超高壓輔助酶解對漢麻分離蛋白結構和抗氧化活性的影響

劉容旭，王語聰，劉金陽，謝宜桐，謝智鑫，種正晨，李世函，劉丹怡,*，韓建春,*

（1.黑龍江省綠色食品科學研究院，黑龍江哈爾濱 150028；2.東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱 150030；3.中國儲備糧管理集團有限公司黑龍江分公司，黑龍江哈爾濱 150006）

漢麻（Cannabis sativaL.）屬蕁麻目、漢麻種的一年生草本植物，又名大麻、火麻等[1]。漢麻存活能力較強，在我國各地都能種植，其中以廣西巴馬漢麻種植及食用歷史最為悠久[2]。漢麻蛋白中含有8 種人體必需氨基酸[3]，其中組氨酸和精氨酸的含量比較高，被認為是一種適合老年人和嬰兒的優質蛋白[4]。漢麻蛋白質除氨基酸種類及含量豐富外還具有增強免疫力、抗氧化、抗疲勞、降血糖、維持腸道菌群平衡等作用，是一種多功效植物蛋白資源[5-6]。但漢麻蛋白質溶解度較低，功能性質較差[7]，導致其難以作為原輔料應用于食品及營養保健品生產中，因此，有必要通過某些技術手段改善其功能特性以更好地開發利用漢麻蛋白，提升其市場競爭力。

利用超高壓（ultra-high pressure，UHP）輔助酶解技術處理蛋白質，會使蛋白質結構以及功能性質發生改變[8-9]，實現蛋白質功能性質多元化的同時，也解決了目前酶解改性技術存在的酶解過程隨機、酶利用率低和酶解效率低等問題[10]，提高其應用價值。研究表明壓力的施加會使蛋白質構象改變，發生多肽鏈的伸展和立體結構的松散并且巰基含量及表面疏水性等也會發生變化[10-11]，若在超高壓環境下進行酶解反應，會使蛋白質結構進一步改變進而影響酶與底物之間的酶解效應，從而表現蛋白質功能性質的改善、酶解進程加快以及水解度的有效提高[12-13]。因此，利用超高壓輔助酶解反應改性漢麻分離蛋白（hemp protein isolate，HPI），探究HPI 潛在功能性價值，對充分開發利用植物蛋白資源十分重要。

前期基礎研究已經確認超高壓輔助酶解反應的最優條件：加酶量（復合蛋白酶）5000 U/g、酶解改性pH8.0、酶解改性溫度55 ℃、酶解改性時間50 min。在此基礎上本研究利用超高壓輔助酶解反應對HPI進行改性處理，探究改性后HPI 結構特性的變化，以及對其抗氧化活性功能的影響，對指導實際生產和充分利用HPI 資源具有重要的現實意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

漢麻分離蛋白（食品級96%）黑龍江省大慶市星火牧場；氫氧化鈉、鐵氰化鉀 天津凱通化學試劑有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉 天津市光復科技發展有限公司；甘氨酸 上海吉至生化科技有限公司；乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA）Amesco 分子生物試劑；復合蛋白酶（試劑級）、考馬斯亮藍G-250、牛血清蛋白三羥甲基氨基甲烷（Tris）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2'-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）北京Solarbio 科技有限公司；三氯乙酸 北京京土恒盛商貿有限公司；三氯化鐵 臺山市粵僑試劑塑料有限公司；硫酸亞鐵 國藥集團化學試劑有限公司；水楊酸天津市化工三廠有限公司；過氧化氫 上海凌峰化學試劑有限公司；8-苯胺-1-萘磺酸（8-Anilino-1-naphthalenesulfonic Acid，ANS）Sigma 公司；以上試劑均為分析純。

