HPLC 法同時測定余甘子果核中6種鞣質類成分的含量

張利軍 龍小妹 李 蓉 夏宗霄 郭 爽 古建興 劉海鵬 范 源

1.云南中醫藥大學，云南 昆明 650500；2.云南中醫藥大學第二附屬醫院，云南 昆明 65004；3.云南中醫藥大學第一附屬醫院，云南 昆明 650021

余甘子(PhyllanthusemblicaL.)為大戟科葉下珠屬植物，別名喉甘子、庵羅果、牛甘果等，廣泛分布于我國西南等地區，其果實入口微澀，回味甘甜，故名余甘[1-3]。其果實肉質豐滿，呈扁圓形，有深棱紋，果皮黃綠色，酸甜微澀，回味良久，具有較高的營養價值，可鮮食、加工以及藥用[4]。余甘子味甘、酸、澀、涼，歸肺、胃經[5]，其主要的化學成分包括酚酸類、黃酮類、萜類等[6]，其中酚酸類物質可以有效抑制急慢性炎癥[7-8]。研究[9]表明，余甘子果實中含有沒食子酸、鞣花酸、柯里拉京、訶黎勒酸等豐富的多酚化合物。現代藥理研究[10-13]證實，余甘子多酚有抗氧化、抗菌、抗疲勞、護肝益腎、免疫調節、降血糖、抗癌、抗病毒等作用。

余甘子的研究主要集中在對余甘子果實及葉中總黃酮、多酚等物質的提取[14-15]，如鄭玉忠等[16]采用HPLC法測定余甘子果實中沒食子酸和鞣花酸的含量分析，于濤等[17]采用HPLC法測定余甘子果實中總酚類含量，關于余甘子果核有效成分的含量測定卻鮮有報道。余甘子果核占干果質量的40%左右，在臨床應用中并未嚴格區分余甘子果肉和果核，2020年版《中國藥典》也僅收載了余甘子成熟干燥果實，并未對其果肉和果核有所規定[17]。為了更好地開發和完善余甘子植物的綜合利用，使廢棄的余甘子果核得到充分利用，減少資源浪費，因此，本試驗以沒食子酸、柯里拉京、GCG、訶黎勒酸、PGG、鞣花酸6種鞣質類成分為指標，旨在建立 HPLC 同時測定余甘子果核中6個成分含量的方法，為更好地評價余甘子質量提供簡單可靠、快速、準確的檢測方法，同時為進一步完善其質量標準提供一定的理論基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1200高效液相色譜儀 (美國Agilent 公司)，色譜柱為 Agilent Zorbax C18鍵合硅膠柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；超聲波清洗機(深圳市即潔超聲科技有限公司)；DFY-600 搖擺式高速萬能粉碎機(永康式速鋒工貿有限公司)；T-1000 型電子天平(上海浦春計量儀器有限公司)；AB265-SMET-TLER TOLEDO十萬分之一分析天平(Mettler-tolido國際貿易(上海)有限公司)。

1.2 材料 沒食子酸(批號：wkq16081904；純度：98%；四川省維克奇生物科技有限公司)、柯里拉京(批號：MUST-21110216；純度：99.55%；成都曼斯特生物科技有限公司)、GCG(批號：wkq20051403；純度：98%；四川省維克奇生物科技有限公司)、訶黎勒酸(批號：wkq22042804；純度：98%；四川省維克奇生物科技有限公司)、PGG(批號：PRF21060701；純度：98%；成都普瑞法科技開發有限公司)、鞣花酸(批號：PRF10061143；純度：98%；成都普瑞法科技開發有限公司)；甲醇為色譜純，其余試劑為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Zorbax C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脫(0～6 min，5%～7% A；6～15 min，7%～25% A；15～30 min，25%～27% A；50～65 min，45%～65% A；65～66 min，65%～5% A)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：270 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL。理論塔板數按兒茶素計算應不低于3000。色譜圖如圖1所示。

A.混合對照品；B.供試品；C.空白試劑；1.沒食子酸；2.柯里拉京；3.GCG；4.訶黎勒酸；5.PGG；6.鞣花酸

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液制備 取沒食子酸、柯里拉京、GCG、訶黎勒酸、PGG和鞣花酸對照品適量，精密稱定，分別加甲醇制成一定質量濃度的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取鮮品的余甘子果核粉末2.0 g，精密加 50 mL 的甲醇，超聲(40 kHz，240 W)60 min，冷卻后用甲醇補足減失質量，濾過，濾液揮干后用甲醇定容至 10 mL。

