甘肅不同區域青貯紫花苜蓿乳酸菌群落特征及其驅動因子研究

唐瓔，劉曉靜，趙雅姣，董霖

（甘肅農業大學草業學院，草業生態系統教育部重點實驗室，甘肅省草業工程實驗室，中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070）

紫花苜蓿（Medicago sativa）是一種被人們廣泛種植的高蛋白豆科牧草［1］。紫花苜蓿可以進行青飼、調制青干草以及加工青貯草［2-3］。其中，青貯可以最大限度地保存紫花苜蓿的營養價值，但由于其緩沖能高且表面附生乳酸菌數目少等因素［4］，限制了高品質紫花苜蓿青貯飼料的生產［5］。為提高紫花苜蓿青貯品質，研究學者們通過添加青貯相關功能性乳酸菌來改變青貯中乳酸菌的群落結構［6］。目前已被篩選出的青貯功能菌主要有以下幾類：產酸快速及生物活性好的乳酸菌［7］，產木質素纖維酶的乳酸菌［8］，抑制青貯中有害微生物生長的乳酸菌［9］以及有促進糖轉化功能的乳酸菌等［10］，以上幾類乳酸菌通過快速增加主導青貯乳酸菌的相對豐度來影響青貯過程中乳酸菌的群落演替。同時，研究學者們還發現乳酸菌群落是青貯中最重要的微生物群落之一，它們的群落結構及物種多樣性是決定青貯發酵品質的重要因素［6，11］。目前多數關于紫花苜蓿青貯乳酸菌的研究是在可控條件下進行的理論研究，因此，在甘肅省對大規模自然青貯過程中乳酸菌群落分布特征及其影響因素進行較深入的研究，對于了解不同區域本土乳酸菌在自然青貯過程中的作用以及青貯品質的優化更具意義。

青貯紫花苜蓿中乳酸菌群落結構普遍被認為受附生乳酸菌、地域、氣候等多種因素的影響［12］。之前研究表明，四川地區植物附生乳酸菌是影響青貯后乳酸菌群落的主導因素［13］；而西南濕熱地區，溫度是影響青貯過程中乳酸菌群落結構的重要因素［14］；另有研究認為，青貯過程中的溫度變化和壓實密度對乳酸菌群落的影響也非常重要［15］。由此可以看出，青貯過程中有多種因素會影響乳酸菌群落的組成和多樣性，不同地域影響青貯過程中乳酸菌群落的因素存在差異。甘肅從河西到隴中、隴東、隴南及甘南州地區均進行紫花苜蓿大面積的種植，是中國紫花苜蓿種植及青貯飼料生產的三大主產地之一［2］，這些地區氣候差異較大，因此為了精細化調控甘肅青貯紫花苜蓿品質，需要對甘肅不同氣候區域紫花苜蓿自然青貯乳酸菌群落特征及關鍵影響因素進行深入研究。單分子實時測序技術（single molecule real-time sequencing，SMRT）是實現兆堿基級別超長測序、無擴增基因組修飾的基因測序新技術，可以多次完整讀取全基因組序列，可降低錯誤率，相較于高通量測序技術（next-generation sequencing，NGS），SMRT 能更全面地在種水平上分析乳酸菌群落［16］。通過該技術對甘肅不同區域大規模紫花苜蓿裹包青貯生產中乳酸菌群落特征及其影響因子進行研究，可為進一步精細化調控各區域紫花苜蓿青貯提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采樣點

試驗采樣點覆蓋甘肅14 個市州，每個市州選取2～3 個區域，共29 處采樣點（表1）。每個區域選擇地理氣候因子為：經度（longitude）、緯度（latitudes）、海拔（elevation）、年平均降水量（mean annual precipitation，MAP）、平均相對濕度（mean annual humidness，MAH）、年平均氣溫（mean annual temperature，MAT）、年平均日照時數（average annual sunshine duration，SD）等。本研究使用的地理氣候因子具體數據采集于中國氣象科學數據中心（https：//data.cma.cn/）（表1）。