HHP-400 超高壓設備 沈陽人和機電工程設備有限公司；FD5-3 型冷凍干燥機 美國SIM 公司；8400s 傅立葉變紅外光譜儀 日本島津公司；721 型分光光度計 日立科學儀器（北京）有限公司；HH-4 型數顯恒溫水浴鍋、DF-1 集熱式磁力攪拌器 金壇市雙捷實驗儀器廠；DYCZ-40D 型轉印電泳儀北京六一儀器廠；721 型分光光度計 上海元析儀器有限公司；PT-3502G 型酶標儀 北京普天新橋技術有限公司；PHS-3C 型pH 計 梅特勒-托利多儀器有限公司；Sartorius BSA223S 型電子天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；GZX-9140MBE 型電熱鼓風干燥箱 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；L-8900 氨基酸分析儀 天美（中國）科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 超高壓輔助酶解反應條件 配制50 g/L 的漢麻蛋白溶液，用1 mol/L NaOH 溶液調節溶液pH 至最適值。隨后加入蛋白酶與上述溶液混勻，將此蛋白溶液密封在聚氯乙烯袋中，放入HHP-400 超高壓設備中于不同壓力（0.1、100、200、300 MPa）下，在設定溫度中進行酶解改性反應單因素實驗，以溶解度及水解度為判定指標，篩選出最適酶解反應條件。水解物經FD5-3 型冷凍干燥機進行凍干得到蛋白樣品。經前期基礎研究確定，最佳酶解反應條件為：復合蛋白酶加酶量5000 U/g、改性pH8.0、改性溫度55 ℃、改性時間50 min，此條件下HPI 的溶解度達到83.55%，水解度達到10.5%[14]。

1.2.2 SDS-PAGE 電泳分析 參考文獻[15]方法，略有改動。分別選取分子量范圍在14.4～97.4 kDa以及3.3～31 kDa 的蛋白質標準品用于原蛋白質與改性蛋白質樣品電泳分析。制樣：將蛋白質樣品配制成濃度為2 mg/mL 的溶液，加入蛋白上樣緩沖液（含β-巰基乙醇），混勻后，沸水浴5 min，上樣量為10 μL。制膠：配制12%分離膠、5%濃縮膠用于原蛋白質電泳分析以及20%分離膠、10%夾層膠、4%濃縮膠用于改性蛋白質電泳分析，配制完成后，分別依次注入兩板之間，插入梳子等待凝膠形成。電泳：上層膠電壓80 V，時間30 min，下層膠電壓120 V，時間100 min（原蛋白）；30 V 跑1～2 h 后，待指示前沿到達分離膠時，調至100 V，跑5～6 h（改性蛋白樣品）。染色與脫色：使用考馬斯亮藍R-250 進行染色，染色時間控制在20 min 左右，染色結束后使用脫色液（冰醋酸10%，甲醇30%）脫色至條帶清晰。

1.2.3 表面疏水性的測定 參考文獻[16]方法，略有改動。用0.01 mol/L 的磷酸鹽緩沖液（pH7.0）將蛋白質樣品稀釋至0.025～0.02 mg/mL，配制8 mmol/L 8-苯胺基-1-萘磺酸（ANS）溶液作為熒光探針。分別取稀釋樣品5 mL 與ANS 溶液50 μL 混合均勻后避光反應20 min，使用熒光分光光度計測定其熒光強度，測試所用激發波長、發射波長分別為390 nm、470 nm，空白對照為緩沖液與ANS 混合溶液。蛋白質的表面疏水性為蛋白質濃度與熒光強度擬合回歸方程的斜率。

1.2.4 漢麻分離蛋白結構分析

1.2.4.1 氨基酸含量及組成分析 取凍干蛋白質樣品0.1 g 于水解管中，加入10～15 mL 6 mol/L HCl，將水解管置于冷凍劑中，充氮氣保護，在鼓風干燥箱（110 ℃）中水解22 h 后，將水解液定容至50 mL，準確吸取1 mL 于試管中，待干燥完全后，用1 mL 檸檬酸鈉緩沖溶液（pH2.2）復溶，過濾后上樣，采用氨基酸自動分析儀進行分析[17]。

1.2.4.2 傅立葉紅外光譜分析 參考文獻[18]方法，略有改動。將待測樣品在干燥器內用P2O5干燥兩星期備用。先將溴化鉀置于烘箱（105 ℃）烘干后壓成薄片，將其放入載片槽中使用紅外光譜儀進行分析參比。再稱取20 mg 蛋白質樣品與KBr 粉末（比例為1:100）混勻后放入研缽中充分研磨，壓成薄片，利用傅立葉紅外光譜儀進行全波段掃描（400～4000 cm-1），分辨率4 cm-1。

1.2.4.3 巰基含量的測定 參考文獻[19]方法，略有改動。游離巰基的測定：將蛋白質樣品配制成10 mg/mL 的溶液，取1 mL 與pH8.0 的Tris-甘氨酸緩沖液（0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L 甘氨酸、8 mol/L 尿素、0.04 mol/L EDTA）5 mL 于EP 管中，加入4 mg/mL 的DTNB 溶液0.04 mL，混合均勻后于室溫下靜置反應20 min，在412 nm 處測量其吸光度值記為A412。

