UPLC-MS/MS法檢測3 種食品中松仁過敏原

寧亞維，周泓鑫，楊 正，馬俊美，劉 茁，張 巖，李 強,

（1.河北科技大學食品與生物學院，河北 石家莊 050018；2.河北省食品檢驗研究院，河北 石家莊 050000）

近年來，食物過敏性疾病在世界范圍內的發生率呈現上升趨勢，已經成為一個公眾性、全球性的健康問題[1]。松仁屬于八大類食物過敏原中的堅果類，堅果是致命性過敏反應的最常見原因之一，常常引發患者出現蕁麻疹、惡心及味覺改變，嚴重時會出現急性哮喘、過敏性休克[2-4]等過敏性癥狀，患者即使接觸微量松仁也會引起過敏性疾病[5]。由于現階段對于松仁過敏尚無有效治療手段，過敏人群只能依賴食品標簽識別避免日常飲食中出現松仁。然而松仁營養素種類豐富，常作為食品原料增加產品營養價值[6]。在食品生產過程中，含松仁的食品與其他食品共用生產線，可能導致交叉污染，但此類隱性過敏原是導致過敏的主要原因。此外，生產過程中包裝錯誤與原料處理不當等原因也增加了松仁過敏患者的患病風險[7-8]。因此，需要開發一種高靈敏檢測技術對食品中的松仁過敏原進行有效監管。

目前，食品中過敏原的檢測技術主要包括基于DNA水平的檢測技術和基于蛋白質水平的檢測技術兩大類。基于DNA水平檢測技術有聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）[9-10]、實時PCR（real-time PCR）[11]以及環介導等溫擴增技術[12]；基于蛋白質水平的檢測技術，有酶聯免疫吸附技術（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）[13-14]、免疫印跡技術[15]以及液相色譜-串聯質譜（liquid chromatography-tandem mass spectromotry，LC-MS/MS）法[16-19]。目前我國針對食品中松仁過敏原檢測的研究較少。國外報道，Garino等[20]通過real-time PCR對復雜食品中松子過敏原進行特異性檢測。這類基于DNA水平的檢測技術原理是檢測食品中是否存在過敏原蛋白基因檢測過敏原，但檢測過程是針對編碼目的蛋白的基因序列，因此無法直接判斷過敏原是否存在，并且容易出現假陽性現象[21]。Cabanillas等[5]通過ELISA提取了松子中的致敏蛋白Pin p 1，松子過敏原Pin p 1與裸子植物的2S白蛋白具有高度同源性，與被子植物的2S白蛋白具有低同源性，表明松子致敏蛋白Pin p 1特異性較低，因此會影響食品中松子過敏原的檢測準確度。ELISA是目前應用最廣泛的基于蛋白質水平的過敏原檢測技術，具有靈敏性高、特異性強等優點。但ELISA只能檢測一種致敏性蛋白質，并且若加工過程中出現蛋白質變性則會導致抗體無法識別從而出現假陽性結果。因此，有必要開發一種基于食品中松仁過敏原的高效、準確的快速檢測技術。

質譜技術具有高通量、高分辨率、高靈敏度等優點，不僅可以避免加工過程中蛋白質變性而引起的假陽性結果，而且可以避免同源性蛋白質導致的假陽性問題，在食品中過敏原的定量檢測方面具有較高的優勢。Sealey-Voyksner等[22]采用LC-MS/MS方法基于松仁過敏原pin 1和pin 2篩選了TLAQSLDVELETAR和DYSSFPLAGPASSSGGGGR兩條特征肽段，實現了定性檢測，但未開發高靈敏度定量檢測技術。Lee等[23]基于松仁過敏原以ALPNFGEVSELLEGISR為定量肽段建立了一種LC-MS/MS法檢測餅干中的堅果過敏原，其中松仁過敏原檢出限為10 mg/kg，方法檢出限相對較高。因此，有必要基于LC-MS/MS方法篩查高特異性特征肽段，開發高靈敏度松仁過敏原檢測技術。鑒于上述研究背景，本研究擬篩選松仁特異性肽段，建立一種UPLC-MS/MS對常見食品基質中的松仁過敏原Pin k 2進行快速檢測，以期對食品中松仁過敏原進行高靈敏度檢測，為我國食品標簽真實性檢驗及食品中松仁隱性過敏原的檢測提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