1.2 采樣

2022 年8 月采集青貯前紫花苜蓿原料，均取生長2 年初花期的紫花苜蓿。原料取留茬10 cm 以上部分，用裁紙刀裁成3～4 cm 小段。2022 年10 月在相同采樣點采集同一批原料對應發酵48 d 后的青貯紫花苜蓿飼料。青貯后紫花苜蓿樣品，在距裹包表層30 cm 處深度取樣，每個裹包采用5 點采樣法（上、下、左、右、中）［17］。每處采樣點青貯前、青貯后樣品均取約1500 g，青貯前、青貯后樣品分別單獨充分混合后分裝成3 份樣品作為3 個重復，共174個處理，青貯前、青貯后樣品單獨進行檢測。樣品采用無菌袋包裝，冷鏈運輸至實驗室，采用蒽酮硫酸法測定可溶性碳水化合物（soluble carbohydrates，WSC），凱氏定氮法測定粗蛋白（crude protein，CP），全自動纖維測定儀法測定酸性洗滌纖維（acid detergent fiber，ADF）、中性洗滌纖維測定（neutral detergent fiber，NDF）［18］和SMRT 測定乳酸菌群落組成［16］（表2）。

表2 甘肅不同區域紫花苜蓿原料特性Table 2 Characteristics of alfalfa raw materials in different regions of Gansu （g·kg-1 DM）

1.3 乳酸菌群落分析

1.3.1 DNA 提取 每份待測樣品取50 g 置于-80 ℃冰箱冷凍，冷凍干燥粉碎后過4 mm 篩。取粉碎后樣品5 g 在室溫下球磨1 min，采用TIANamp 細菌DNA 提取試劑盒（DP502-02，天根科技有限公司，北京，中國）提取DNA。使用NanoDrop 2000 UV-vis 分光光度計（Thermo Scientific，Wilmington，美國）測定DNA 的濃度和純度，使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳評估DNA 的完整性［16］。所有提取的DNA 樣本在-20 °C 冷凍保存備用。

1.3.2 單分子實時測序構建文庫和測序 單分子實時測序使用針對乳酸菌的特異性引物，包含一組16 個核苷酸條形碼的引物27F（5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACCTTGTTACGACTT-3′）擴增16S rRNA 的全長基因［16］，用Pacific Biosciences 模板試劑盒和Pacific Bioscience Template prep kit 進行建庫。用PacBio Seque 平臺（Pacific Biosciences，Menlo Park，CA，美國）進行基因測序（上海美吉基因）。

1.3.3 序列與多樣性分析 上海美吉基因提供原始循環擴增序列（circular consensus sequencing，CCS），檢測每個樣品的CCS（準確性高于99%），并用UCHIME 網頁版（http：//drive5.com/uchime）去除嵌合序列，得到優化序列。使用Mothur（https：//mothur.org/wiki/Classify.seqs）軟件將代表性序列與Silva（http：//www.arb-silva.de）數據庫進行對比（閾值0.9）以獲取注釋分類信息。Alpha 多樣性指標（觀察物種，香農指數，辛普森指數，Chao 1 和覆蓋率）采用QIIME 2 軟件（01.2）進行加權或非加權計算。

1.4 數據分析

采用SPSS 21 統計軟件對乳酸菌群落組成和影響因素數據進行處理，使用Origin（2020）軟件對數據關聯性進行冗余分析（redundancy analysis，RDA）和層次聚類分析，甘肅省地圖從自然資源部標準地圖服務網下載（http：//bzdt.ch.mnr.gov.cn/），在甘肅省標準地圖上進行層次聚類分析數據結果標注。

