三黃膏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升研究

王寶才 李俊江* 李榮焜 楊小源 徐志偉

1.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000

三黃膏(備案號：甘藥制備字Z20190333000)由黃連、黃柏、黃芩及冰片組成，具有清熱止痛、去腐生肌之功效，用于痔瘺、肌肉腐爛等癥。該制劑在甘肅省中醫(yī)院臨床應(yīng)用多年，目前在甘肅全省醫(yī)療機(jī)構(gòu)調(diào)劑使用。由于該制劑注冊時間較早，原制備工藝采用全方打粉入藥，由于藥材自身纖維性極強(qiáng)，即使采用超微粉碎亦難以保證藥粉粒度不大于180 μm，從而導(dǎo)致軟膏粒度檢查難以符合現(xiàn)行藥典標(biāo)準(zhǔn)，由此產(chǎn)生了藥品質(zhì)量風(fēng)險。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅對小檗堿進(jìn)行了薄層鑒別且無含量測定項目，無法有效控制產(chǎn)品的質(zhì)量。本研究采用黃連、黃柏、黃芩提取物制備軟膏，從根本上解決了粒度檢查超限的問題；建立了黃連的薄層色譜鑒別方法，建立了小檗堿、表小檗堿、黃連堿、巴馬汀的含量測定方法并規(guī)定了4個生物堿總含量限度。提升三黃膏的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對于臨床用藥的安全、有效具有重要意義。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 PerkinElmerA-10型高效液相色譜儀(美國PerkinElmer公司)；普利賽斯LX120A電子天平(0.0001 g)、普利賽斯EP125SM電子天平(0.01 mg)(普利賽斯國際貿(mào)易有限公司)；DHG-9145A電熱鼓風(fēng)干燥烘箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；SB-5200DTS雙頻超聲波清洗機(jī)(寧波新芒生物科技股份有限公司)；HWS-26電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試藥 黃連(批號：201102)購自安徽省神草堂國藥有限公司；黃柏(批號：210626)購自康樂藥業(yè)有限責(zé)任公司；黃芩(批號：210801)購自甘肅冠蘭中藥飲片有限責(zé)任公司；冰片(批號：201201)購自江蘇同濟(jì)中藥飲片有限公司，經(jīng)甘肅省中醫(yī)院李俊江主任中藥師鑒定符合《中國藥典》2020年版黃連、黃柏、黃芩、冰片藥材項下有關(guān)規(guī)定。鹽酸小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、黃芩苷的對照品及黃連、黃芩對照藥材(批號分別為110713-201814、112026-201802、110732-201913、110715-201318、120913-201611、120955-201309)均購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈為色譜純，水為超純水，乙醇、甲醇、鹽酸、磷酸二氫鉀、十二烷基硫酸鈉、磷酸均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 三黃膏的制備 黃連與黃柏加11倍量水煎煮2次，每次煎煮95 min，收集濾液；黃芩煎煮2次，第1次加12倍量水，2次加10倍量水，每次煎煮2 h，收集濾液[1]。將上述濾液合并，濃縮至飲片∶濃縮液=1∶2～1∶2.5(重量比)，濃縮液在70 ℃干燥16 h，所得干浸膏粉碎過120目篩，備用。冰片粉碎過100目篩，上述浸膏粉、冰片粉與適量白凡士林混勻，即得。共制備3批三黃膏樣品(批號分別為220901、220902、220903)。

2.2 性狀 取“2.1”項下制備的三黃膏適量，直接觀察，本品為黃色至棕黃色的軟膏，有冰片香氣。

2.3 粒度檢查 取3批“2.1”項下制備的三黃膏，按照2020年版《中國藥典》(四部)通則0109軟膏劑乳膏劑項下方法檢查粒度[2]。結(jié)果顯示，3批三黃膏的的粒度均符合規(guī)定即未檢出大于180 μm的粒子。