2.2.3 空白溶劑 因最終定容時所用的溶劑為甲醇，故本研究中以甲醇作為空白溶劑。

2.3 線性關系考察 分別精密吸取“2.2.1”項下沒食子酸(0.0418 mg/mL)、柯里拉京(0.0739 mg/mL)、GCG(0.0130 mg/mL)、訶黎勒酸(0.0709 mg/mL)、PGG(0.0458 mg/mL)和鞣花酸(0.0994 mg/mL)對照品溶液 2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL、12 μL，按 2.1 項下色譜條件分別進樣測定，記錄峰面積。以沒食子酸、柯里拉京、GCG、訶黎勒酸、PGG、鞣花酸的進樣量(X，μg)為橫坐標、峰面積(Y)為縱坐標進行線性回歸，得到的線性回歸結果考察見表1。

表1 線性回歸結果考察表

2.4 精密度試驗 精密吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液，在“2.1”項條件下連續進樣 6 次，結果顯示沒食子酸、柯里拉京、GCG、訶黎勒酸、PGG、鞣花酸峰面積 RSD 分別為0.13%、1.83%、2.02%、0.27%、2.70%和0.83%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.5 穩定性試驗 取同一份供試品溶液，在“2.1”項條件下，分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h 進樣，結果顯示沒食子酸、柯里拉京、GCG、訶黎勒酸、PGG、鞣花酸10 h 內峰面積的 RSD 分別為1.81%、3.68%、2.37%、2.01%、2.13%和0.55%(n=7)，表明供試品溶液在 12 h 內穩定性良好。

2.6 重復性試驗 取同一批余甘子果核粉末 6 份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項條件下進樣，結果顯示沒食子酸、柯里拉京、GCG、訶黎勒酸、PGG、鞣花酸的平均含量分別為0.1503 mg/g、0.1862 mg/g、0.0186 mg/g、0.0918 mg/g、0.1345 mg/g、0.3641 mg/g，RSD分別為1.19%、1.77%、2.70%、0.32%、0.47%和0.40%(n=6)，表明該方法重復性良好。

2.7 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的余甘子果核粉末6份，分別加入一定量的對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試溶液，在 “2.1” 項條件下進樣測定，重復6次，計算6個成分的平均回收率。結果沒食子酸、柯里拉京、GCG、訶黎勒酸、PGG、鞣花酸的平均加樣回收率分別為101.40%、100.70%、102.07%、102.30%、102.97%和97.05%，RSD分別為1.90%、1.30%、1.33%、1.10%、1.21%和1.85% (n=6)，結果見表2。

表2 加樣回收測定結果表

2.8 樣品含量測定 取3個不同批次余甘子果核樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項下條件下進樣，測定6個成分的含量，結果見表3。

表3 樣品含量測定結果表 (mg/g，n=3)

3 討論

云南省是余甘子野生資源分布區之一[18]，余甘子作為一種多民族習用藥材，具有廣泛的藥學應用價值。本文參考了余甘子果實的分離方法，實驗結果表明，選擇甲醇-0.1%磷酸溶液作為流動相時，使用文中所選擇的梯度洗脫程序，能保證樣品的分離度。同時，在270 nm波長下各峰分離度良好，特征性強，峰數目較多。實驗數據表明，余甘子果核中鞣花酸的含量最高，GCG的含量最低。鞣質酚酸類化合物是余甘子果核的主要有效成分，也有研究表明余甘子的有效成分主要集中在果肉，果核部分含量較少[19]，也僅對酚類成分進行籠統介紹，本文是對多個成分含量的具體測定，旨在對余甘子果核質量研究提供借鑒和參考。同時余甘子果核中含有豐富的脂質，蛋白質，礦物質，脂溶性纖維素，酚類物質，對人體保健具有重要作用，本文意在為余甘子果核藥用價值的研究提供參考。

綜上，目前關于余甘子果核相關成分含量測定的研究較少，本研究建立的方法操作簡便、結果準確可靠，重復性好，專屬性高，可用于余甘子中沒食子酸、柯里拉京、GCG、訶黎勒酸、PGG、鞣花酸含量的同時測定。為余甘子藥材的質量控制和開發利用奠定一定的基礎。