2 結果與分析

2.1 甘肅省內不同區域青貯紫花苜蓿中乳酸菌群落組成及多樣性

2.1.1 青貯紫花苜蓿中乳酸菌群落組成 試驗采用SMRT 技術，在屬（圖1A）、種（圖1B）水平上對甘肅14 個市州青貯紫花苜蓿乳酸菌群落組成進行研究（青貯48 d 后）。29 處采樣點裹包青貯紫花苜蓿中共篩選到333 株乳酸菌，分別屬于乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、片球菌屬（Pediococcus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、短桿菌屬（Curtobacterium）和腸球菌屬（Enterococcusspp）（圖1A）。其中主要包含植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）133 株，占乳酸菌總數39.9%；鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）48 株，占14.4%；乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）43 株，占12.9%；戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）40 株，占13.5%；戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）31 株，占9.3%（圖1B）。氣候相似地區，主導青貯的乳酸菌群落組成相似度高，在河西干旱灌溉地區大多是植物乳桿菌，相對豐度均大于40%。在隴中、隴東干旱半干旱雨養地區，主要是植物乳酸菌、鼠李糖乳桿菌和戊糖片球菌，植物乳桿菌相對豐度為13.2%～40.2%。在雨水充沛濕熱的隴南地區以乳酸片球菌和戊糖片球菌為主。高寒的甘南州地區多數以植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌為主，植物乳桿菌相對豐度為30%～39%。

圖1 甘肅不同區域青貯紫花苜蓿乳酸菌群落組成Fig.1 Community composition of lactic acid bacteria in alfalfa silage in different regions of Gansu

2.1.2 紫花苜蓿青貯乳酸菌多樣性 通過SMRT 平臺檢測，174 個樣品總共檢測到2514474 條CCS，平均每個樣本9634 條有效CCS。青貯紫花苜蓿乳酸菌Alpha 多樣性指數見表3，所有樣本的覆蓋率均在93%以上，說明本試驗乳酸菌多樣性測序結果能代表樣本的真實情況。青貯48 d 后，除臨夏州外，其他地區乳酸菌Alpha 多樣性中香農指數（Shannon-Wiener）均呈下降變化趨勢。青貯后，張掖（5.61）、白銀（5.37）地區Alpha 多樣性中香農指數最高，兩者沒有統計學差異（P>0.05）。金昌地區的紫花苜蓿青貯乳酸菌Alpha 多樣性從青貯開始最高（香農指數7.31）降到青貯48 d 后最低（香農指數3.42）。

表3 甘肅不同區域紫花苜蓿青貯乳酸菌Alpha 多樣性指數Table 3 Alpha diversity index of alfalfa silage lactic acid bacteria in different regions of Gansu

2.2 影響青貯紫花苜蓿中乳酸菌組成驅動因子

對氣候因子、原料特性和附生乳酸菌群落主要菌屬相對豐度與青貯紫花苜蓿中乳酸菌主要菌屬相對豐度進行冗余分析（圖2），影響因素為解釋變量，青貯紫花苜蓿中乳酸菌相對豐度為響應變量。發現氣候因子、紫花苜蓿原料、附生乳酸菌群落等因素可很好地解釋青貯紫花苜蓿中乳酸菌群落組成（解釋度為96.39%），其中紫花苜蓿附生乳酸菌群落對青貯后乳酸菌群落組成影響最大（解釋度為88.27%），附生的乳酸桿菌屬、片球菌屬對青貯后乳酸菌群落結構起主要作用，兩者呈負相關。青貯紫花苜蓿中乳酸菌群落各因素影響度依次是：附生乳酸菌群落>氣候因素>原料特性。

圖2 青貯紫花苜蓿乳酸菌群落與影響因子冗余分析Fig.2 Redundancy analysis of lactic acid bacteria community of alfalfa silage and influencing factor