2.4 黃連的薄層色譜鑒別 取鹽酸小檗堿對照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的對照品溶液；取鹽酸小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀對照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度均為0.5 mg/mL的混合對照品溶液。取黃連對照藥材1 g，加70%乙醇20 mL，超聲(功率200 W，頻率40 kHz)處理30 min，濾過，濾液蒸干，加甲醇5 mL溶解殘渣，過濾，取濾液作為對照藥材溶液。取三黃膏 1 g(加熱熔融)，按上述對照藥材溶液的制備方法操作，制備供試品溶液。按處方制法，制備缺黃連陰性樣品，缺黃連、黃柏陰性樣品，按上述對照藥材溶液的制備方法操作，制備陰性樣品溶液。吸取上述6種溶液各1 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水-三乙胺(6∶7∶2∶3∶1∶2)為展開劑，置用濃氨試液預(yù)飽和20 min的展開缸內(nèi)，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品、對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)[3]；缺黃連、黃柏陰性樣品無干擾，缺黃連陰性樣品有一個熒光斑點(diǎn)是黃柏含的小檗堿。薄層色譜圖如圖1所示。

1：鹽酸小檗堿對照品溶液；2：混合對照品溶液；3：黃連對照藥材；4～6：供試品溶液；7：缺黃連陰性樣品溶液；8：缺黃連、黃柏陰性樣品溶液

2.5 小檗堿、表小檗堿、黃連堿、巴馬汀的含量測定

2.5.1 鹽酸小檗堿對照品溶液的制備 精密稱取鹽酸小檗堿2.60 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得104 μg/mL鹽酸小檗堿對照品溶液。

2.5.2 色譜條件 色譜柱為Kromasil 100-5-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(50∶50)(每100 mL中加十二烷基硫酸鈉0.4 g與磷酸0.4 mL)為流動相，流速為1.0 mL/min，檢測波長為345 nm，柱溫為 25 ℃，進(jìn)樣量為10 μL[3]。

2.5.3 供試品溶液制備 精密稱取1 g三黃膏，加熱熔融后加入70%乙醇20 mL，超聲(功率200 W，頻率40 kHz)處理20 min，過濾，殘渣同法再處理1次，合并2次濾液，水浴蒸干，殘渣加入甲醇-鹽酸(100∶1)的混合溶液溶解，并轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中定容，再精密量取2 mL置10 mL量瓶中，用甲醇-鹽酸(50∶1)的混合溶液定容，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.5.4 缺黃連陰性樣品溶液的制備 按照處方制法，制備缺黃連陰性樣品，精密稱取1 g，按照“2.6.3”項下方法制備，即得。

2.5.5 專屬性考察 取鹽酸小檗堿對照品溶液、供試品溶液、缺黃連陰性樣品溶液各10 μL，按“2.6.2”項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，表小檗堿、黃連堿、巴馬汀、小檗堿與其它組分能夠達(dá)到基線分離，4個成分與鹽酸小檗堿的相對保留時間均符合藥典要求，且陰性樣品對表小檗堿、黃連堿、巴馬汀的認(rèn)定無干擾，表明該方法專屬性良好。高效液相色譜圖如圖2所示。

A

2.5.6 線性關(guān)系考察 取“2.6.1”項下對照品溶液分別自動進(jìn)樣1 μL、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL，再按“2.6.2”項下色譜條件進(jìn)行分析，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)(y)，對照品含量(μg，x)為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析。標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=3310622.70x+47359.64(r2=0.9998)，線性范圍0.104～2.08 μg。

2.5.7 精密度試驗 取“2.6.1”項下對照品溶液按“2.6.2”項下色譜條件進(jìn)行分析，記錄峰面積。結(jié)果表明，RSD=1.01%(n=5)，該儀器精密度良好。

2.5.8 重復(fù)性試驗 取同一批三黃膏，按“2.6.3”項下方法平行制備5份供試品溶液，按“2.6.2”項下色譜條件進(jìn)行分析，記錄峰面積，計算小檗堿含量。結(jié)果顯示，三黃膏中小檗堿平均含量為2.76 mg/g，RSD=1.73%(n=5)，該方法重復(fù)性良好。