松仁、餅干、飲料、巧克力等食品隨機購買于河北石家莊。

三羥甲基氨基甲烷、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、碘乙酰胺（iodoacetamide，IAA）、碳酸氫銨、氯化鈣（均為分析純）美國Sigma-Aldrich公司；尿素（分析純）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；生物級TPCK-胰蛋白酶 美國SCIEX公司；正己烷、乙腈（均為質譜級）美國Fisher Scientific公司；甲酸（色譜純）天津科密歐化學試劑有限公司；所有試劑均使用Watsons蒸餾水配制。

1.2 儀器與設備

Easy-nLC 1000-Q-Exactive LCQ液相色譜-串聯高分辨質譜、超濾離心管（10k Da）美國Thermo Scientific公司；Qtrap 5500超高效液相色譜-串聯三重四極桿質譜儀 美國ABSCIEX 公司；1-14K高速冷凍離心機 美國Sigma公司；ULTA-TURRAX分散機、Trayster digital渦旋混勻器 德國IKA公司；SHA-B恒溫振蕩水浴鍋等 常州潤華電器有限公司；離心管 德國Eppendorf公司；低蛋白吸附樣品瓶（250 μL）美國Waters公司；Proteonavi（2.0 mm×150 mm，5 μm）色譜柱 日本資生堂投資有限公司；C18富集柱（100 μm×4 cm，5 μm，120 ?）、C18分析柱（75 μm×15 cm，5 μm，120 ?）北京樂潤峰科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準儲備液的制備

取5 g松仁，加入50 mL水，使用豆漿機磨漿5 min，直至松仁顆粒完全溶解。將溶液轉移至100 mL容量瓶中，加水定容，配制成50 mg/mL的松仁標準儲備液，4 ℃保存備用。

1.3.2 樣品前處理

稱取1 g經過研磨的樣品，加入5 mL正己烷脫脂，旋轉混勻15 min，4000×g離心15 min，重復脫脂操作兩次，脫脂后的樣品用氮氣吹干。后加入4 mL提取緩沖液（含2 mol/L尿素的50 mmol/L Tris溶液），混勻后旋轉振蕩提取1 h，6000×g離心20 min。移取500 μL上清液至2 mL離心管中，加入10 μL還原劑（500 mmol/L DTT），混勻后置于60 ℃水浴鍋，振蕩反應30 min。將混合物冷卻至室溫后加入30 μL烷基化試劑（500 mmol/L IAA），混勻后暗處反應30 min。加入420 μL的酶解緩沖液（500 mmol/L的碳酸氫銨溶液和1 mmol/L的氯化鈣溶液）和30 μL的胰蛋白酶（500 μg/mL）溶液，充分混勻后置于37 ℃水浴鍋孵育過夜。加入10 μL甲酸停止酶解反應，將混合物室溫靜置5 min后于12000×g離心8 min，取上清液至10 kDa超濾離心管中，14400×g離心20 min。收集下層濾液利用高效液相色譜-串聯質譜進行分析。

1.3.3 儀器條件

1.3.3.1 液相色譜-串聯高分辨質譜測定條件

色譜條件：預柱：C18富集柱（100 μm×4 cm，5 μm，120 ?）；分析柱：C18分析柱（75 μm×15 cm，5 μm，120 ?）；進樣體積2 μL；流動相A為0.1%甲酸溶液，流動相B 為0.1%甲酸-乙腈溶液；洗脫程序：0～3 min，97%～93% A、3%～7% B；3～38 min，93%～78% A、7%～22% B；38～48 min，78%～65% A、22%～35% B；48～50 min，65%～10% A、35%～90% B；50～60 min，10% A、90% B；流速300 nL/min。