表面巰基的測定：將蛋白質樣品配制成10 mg/mL 的溶液，取1 mL 與pH8.0 的Tris-甘氨酸緩沖液（0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L 甘氨酸、0.04 mol/L EDTA）5 mL 于EP 管中，混合均勻后于室溫下靜置反應20 min，在412 nm 處測量其吸光度值記為A412。計算公式如下：

式中：A412表示412 nm 處的吸光值；D 表示稀釋倍數；ε表示消光系數，13600 mol-1/cm；C 表示樣品濃度，mg/mL。

1.2.4.4 內源熒光光譜分析 參考文獻[20]方法，略有改動。將蛋白質樣品用0.01 mol/L、pH7.0 磷酸鹽緩沖液配制成濃度為1 mg/mL 的溶液，取1 mL 置于四通比色皿中，利用熒光分光光度計進行內源熒光光譜掃描，設置激發波長、發射波長分別為295 nm、310～450 nm，掃描速度1200 nm/min，以磷酸鹽緩沖溶液為空白對照。

1.2.5 漢麻分離蛋白抗氧化活性的測定

1.2.5.1 DPPH 自由基清除率測定 參考文獻[21]方法并略作改動，稱取DPPH 粉末5 mg，在避光環境下使用適量無水乙醇充分溶解，再定容至100 mL，配制成50 μg/mL 的DPPH 溶液，該溶液現用現配。按照表1 添加溶液，分別充分混合均勻后，室溫避光反應30 min，于波長517 nm 處采用酶標儀測定吸光度，計算公式如式（2）。

表1 DPPH 自由基清除活性測定各試劑添加量Table 1 DPPH free radical scavenging activity determination of reagent addition amount

式中：As表示樣品與DPPH 混合液吸光值；Ac表示樣品與無水乙醇混合液吸光值；Ab表示蒸餾水與DPPH 混合液吸光值。

1.2.5.2 ABTS+自由基清除率測定 參考文獻[22]方法并略作改動，稱取ABTS 200 mg，過硫酸鉀34.4 mg，溶于50 mL 蒸餾水中，攪拌均勻，避光靜置24 h 后，作為ABTS 母液。用95%乙醇將適量ABTS 母液稀釋至吸光度值在0.7±0.02 內（OD734）待用，該溶液現用現配。按照表2 添加溶液，分別充分混合均勻后，室溫避光反應5 min，在波長734 nm處采用酶標儀測定吸光度，計算公式如式（3）。

表2 ABTS+自由基清除活性測定各試劑添加量Table 2 ABTS+ free radical scavenging activity determination of reagent addition amount

式中：Ab表示蒸餾水與ABTS 混合液吸光值；As表示樣品與ABTS 混合液吸光值。

1.2.5.3 還原能力測定 參考文獻[23]方法并略作改動，分別配制PBS 緩沖溶液（0.2 mol/L）、鐵氰化鉀溶液（1%）、氯化鐵溶液（0.1%）、三氯乙酸溶液（10%）。將一定濃度蛋白質樣品溶液、PBS 緩沖溶液和鐵氰化鉀溶液按照1:1:5 比例混勻，于50 ℃水浴鍋中靜置20 min，然后室溫下加入與樣品溶液一致比例的三氯乙酸溶液，4000 r/min 離心10 min 后保留上清液。按照下表3 添加溶液，分別充分混合均勻后，于波長700 nm 處采用酶標儀測定吸光度，計算公式如式（4）。

表3 還原能力測定各試劑添加量Table 3 Reducing power determination of reagent addition amount

式中：A2表示樣品與氯化鐵混合液吸光值；A1表示蒸餾水與氯化鐵混合液吸光值。

1.3 數據處理

采用IBM SPSS Statistics26 進行顯著性分析（P＜0.05）；利用Statistic 8、Origin 2019 Pro 軟件對數據進行分析及繪圖，所有實驗組均進行三次平行實驗，數據采用平均值±標準差的形式表示。