2.3 甘肅省內不同區域紫花苜蓿附生乳酸菌群落組成與分布特征

2.3.1 紫花苜蓿附生乳酸菌群落組成 甘肅不同區域29 處采樣點紫花苜蓿原料共篩選到597 株附著野生乳酸菌（圖3），分別屬于乳酸桿菌屬、片球菌屬、魏斯氏菌屬、短桿菌屬和腸球菌屬（圖3A）。其中主要包含植物乳桿菌178 株，占乳酸桿菌總數29.82%；鼠李糖乳桿菌28 株，占4.69%；副干酪乳桿菌 40 株，占6.70%；布氏乳桿菌 46 株，占7.71%；戊糖乳桿菌 38 株，占6.37%；戊糖片球菌42 株，占7.04%；乳酸片球菌11 株，占1.84%；類腸膜魏斯氏菌（Weissella paramesenteroides）7 株，占1.17%；食竇魏斯氏菌（Weissella cibaria）7 株，占1.17%；短乳桿菌（Lactobacillus brevis）42 株，占7.04%；糞腸球菌（Enterococcus faecalis）42 株，占7.04%（圖3B）。紫花苜蓿附生乳酸菌群落組成，在河西干旱灌溉區域大多是植物乳桿菌、副干酪乳桿菌、戊糖片球菌、糞腸球菌、短乳桿菌等；在隴中、隴東干旱半干旱雨養區域，主要是植物乳酸菌、副干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、戊糖片球菌，布氏乳桿菌、類腸膜魏斯氏菌等；在雨水充沛濕熱的隴南地區主要為乳酸片球菌、戊糖片球菌、糞腸球菌等；高寒的甘南州地區多數是植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、戊糖片球菌、乳酸片球菌、發酵乳桿菌等。同一區域青貯原料和對應青貯48 d 后的乳酸菌群落比較，青貯過程中乳酸菌群落演替規律大致為植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、戊糖片球菌、乳酸片球菌相對豐度增加，副干酪乳桿菌、布氏乳桿菌、類腸膜魏斯氏菌、食竇魏斯氏菌、短乳桿菌、糞腸球菌相對豐度降低。

圖3 甘肅不同區域紫花苜蓿原料附生乳酸菌群落組成Fig.3 Community composition of Lactobacillus epiphyticus of alfalfa raw materials in different regions of Gansu

2.3.2 紫花苜蓿附生乳酸菌群落分布特 通過層次聚類分析29 處采樣點紫花苜蓿附生乳酸菌群落組成差異，根據各采樣點乳酸菌群落差異值到中心線的歐式距離進行聚類，乳酸菌群落相似性程度高的區域聚為一類，29 處采樣點乳酸菌群落可分為5 類（圖4）。發現除部分區域（如JY、JYG、JD、BJ、LX 等）外，大部分區域乳酸菌群落層次聚類結果與甘肅4 個已劃分的氣候區域高度擬合。

圖4 甘肅不同地區乳酸菌群落聚類與氣候區域擬合圖Fig.4 Clustering of lactic acid bacteria communities in different regions of Gansu with climate region fitting

2.4 紫花苜蓿附生乳酸菌群落與影響因子關聯分析

對部分氣候因子、紫花苜蓿原料與附生乳酸菌群落進行冗余分析顯示（圖5），氣候因子、紫花苜蓿原料共同影響附生乳酸菌群落組成（解釋度為94.58%）。其中氣候因子是影響附生乳酸菌群落組成的重要因素（解釋度為72.15%），選取的氣候因素影響度依次為：年平均氣溫>年平均降水量>平均相對濕度>年平均日照時數>海拔>緯度>經度。緯度、海拔、SD、WSC、CP 與附生的乳酸桿菌屬呈正相關，與片球菌屬呈負相關；MAT、MAP、MAH、ADF、NDF 與附生的乳酸桿菌屬呈負相關，與片球菌屬呈正相關。

圖5 紫花苜蓿附生乳酸菌群落與影響因子冗余分析Fig.5 Redundancy analysis of epiphytic lactic acid bacteria community of alfalfa and influencing factors

3 討論

本研究發現，在甘肅不同區域進行紫花苜蓿自然青貯其乳酸菌的群落結構具有區域性分布特征。在河西干旱灌溉區域，如武威、金昌、張掖等地，乳酸菌群落以植物乳桿菌為主；在隴中、隴東干旱半干旱雨養區域，如定西、天水、隴南等地，乳酸菌群落以植物乳酸菌、鼠李糖乳桿菌和戊糖片球菌為主要菌屬；在雨水充沛濕熱的隴南區域，乳酸菌群落以乳酸片球菌和戊糖片球菌為主；在高寒的甘南州區域，如甘南、臨夏等地，乳酸菌群落以植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌為主。該結果與前人一些研究類似，如Jia 等［19］研究河北省溫熱地區青貯紫花苜蓿中乳酸菌群落結構發現其中乳桿菌屬和明串球菌屬（Leuconstoc）是主要優勢菌屬。Lv 等［20］研究發現黑龍江干旱寒冷地區青貯紫花苜蓿中乳酸菌群落以乳桿菌屬為主導。因此可以推斷，青貯紫花苜蓿中乳酸菌的群落特征會隨地域、氣候的不同而不同。而對于地域相近，氣候相似的地區，紫花苜蓿青貯中主要的乳酸菌種類相似度較高，該現象也被Peng 等［21］和許冬梅等［22］證實，即同一品種材料在不同氣候區青貯后其乳酸菌群落不同，而在氣候相似區域主導青貯的乳酸菌相似度較高。因此，紫花苜蓿青貯后的乳酸菌在甘肅不同氣候區下呈現規律性的變化。

