.5 h、9.5 h、13.5 h、25 h，精密吸取10μL，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果RSD為1.93%，表明供試品在25 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批酒杜仲供試品溶液(批號(hào)19090305-1)，依“2.5.2”項(xiàng)下方法制成6份供試品溶液，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果供試品RSD%為3.69，表明重現(xiàn)性良好。

2.5.7 回收率試驗(yàn) 取同一批次酒杜仲供試品溶液(批號(hào)19090305-1)，約1.0 g(6份)，精密稱(chēng)定，精密加入松脂醇二葡萄糖苷對(duì)照品溶液①適量，依“2.5.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算，結(jié)果平均加樣回收率為96.75%。結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.5.8 樣品含量測(cè)定 對(duì)13批酒杜仲依“2.5.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 樣品含量測(cè)定結(jié)果 (n=13)

3 討論

性狀和顯微特征是中藥材鑒定的傳統(tǒng)方法，是檢驗(yàn)中藥材和飲片來(lái)源的正確性的重要手段[3]。性狀項(xiàng)主要描述藥材的形狀、大小、表面(色澤、特征)、質(zhì)地、斷面、氣味等特征[4]。酒杜仲在炮制后內(nèi)表面顏色較炮制前變深，橡膠絲彈性較差，出現(xiàn)斷絲。顯微鑒別對(duì)于性狀特征不明顯、易混中藥材和飲片，對(duì)其真?zhèn)蔚呐袛嗥鸬街匾饔?。酒杜仲的顯微特征與杜仲的顯微特征相比，并未因炮制出現(xiàn)明顯改變。

中藥中含水量與霉變、蟲(chóng)害、潮解、軟化、質(zhì)變等都有關(guān)[5-6]，總灰分與加工、運(yùn)輸、儲(chǔ)存中藥是否收到污染或摻雜有關(guān)，浸出物對(duì)于藥材的活性成分或指標(biāo)性成分不清或含量很低或尚無(wú)精確的定量方法時(shí)，可作為衡量指標(biāo)[7]，因此，對(duì)于經(jīng)過(guò)炮制的酒杜仲，分別對(duì)以上指標(biāo)進(jìn)行考察，并建議列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)于浸出物的考察，雖然《中國(guó)藥典》2020年版一部杜仲浸出物為醇溶性浸出物，但是考慮酒杜仲入藥多為湯劑，所以，采用水溶性浸出物進(jìn)行考察更具有參考意義。

杜仲中含有環(huán)烯醚萜類(lèi)成分京尼平苷酸、京尼平苷，苯丙素類(lèi)成分綠原酸，和木質(zhì)素類(lèi)化合物松脂醇二葡萄糖苷。經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)，《中國(guó)藥典》2020年版一部杜仲及鹽杜仲項(xiàng)下，以及《香港中藥材標(biāo)準(zhǔn)》《歐洲藥典》《英國(guó)藥典》收錄的杜仲的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)均選擇松脂醇二葡萄糖苷為指標(biāo)性成分，采用高效液相色譜法(HPLC)進(jìn)行含量測(cè)定[8]，同時(shí)，相對(duì)于京尼平苷酸、京尼平苷和綠原酸，松脂醇二葡萄糖苷含量相對(duì)較穩(wěn)定，也更具有特征性[9]，因此，酒杜仲也選擇了松脂醇二葡萄糖苷作為含量測(cè)定指標(biāo)成分。

在含量測(cè)定研究時(shí)，由于酒杜仲呈堅(jiān)硬的小方塊狀，保留了其樹(shù)皮的特征，因此，需要將其剪碎，揉成絮狀，以便于充分提取指標(biāo)成分。酒杜仲中含有較多脂溶性雜質(zhì)，易對(duì)檢測(cè)產(chǎn)生干擾，采用三氯甲烷提取并棄去提取液的方式可以排除干擾。對(duì)比超聲、回流及索氏提取3種方法，發(fā)現(xiàn)索氏提取的結(jié)果較超聲和回流更穩(wěn)定，并且易于完全提取，因此，選擇索氏提取作為最終的提取方法。

綜上所述，通過(guò)對(duì)酒杜仲性狀、顯微特征、水分、總灰分和浸出物等檢查項(xiàng)及松脂醇二葡萄糖苷含量測(cè)定方法的研究，建立了酒杜仲的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，可為該炮制藥材的質(zhì)量控制提供依據(jù)。