質譜條件：配備蛋白專用Nanospray Flex電離源，采用正離子模式；掃描模式為Full MS/dd-MS2；Full MS分辨率70000；自動增益控制目標1×106；掃描范圍m/z350～1800；dd-MS2分辨率17500；自動增益控制目標1×105；隔離窗口m/z2.0；第一固定質量m/z120.0；碰撞能量27 eV。

1.3.3.2 超高效液相色譜-串聯三重四極桿質譜測定條件

色譜條件：采用色譜柱Proteonavi（2.0 mm×150 mm，5 μm）；流動相A：0.1%甲酸溶液，流動相B：0.1%甲酸-乙腈溶液；洗脫程序：0～2 min，90% A、10% B；2～4 min，90%～70% A、10%～30% B；4～7.5 min，70%～60% A、30%～40% B；7.5～9 min，60%～25% A、40%～75% B；9～11 min，25% A、75% B；11～11.01 min，25%～90% A、75%～10% B；11.01～15 min，90% A、10% B；流速300 μL/min；進樣體積2 μL。

質譜條件：采用電噴霧電離源；正離子掃描模式；采用多反應監測模式；離子化電壓4000 V；霧化氣壓力55 psi；輔助氣壓力55 psi；氣簾氣壓力30 psi；離子源溫度450 ℃。

1.3.4 方法學驗證

1.3.4.1 線性關系、檢出限、定量限

使用空白基質提取液將松仁標準儲備液（50 mg/mL）稀釋至質量濃度為0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50 mg/mL的溶液。取500 μL上述溶液至2 mL離心管中，經1.3.2節所述的還原、烷基化和酶解后得到酶解液。向酶解液中加入10 μL甲酸停止消化，然后12000×g離心8 min，取上清液過0.22 μm的羧甲基纖維素濾膜，收集濾液進行UPLCMS/MS分析。

線性方程以松仁質量濃度為橫坐標（X），松仁特征肽段的色譜峰面積作為縱坐標（Y）進行計算（4 個平行）。分別以特征肽段獲得3 倍和10 倍信噪比時的松仁質量濃度作為檢出限和定量限。

1.3.4.2 加標回收率

分別向空白基質中添加2、4、20 倍定量限的松仁標準品儲備液，進行加標回收率的測定，每個濃度設置6 個平行以計算方法精密度。為排除基質對松仁特征肽段定量的影響，所有標準曲線均使用該基質所對應的不含松仁的空白樣品提取液進行配制。

1.3.4.3 基質效應

精密移取一定量的松仁標準儲備液，用不含松仁的餅干、巧克力和飲料空白基質提取液梯度稀釋配成0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50 mg/mL的標準曲線溶液用于計算基質效應。基質效應按下式計算：