2 結果與分析

2.1 超高壓輔助酶解反應對HPI 電泳特性的影響

圖1 為超高壓輔助酶解反應前后HPI 凝膠電泳圖，通過各條帶對比進行漢麻分離蛋白酶解物分子量分析。由于改性后產物蛋白分子量有所降低，在標準凝膠電泳中條帶呈現效果不佳，因此使用低分子量電泳對酶解產物分子量進行分析。由圖1 可知，改性前后蛋白質的亞基組成發生明顯改變，HPI 在電泳圖中可見三條明顯條帶，最大分子量在34 kDa 左右，經酶解改性后，產物蛋白分子量明顯降低，且壓力的增加增大了HPI 的酶解程度，分子量降低更加明顯，但不同壓力處理下酶解產物條帶的進樣口附近均有聚集體存在，說明仍有一部分大分子量蛋白質未被酶解。

圖1 不同壓力下酶解產物的凝膠電泳圖譜Fig.1 Gel electrophoresis patterns of enzymatic hydrolysis products under different pressures

2.2 超高壓輔助酶解反應對HPI 表面疏水性的影響

表面疏水性表示蛋白質分子表面上疏水基團的數量，是判斷蛋白質構象及功能性質變化的重要指標之一。當蛋白質結構發生伸展或折疊時，其表面疏水區域會隨之暴露或埋藏，與乳化性、起泡性等有著緊密聯系，通常蛋白質表面疏水性越強，蛋白質乳化性及起泡性越好[24]。如圖2 所示為超高壓輔助酶解反應對產物表面疏水性的影響，隨著壓力的增大，漢麻蛋白酶解產物（HPIH）的表面疏水性先升高后降低，在200 MPa 時表面疏水性最強，當壓力升到300 MPa時有所下降，但仍高于未經水解HPI。這是因為蛋白質經過高壓酶解后結構變得更加松散，肽鏈展開，使蛋白質分子疏水基團逐漸暴露，從而表面疏水性增強，然而300 MPa 壓力處理時表面疏水性有所降低可能是因為在壓力的作用下水解物重新聚集，使暴露于表面的疏水基團重新被隱藏于蛋白分子內部[25]。可見，超高壓與酶解反應在提高HPI 表面疏水性方面存在著協同作用，表面疏水性的提高將會對酶解產物乳化性等功能性質產生有益影響。

圖2 超高壓輔助酶解反應對HPI 表面疏水性的影響Fig.2 Effect of UHP combined enzymatic hydrolysis reaction on surface hydrophobicity

2.3 超高壓輔助酶解反應對HPI 氨基酸組成及含量的影響

超高壓輔助酶解改性前后HPI 氨基酸組成及含量如表4 所示。由于樣品處理是使用酸水解法，色氨酸遭到破壞，故氨基酸組成與含量分析中不包括對色氨酸的分析。

表4 不同壓力下酶解產物氨基酸含量Table 4 Amino acid content of enzymatic hydrolysis products under different pressures

氨基酸含量及組成決定了蛋白質的營養價值，由表4 可知，改性前后HPI 氨基酸組成不變且種類齊全，均含有17 種氨基酸，7 種必需氨基酸和10 種非必需氨基酸。而酶解產物總氨基酸含量存在不同程度下降。非必需氨基酸方面，對于食物中鮮味物質的呈現有著非常重要作用的谷氨酸和天冬氨酸含量較高[26]，酶解產物的天冬氨酸含量在0.1、100、200、300 MPa 時分別降低了9.92%、11.55%、10.19%和10.73%；谷氨酸含量在0.1、100、200、300 MPa 時分別降低了10.57%、15.45%、6.50%和2.44%。另外，作為維持嬰幼兒生長發育必不可少的精氨酸含量總體來說也十分豐富，雖然其含量在0.1、100、200、300 MPa 時分別降低了5.96%、1.70%、1.28%和3.09%，但仍遠高于土豆蛋白、小麥蛋白與玉米蛋白等常見植物蛋白質中的精氨酸含量（2%～4%）[27]。必需氨基酸中，纈氨酸、異亮氨酸含量降低幅度較大，其中纈氨酸在0.1、100、200、300 MPa 時分別降低了7.07%、12.72%、7.77%和7.42%；異亮氨酸在0.1、100、200、300 MPa 時分別降低了7.45%、1.17%、12.16%和6.67%。由以上結果可知，雖然HPI 經超高壓輔助酶解改性后各氨基酸存在不同程度損失，但整體來看酶解產物在營養價值方面仍具備一定優勢，因此HPI 及HPIH 可以作為優質的植物蛋白質資源以提升其在食品加工應用中的附加值。

