牛樟芝的質量標準研究

邱 理 李 華 陸 佳 吳躍麗 張愷東 黎嘉茗

廣東省藥品檢驗所，廣東 廣州 510663

牛樟芝(Antrodiacinnamomea)最早發現于我國臺灣，是當地特有的珍稀藥用菌品種，屬擔子菌門(Basidiomycota)、多孔菌目 (Polyporales)、白肉迷孔菌科(Fomitopsidaceae)、薄孔菌屬(Antrodia)，野生牛樟芝子實體生長在腐爛空心的牛樟樹(Cinnamomumkanehirai)內壁[1]。牛樟芝具有多種藥理作用，如抗腫瘤、抗炎、抗氧化、免疫調節及保肝等作用，也可用于治療食物和藥物中毒、腹瀉、腹痛、高血壓和皮膚瘙癢等[2-3]。目前牛樟芝未有較完善的質量標準，為了更好地控制牛樟芝藥材的質量，本研究制定了牛樟芝的質量標準，現報道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器 SARTORIUS CP225S萬分之一電子天平；CARBOLITE馬弗爐；BINDER恒溫干燥箱；ZEISS Scope.A1顯微鏡；CAMAG TLC VISUALIZER薄層成像儀；Eppendorf 5417R離心機；ABI 9700 PCR儀；DYY-8C電泳儀(北京六一儀器廠)；DK-24水浴鍋(上海精宏實驗設備有限公司)；ABI3730XL測序儀。

1.2 材料 BGI2xSuper PCR Mix(with dye)(北京六合華大基因科技有限公司)；BGI D2000 Plus DNA Ladder(北京六合華大基因科技有限公司)；細菌基因組提取試劑盒(天根生化科技有限公司)；磁珠法細菌和真菌基因組提取試劑盒(武漢納磁生物科技有限公司)；碩美PCR產物磁珠法純化試劑盒。丙三醇(批號：20220201)；三氯乙醛，水合物(批號：C11916119)、瓊脂糖試劑均為分析純；水為純化水。丙三醇、購自廣州化學試劑廠，三氯乙醛，水合物購自Merck公司，瓊脂糖購于廈門太陽馬生物工程有限公司。

牛樟芝藥材樣品15批，經廣東省藥品檢驗所李華主任中藥師鑒定，均為牛樟芝Antrodiacinnamomea的干燥品。樣品信息見表7。

2 方法與結果

2.1 外觀性狀 按樣品實際情況進行描述，本品性狀如下：本品外形為不規則板狀，外徑5～10 cm不等，厚度3～10 mm，表面具不規則隆起，正面淡黃褐色至紅褐色，隆起處色深，背面淺米黃色至棕褐色。具牛樟芝特有濃郁香味。如圖1(為20210204批次樣品)。

圖1 牛樟芝藥材圖

2.2 顯微鑒別 本品粉末淺黃色、黃色、淺棕色至棕褐色；菌絲散在或粘結成團，細長，透明，直徑1.8～3.6 μm。牛樟芝粉末顯微特征如圖2、圖3所示。

圖2 牛樟芝粉末圖

圖3 牛樟芝粉末顯微特征圖(顯微攝影放大倍數：10×40)

2.3 基因序列鑒定 牛樟芝基因序列的鑒定按照中國科學院微生物研究所鑒定方法，根據NCBI中已確認牛樟芝菌的線粒體基因組，通過BLAST比對結合PCR方法確認種屬。要求相似度達到99%。

2.3.1 基因組DNA提取 取2 mL離心管，加入200 μL預處理液和三顆玻璃珠，然后加入適量菌樣品，放入研磨儀中研磨至充分。加入20 μL Proteinase K溶液，混勻，37 ℃放置30～60 min。加入200 μL裂解液，充分顛倒混勻，70 ℃放置10 min。加200 μL無水乙醇，充分顛倒混勻，短離心以去除管蓋內壁液滴。過吸附柱，洗滌液洗1次，漂洗液洗2次。吸附柱室溫放置5～10 min，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。將吸附轉入一個新離心管，向吸附膜中間位置懸空滴加50～100 μL ddH2O，室溫放置5～10 min，12000 rpm離心 2 min，將溶液收集到離心管中。按照試劑盒說明書分裝樣品板、磁珠板、洗滌板、洗脫板，并放置提取儀對應工位，運行細菌提取程序至結束。詳見表1。

表1 引物信息表(16S/18S擴增)

表2 PCR擴增反應體系和條件

2.3.2 PCR產物檢測及純化 3 μL PCR產物進行1.0%的瓊脂糖凝膠檢測，觀察條帶性狀。PCR產物純化按照磁珠純化標準操作流程操作，利用磁珠能夠吸附或者釋放帶電荷物質的原理，在高鹽低pH溶液吸附DNA，在低鹽高pH溶液釋放DNA，從而達到分離提純DNA產物的目的。