式中：slopematrix為空白基質標準曲線的斜率；slopestandard為水溶劑標準曲線的斜率。

1.3.5 實際樣品檢測

固體樣品研磨為粉末后稱取1 g，移取液體樣品500 μL，將上述樣品按照1.3.2節方法進行前處理后，用標準曲線對樣品中的松仁含量進行定量。

1.4 數據統計及圖表繪制

所有實驗均重復3 次取其平均值，通過Origin軟件對數據進行統計分析并對實驗結果進行作圖。

2 結果與分析

2.1 特征肽段的篩選

特征肽段對液相色譜-質譜檢測方法的特異性和靈敏度具有重要影響。松仁過敏原Pin k 2屬于豌豆球蛋白，具有較好的熱穩定性[24]，在食品加工過程中不易降解[25-26]。因此本研究針對松仁主要過敏原Pin k 2進行特征肽段篩選。將經過酶解凈化后的樣品使用Easy-nLC 1000-Q-Exactive LCQ液相色譜-串聯高分辨質譜儀進行分離分析，隨后結合Uniprot蛋白數據庫以及ProteinPilotTM軟件對得到的質譜譜圖進行數據處理，得到大量的肽段信息（圖1）。然后按照以下的肽段篩選原則進行特征肽段的篩選：首先是對肽段長度的要求，應為8～25 個氨基酸為宜，肽段過短難以滿足特異性要求，過長則容易在前處理過程中斷裂；其次，所選肽段不應含修飾位點，也不應漏切和錯切的酶切位點，以保證方法的可重復性；經BLAST搜索后具有特異性，以免在其他物種中被檢測到，出現假陽性結果；在進行定性和定量分析時，具有較高的靈敏度和良好的峰形[27-30]。根據以上篩選原則，最終篩選了3 條符合條件的松仁特異性肽段，分別為ALPNFGEVSELLEGISR、LEILWFDINTSGNER、NNVLQTLEK。其中NNVLQTLEK肽段為本實驗中首次篩選到的特異性肽段。松仁過敏原與花生過敏原Ara h 3有重合的線性表位[31]，為了保證所篩選的肽段具有特異性，制備了花生、杏仁、核桃、芝麻、葵花籽、開心果和榛子等常見堅果的酶解樣品驗證松仁肽段特異性，結果顯示，所篩選的3 條松仁肽段均只在松仁酶解樣品中檢測到，而其他堅果酶解樣品均顯示未檢出。說明所篩選肽段具有高度特異性，可用于松仁過敏原檢測方法的開發。

圖1 Pin k 2的氨基酸序列Fig.1 Amino acid sequences of Pin k 2

2.2 流動相及質譜參數的優化

在相同的梯度洗脫程序條件下，對比100%水、0.1%甲酸-水和100%乙腈、0.1%甲酸-乙腈分別作為流動相A和流動相B時特征肽段的響應值和峰形。結果表明，以0.1%甲酸-水和0.1%甲酸-乙腈分別作為流動相A和流動相B，特征肽段的響應值和峰形都更好，明顯改善了拖尾現象，且肽段的穩定性較高。加入甲酸可以在一定程度上促進肽類物質的電離，從而增強其質譜信號，因此后續研究采用0.1%甲酸-水和0.1%甲酸-乙腈分別作為流動相A和流動相B。

通過ProteinPilotTM得到的數據信息中可以得到特異性肽段的母離子和b、y離子參數，選取響應值較高的b、y離子作為子離子。制備高濃度的松仁酶解樣品，通過蠕動泵以5 μL/min的速率直接注入Qtrap 5500質譜儀中，以全掃描模式依次確定肽段的精確母離子、子離子以及其他質譜參數，為保證檢測結果的準確度，每個肽段選取3 個子離子。優化后的去簇電壓、碰撞能量參數見表1，優化后的色譜圖見圖2。

表1 松仁特征肽段的MRM參數Table 1 MRM parameters of characteristic peptides from pine nuts

圖2 松仁3 條特征肽段色譜圖Fig.2 Chromatograms of three characteristic peptides from pine nuts

2.3 方法學驗證結果

2.3.1 線性關系、檢出限、定量限

通過對方法線性關系、檢出限和定量限的測定考察方法的靈敏度和適用的濃度范圍。3 條特征肽段的線性關系、檢出限和定量限結果見表2。3 條特征肽段在餅干、巧克力和飲料3 種基質中的線性良好，R2均能達到0.99以上。其中NNVLQTLEK在3 條特征肽段中靈敏度最高且穩定性好，故選取NNVLQTLEK作為松仁定量分析肽段，其他兩條肽段作為輔助定性肽段。在餅干和巧克力這兩種固體基質中，檢出限、定量限分別為1 mg/kg和2.5 mg/kg；在飲料基質中，檢出限、定量限分別為0.005 mg/mL和0.01 mg/mL。目前對于松仁過敏原檢測的研究報道較少，Lee等[23]以ALPNFGEVSELLEGISR為定量肽段建立的LC-MS/MS法檢測餅干中的堅果過敏原，其中松仁過敏原檢出限為10 mg/kg。而本研究中篩選到的NNVLQTLEK肽段，檢出限（1 mg/kg）僅為該方法的十分之一，表明本方法可實現松仁過敏原的高靈敏度檢測。