2.4 超高壓輔助酶解反應對HPI 二級結構的影響

傅立葉紅外光譜常被用于分析蛋白質中氨基酸基團變化情況，是探究蛋白質和多肽二級結構變化的重要手段。HPI 經超高壓輔助酶解反應改性前后紅外譜圖如圖3 所示，蛋白質在3288、2962、1631、1544、1447、1394、1246、1102 cm-1左右存在明顯吸收峰，其中在3288 cm-1附近處的吸收峰為羥基伸縮振動，酰胺基團中的N-H 的伸縮振動；2962 cm-1附近的吸收峰為甲基、亞甲基中C-H 的對稱和反對稱伸縮振動；1631 cm-1附近處尖銳的吸收峰為酰胺Ⅰ帶C=O 伸縮振動；1544 cm-1、1447 cm-1附近處為蛋白酰胺II 帶中N-H 的彎曲振動；1394、1246 cm-1處吸收峰為酰胺Ⅲ帶中C-N 伸縮振動；1102 cm-1處由C-O-C 伸縮振動引起[28]。從譜圖中可以看出，與HPI 相比，不同壓力下的HPIH 峰型由尖銳變得相對平緩，主要是經過酶解改性后產物中分子間氫鍵增多所致。酶解產物在不同波長下吸收峰的面積和峰形均存在一定差異，且隨著壓力的變化，峰位發生了不同程度的偏移，峰強度也發生改變，可見HPI 經超高壓輔助酶解改性后結構發生了明顯變化，從而影響了其理化及功能性質[29]。

2.5 超高壓輔助酶解反應對HPI 三級結構的影響

巰基作為蛋白質一種重要的功能基團，屬于維持蛋白質三級結構穩定的弱次級鍵，巰基含量變化與蛋白質結構改變及功能性質的改善密切相關。由圖4 可知，與HPI 相比，酶解產物的表面巰基含量呈先上升后下降的趨勢，200 MPa 以內的壓力處理導致表面巰基含量升高，是由于在超高壓酶解反應作用下多肽鏈更加伸展，使包埋在蛋白質內部的疏水基團及巰基基團暴露，因而表面巰基含量增加，當壓力增加至300 MPa 時，蛋白質在高壓環境下發生重折疊，使暴露于表面的巰基重新包埋于蛋白質分子內部，導致其含量降低。HPIH 游離巰基含量隨著壓力的增加而顯著減少，是因為一些暴露到分子表面的巰基基團會發生氧化反應轉化成二硫鍵，而且在壓力及酶解作用下，新產生的游離巰基也會發生重組導致二硫鍵的生成，因此游離巰基含量降低，這與Zhao 等[30]在探究花生蛋白酶解改性時巰基含量變化結果類似。

圖4 超高壓輔助酶解反應對產物巰基含量的影響Fig.4 Effect of UHP combined enzymatic hydrolysis reaction on sulfhydryl content

蛋白質中的色氨酸等芳香族氨基酸在特定波長下可被激發產生熒光，可通過熒光強度和最大發射波長的改變判斷蛋白質三級結構的變化。超高壓輔助酶解改性產物熒光光譜如圖5 所示，在0.1～300 MPa壓力處理下，HPIH 的熒光強度隨壓力增大呈現先升高后降低的趨勢，當壓力為200 MPa 時，熒光強度最大，壓力達到300 MPa 時，熒光強度反而下降。此外，與HPI 相比，酶解產物最大發射波長均發生一定程度紅移。出現以上現象可能是因為在酶解反應后，蛋白質部分結構發生了伸展，內部疏水區被破壞，芳香族疏水性基團逐漸顯露，更多的色氨酸從蛋白質分子內部非極性環境中逐漸暴露于溶劑中，導致熒光強度升高[31]。但壓力升高至300 MPa 時，蛋白質分子發生聚集，芳香族疏水性基團重新被包裹起來，因此熒光強度較200 MPa 處理時有所降低。以上結果表明，超高壓輔助酶解反應處理破壞了HPI 分子間作用力，蛋白質三級結構發生改變，這與圖2 表面疏水性結果一致。

圖5 不同壓力下酶解產物的熒光光譜圖Fig.5 Fluorescence spectra of enzymatic hydrolysis products under different pressures