2.5.9 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液，按“2.6.2” 項下色譜條件分別在0 h、6 h、12 h、18 h、24 h進(jìn)樣分析，記錄峰面積。結(jié)果顯示，RSD=1.54%(n=5)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好[4]。

2.5.10 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的三黃膏 (小檗堿2.76 mg/g)0.5 g，共 9份。取3份分別加入 1.37 mL鹽酸小檗堿對照品溶液 (鹽酸小檗堿對照品溶液濃度為0.8085 mg/mL，下同)；另取3份分別加入1.71 mL鹽酸小檗堿對照品溶液；剩余3份分別加入2.05 mL鹽酸小檗堿對照品溶液。上述9份樣品均按“2.6.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.6.2”項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，并計算加樣回收率[4]。結(jié)果見表1。

表1 鹽酸小檗堿的加樣回收率試驗結(jié)果 (n=9)

2.5.11 含量測定及限度確定 取3批三黃膏，按“2.6.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.6.2”項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計算4個生物堿的含量。3批三黃膏中4種生物堿平均總含量為4.01 mg/g(RSD=2.04%，n=3)，結(jié)果見表2。暫定本制劑含4種生物堿不得少于3.21 mg/g(生產(chǎn)損耗按20%計[5])。

表2 3批三黃膏中4種生物堿含量 (n=3，mg)

3 討論

三黃膏性狀檢查中氣味的描述，可以對處方中的冰片做出定性鑒別；通過薄層色譜法，可以對處方中黃連進(jìn)行定性鑒別；通過高效液相色譜法對小檗堿、表小檗堿、黃連堿、巴馬汀的含量進(jìn)行了測定，并根據(jù)實際大生產(chǎn)中人員熟練程度、原料差異、設(shè)備型號、制備工藝穩(wěn)定性等影響因素對4種生物堿的總含量限度進(jìn)行了規(guī)定。通過上述研究，三黃膏的質(zhì)量控制水平較以往有了很大提升。筆者在預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn)，三黃膏中黃柏、黃芩藥材的薄層色譜鑒別受到其他藥材和輔料的干擾，故暫未將黃柏的薄層色譜納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，后續(xù)將深入研究該藥材的薄層鑒別方法。《中國藥典》黃連項下含量測定中流動相需要用磷酸調(diào)節(jié)pH值為4.0，筆者在實踐中發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)pH值的操作較為繁瑣，在多次嘗試后發(fā)現(xiàn)每100 mL流動相中加入0.4 mL磷酸，4個生物堿的分離效果良好。此外，筆者發(fā)現(xiàn)不同廠家生產(chǎn)的十二烷基硫酸鈉在流動相中的溶解性能不同，若其未能完全溶解，則對生物堿的分離與測定產(chǎn)生不良影響。

黃連作為三黃膏處方中的君藥，對其含量進(jìn)行質(zhì)量控制具有重要的意義。黃連中所含化學(xué)成分復(fù)雜，有生物堿類、黃酮類、木質(zhì)素類、多糖類、甾醇類、揮發(fā)油類及酸性物質(zhì)等[6]，選擇適宜的成分作為質(zhì)控指標(biāo)尤為重要。按照中藥質(zhì)量標(biāo)志物(Q-Marker)的定義與基本條件[7]，基于黃連傳統(tǒng)功效、藥性、化學(xué)成分有效性與可測性、所處的配伍環(huán)境的Q-marker預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，異喹啉類生物堿具有抗炎、抗菌、抗氧化等作用[8]，這與三黃膏處方的功能主治有緊密聯(lián)系，其可以作為該研究中黃連的質(zhì)量標(biāo)志物。故選擇黃連中4個生物堿的含量作為質(zhì)量控制的指標(biāo)[9]。