表2 松仁3 條特征肽段的線性關系、檢出限和定量限（n ＝4）Table 2 Linear relationships,detection limits and quantification limits of three characteristic peptides in pine nuts (n=4)

2.3.2 加標回收實驗結果

為考察方法的重復性和穩定性，在空白基質中添加松仁標準儲備液進行加標回收率和精密度的測定。松仁在餅干、巧克力和飲料3 種空白基質中的加標回收率如表3、4所示，在餅干基質中的回收率在88.50%～107.57%之間，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為0.94%～4.21%；在巧克力基質中的回收率在96.60%～104.57%之間，RSD為2.22%～6.08%；在飲料基質中的回收率在87.42%～108.20%之間，RSD在1.79%～4.89%之間。上述結果表明，此方法具有較好的準確度且重復性好。

表3 松仁肽段餅干、巧克力基質加標回收率（n ＝6）Table 3 Recoveries of pine nut peptides from spiked biscuit and chocolate (n=6)

表4 松仁肽段飲料基質加標回收率（n ＝6）Table 4 Recoveries of pine nut peptides from beverage (n=6)

2.3.3 基質效應

食品基質會在一定程度上對目標化合物起到促進或抑制作用，為驗證食品基質是否對檢測方法有干擾，對定量肽段NNVLQTLEK的基質效應進行檢測。定量肽段NNVLQTLEK的基質效應如圖3所示，結果表明餅干的基質效應為89.77%，巧克力的基質效應為91.82%，飲料的基質效應為96.13%，結果均小于100%，說明餅干、巧克力、飲料對特征肽段均有不同程度的抑制作用，因此，后續研究均采用基質配標定量以補償基質效應。

圖3 肽段NNVLQTLEK水溶液與相應空白基質配制的標準曲線Fig.3 Standard curves of aqueous solution of peptide NNVLQTLEK and blank matrices spiked with peptide NNVLQTLEK

水：Y＝5.28510×105X+4.14375×104（R2＝0.9850）；餅干：Y＝4.74455×105X+3.94923×104（R2＝0.9829）；巧克力：Y＝4.85286×105X+3.40184×104（R2＝0.9893）；飲料：Y＝5.08075×105X+5.35166×104（R2＝0.9841）。

2.4 實際樣品檢測結果

為了檢驗方法的適用性，自當地市場隨機購買了飲料、餅干和巧克力等樣品，利用所建立方法對其中的松仁含量進行定量，檢測結果如表5 所示。10 個餅干樣品中，有3 個樣品（分別為餅干-7、餅干-8以及餅干-9樣品）明確標注含有松仁成分，檢測結果顯示樣品中均檢出松仁成分，含量范圍為（0.088±0.005）～（97.972±0.455）g/kg。其余7 個餅干樣品、6 個飲料樣品和6 個巧克力樣品對于過敏原信息的標注均為“可能含有堅果”，但并未寫明具體所含堅果的種類，檢測結果顯示均未檢測出松仁。上述結果表明此方法可以應用于食品標簽準確性的驗證，同時可以篩查未明確標注松仁過敏原的食品中是否含有松仁成分。

表5 市售樣品中松仁含量Table 5 Pine nut contents in commercially available samples

3 結論

本研究開發了一種UPLC-MS/MS檢測食品中松仁過敏原Pin k 2的方法。通過蛋白質組學與高分辨質譜結合成功篩選到3 條松仁特征肽段，進一步采用三重四極桿質譜的多反應監測模式建立了食品松仁過敏原快速檢測方法。該方法具有靈敏度高、特異性好等優勢，可為我國食品標簽真實性檢驗及食品中隱性過敏原的檢測提供技術支持。