將純化后的PCR產物進行上機檢測。將純化后的PCR產物進行上機檢測。

標準基因序列為：

CTGCGGAAGGATCATTATTGTATTTGAAAGGG

GTTGTAGCTGACCTCCTCTTGAAAAGGG 60

GGGAGGTATGTGCACACCTCTGTTCATTCATAT

TCTCTCACACCTGTGCATGCTTTGTAG 120

GTTGGTTTTGAATGGTTGTCTTCTCTGATGGAG

ACAGCTGTTTTGACCTTCCTATGTTTT 180

TTAAATTGACTCCGTATCAGTTACAGAATGTAT

GTTGCGTGTAACGCATATTGTATAACT 240

TTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGAT

GAAGAACACGGCGAAATGTGATAAGTA 300

ATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATTGAA

TCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGT 360

ATTCTGAGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGG

AATTATCAACCCTTTTGACTTTTTGTT 420

GAATGGGCTTGGATTTGGAGGGTTAAATTGCT

GGCTCttttttttGATTCAGCTCCTCTT 480

GAATGCATTAGCTTGAACCCTTGTGGATTGACC

TTATCGGTGTGATAGTCATCTATGCCG 540

TGGTTGTCTGAGGTGGGATCGGCTTCTAATGGT

GCAAGTCCCTTCAGGGGGATGATTTTC 600

TAATGACCTTCTGACCTCAAATCAGGTAGGAC

TACCC 637

2.3.3 結果 經檢驗三批樣品根據比對結果，輸入序列與參考序列相似度均為99%，與標準相符，均符合規定。瓊脂糖凝膠電泳圖如圖4，電泳孔位對應樣品和引物見表3，比對結果見表4～6。

表3 電泳孔位對應樣品和引物

表4 20210204比對結果

表5 20210301比對結果

表6 20210302比對結果

注：M從上到下依次為5000、3000、2000、1000、750、500、250、100 bp

2.4 水分 按水分測定法(中國藥典2020版四部通則0832 第二法)[4]測定。實測樣品15批，結果為10.9%～15.1%，平均值為13.0%。測定結果見表1。

2.5 總灰分 按總灰分測定法(中國藥典2020版四部通則2302)[4]測定。實測樣品15批，結果為2.9%～3.4%，平均值為3.1%。測定結果見表1。

2.6 黃曲霉毒素 按黃曲霉毒素測定法(《中國藥典》四部通則2351)[4]測定。實測樣品15批，結果為未檢出。牛樟芝黃曲霉毒素圖譜如圖5，測定結果見表1。

圖5 牛樟芝黃曲霉毒素圖譜

2.7 浸出物 以水和乙醇為溶劑，按照浸出物項下冷浸法(中國藥典2020年版四部通則2201和《中國藥品檢驗標準操作規范》2019年版 浸出物測定法)[4-5]測定樣品3的浸出物，測得浸出物含量為39.2%、20.6%；以水、稀乙醇、乙醇為溶劑，分別按水溶性浸出物和醇溶性浸出物項下熱浸法(中國藥典2020年版四部通則2201)[4]測定樣品3的浸出物，結果分別為36.4%、34.3%、25.1%，可得知以水為溶劑、冷浸法測定結果最高，故選定以水為溶劑的冷浸法，再測定15批樣品的浸出物含量，浸出物測定結果35.8%～43.5%，平均值為40.4%。測定結果見表7。

表7 牛樟芝樣品信息及其水分、總灰分、黃曲霉毒素和浸出物的測定結果

3 討論

根據測定結果，15批牛樟芝樣品，水分平均值為13.0%，參考中國藥典2020年版四部0212藥材和飲片檢定通則，以水分測定結果平均值的120%設限，暫定本品水分不得過15.6%。以總灰分測定結果平均值的120%設限，暫定本品總灰分不得過3.7%。由于牛樟芝使用培養基培育，酸不溶性灰分做出數據較低，建議酸不溶性灰分暫不收載于標準內。15批樣品的浸出物含量平均值為40.4%，以平均值80%設限，暫定本品照水溶性浸出物測定法(中國藥典2020年版四部通則2201)[4]項下的冷浸法測定，用水作溶劑，不得少于32.3%。

牛樟芝顯微鑒別中發現有結晶，可能由于牛樟芝在栽培的過程中整個傘面覆蓋于培養基上所造成，菌絲顯微特征較多。

野生牛樟芝在歸經的屬性依臺灣民間用藥的習性以治療肝臟相關疾病為主，加上近十多年來于腫瘤治療的論證，牛樟芝三萜類化合物在抗腫瘤活性調節中扮演著重要角色，其具有抑制肝癌細胞的增殖、毒殺老鼠血癌細胞活性、抗血清素活性、活化神經細胞生長能力等功能[6]。牛樟芝作為現在較熱門的食用性中藥材，功效還需繼續深入地研究。

綜上，研究對性狀、顯微鑒別、基因序列鑒定、水分、總灰分、黃曲霉毒素和浸出物等進行檢驗，建立的質量標準，能更好地控制牛樟芝藥材的質量，對牛樟芝更深入地研究打下夯實的基礎。