2.6 超高壓輔助酶解反應對HPI 抗氧化活性的影響

2.6.1 超高壓輔助酶解反應對HPI 清除DPPH 自由基的影響 DPPH 自由基可在有機溶劑中穩定存在，在乙醇溶液呈紫色，吸收峰為517 nm。因具有單一電子，故能接受一個電子或氫離子。當與抗氧化劑作用時，可使體系顏色變淺或消失，吸光值下降[32]。圖6 為超高壓輔助酶解反應對不同濃度下酶解產物清除DPPH 自由基的影響，可以看出，HPIH 與HPI 均呈現一定的抗氧化能力，且樣品濃度與其對DPPH 自由基的清除能力呈一定劑量關系，即自由基清除率隨樣品濃度的增大而增大。HPI 經過酶解改性后，DPPH 自由基清除能力顯著提升，當壓力在0.1～300 MPa 時，HPIH 自由基清除率隨壓力的增加先增大后減小，在200 MPa 時達到最大值。是因為在200 MPa 壓力范圍內，壓力的增加使蛋白質構象逐漸發生改變，蛋白質結構伸展，酶解作用增強，產生大量具有抗氧化活性的小分子肽段，因此DPPH 自由基清除率增大，但壓力過大（300 MPa）會導致蛋白質重新發生聚集且蛋白酶失活[33]，對水解反應產生抑制作用，從而導致清除率降低。

圖6 超高壓輔助酶解反應對產物DPPH 自由基清除率的影響Fig.6 Effect of UHP combined enzymatic hydrolysis reaction on DPPH radical scavenging rate

2.6.2 超高壓輔助酶解反應對HPI 清除ABTS+自由基的影響 ABTS 與過硫酸鉀反應，可以生成綠色的ABTS+自由基，該自由基在734 nm 處有最大吸收，當體系中加入抗氧化劑時，會使其在734 nm 處的吸光度降低[34]。經計算，得到超高壓輔助酶解反應產物在不同濃度下的ABTS+自由基清除率，如圖7所示，在2～10 mg/mL 濃度范圍內，ABTS+自由基清除能力隨著樣品濃度的增加而逐漸增強。總體來看，HPIH 對ABTS+自由基的清除能力從大到小依次為200、300、100、0.1 MPa，較HPI 相比，均有不同程度增強，這是因為HPI 經酶解及超高壓處理后其蛋白結構發生變化，因此使得酶解產物的ABTS+自由基的清除率提高，這對于HPI 酶解產物抗氧化性的研究是一個積極的結果[35]。此前，趙貴川[36]在探究壓力對米渣蛋白酶解物抗氧化能力影響的實驗中發現，當壓力過大時，酶解產物抗氧化能力反而降低，本實驗結論與之相類似。

圖7 超高壓輔助酶解反應對產物ABTS+自由基清除率的影響Fig.7 Effect of UHP combined enzymatic hydrolysis reaction on ABTS+ radical scavenging rate

2.6.3 超高壓輔助酶解反應對HPI 還原能力影響還原能力測定原理是抗氧化劑使鐵氰化鉀的Fe3+還原成Fe2+（亞鐵氰化鉀），亞鐵氰化鉀進一步與三氯化鐵反應生成在700 nm 處有最大吸光度的普魯士藍，因此測定700 nm 處吸光度大小可以間接反映抗氧化劑還原能力的大小，吸光度越大，還原能力越強[37]。圖8 為超高壓輔助酶解反應對不同濃度下酶解產物還原能力的影響，HPI 經過改性后，其產物的還原能力均有所增加，且隨著處理壓力的提高，呈現先增后減的趨勢，在不同樣品濃度下，200 MPa 處理下的HPIH 均具有最大吸光度，而在300 MPa 處理下還原能力反而降低，這說明適當的壓力處理可以最大程度提升酶解產物的抗氧化能力，與關海寧等[38]研究結果相符。

3 結論

本研究通過超高壓輔助酶解HPI，探究超高壓處理條件對HPI 結構和抗氧化活性的影響。隨壓力的增加蛋白質酶解反應程度增大，分子量逐漸降低。表面疏水性逐漸增加而后下降，在200 MPa 時表面疏水性達到最大。HPIH 總氨基酸含量在改性后均有不同程度下降，在非必需氨基酸中，天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸含量下降明顯，必需氨基酸中，異亮氨酸及纈氨酸含量降低幅度較大。HPI 經超高壓輔助酶解反應后其二級和三級結構發生了明顯變化（P＜0.05）。酶解產物的DPPH、ABTS+、還原能力均在200 MPa 時達到最大值。綜上所述，超高壓處理能顯著改變HPI 的二、三級結構，從而對抗氧化活性產生影響。本研究為超高壓技術在漢麻蛋白產品中的應用提供了科學依據，有利于促進超高壓技術在農產品加工領域的應用。