由于甘肅不同氣候區下紫花苜蓿青貯中乳酸菌的群落結構出現規律性的變化，因而推測氣候因素及附生乳酸菌等對其產生了一系列的影響，然而這些因素如何對其產生影響還需進一步研究。本研究通過冗余分析發現，紫花苜蓿附生乳酸菌群落結構是影響青貯乳酸菌群落組成的關鍵因素，這可能是因為紫花苜蓿附生乳酸菌在青貯過程中抑制了其他菌群的生長，同時促進了優勢菌群的發展，并且增加了乳酸含量，減少了其他酸累積，從而主導青貯中微生物群落演替和發酵模式，最終決定青貯后乳酸菌群落結構。Guo 等［13］同樣認為，自然青貯中乳酸菌群落演替是自發的過程，依賴于附生乳酸菌群落的自然發生。Sun 等［23］、Ren 等［24］也發現在青貯全株玉米（Zea mays）和青貯甘蔗（Saccharum officinarum）中，附生乳酸菌群落影響青貯后的乳酸菌群落結構。本研究還發現附生乳酸菌中的乳酸桿菌屬和片球菌屬對青貯后的乳酸菌群落影響較大，但是兩者相對豐度呈負相關，這與Ren 等［24］發現在青貯甘蔗中乳酸桿菌屬與乳球桿菌屬兩者相對豐度呈負相關結果一致，這可能是因為乳酸桿菌屬和片球菌屬在青貯紫花苜蓿中具有不同的生態角色和代謝途徑。乳酸桿菌屬是產生乳酸的革蘭氏陽性菌，通常在酸性環境下生長和代謝，能夠降低pH 值并產生乳酸作為底物。而片球菌屬則是革蘭氏陽性菌，通常在中性或微堿性環境下生長和代謝，能夠分解多糖和蛋白質為簡單的有機物質，如氨基酸和單糖。因此，當乳酸桿菌屬相對豐度增加，大量產乳酸，pH 下降，片球菌屬相對豐度會降低，反之亦然［25］。本研究雖然發現青貯后乳酸菌群落也受氣候因素和原料化學成分的影響，但是影響度相較于附生乳酸菌群落小，該現象同樣被Guan 等［14］研究證實。這可能是因為氣候因素和原料特性盡管會影響青貯中某些特定微生物，但是像植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、戊糖片球菌這些在青貯中起主要作用的乳酸菌并未受影響，當青貯完全進入厭氧狀態后，青貯環境因素及原料因素對青貯中主要乳酸菌影響度降低。因此，附生乳酸菌的種類及豐度會直接影響紫花苜蓿青貯乳酸菌的群落結構與組成。

甘肅有四大類氣候區域［26］，不同區域紫花苜蓿附生乳酸菌群落結構有很大差異，試驗依據層次聚類分析發現甘肅紫花苜蓿附生乳酸菌可以歸為5 類，基本與甘肅已劃分氣候區域擬合。Rastogi 等［27］和Finkel 等［28］的研究也發現類似現象，即不同地區同一品種的玉米附生乳酸菌群落與氣候區域劃分相關聯。本研究隨后通過冗余分析確定，選取的氣候因素是影響紫花苜蓿附生乳酸菌群落的最主要因素，其中年平均氣溫和年平均降水量對葉際附生乳酸菌影響最大。這是因為植物葉際環境條件相對嚴苛，可被利用的養分較少，溫度、濕度、降水量、紫外線強度等氣候因子對葉際微生物的定殖影響很大，附生微生物群落差異也與這些因素密切相關，而氣候因素決定了一個地區的環境條件（如土、水、氣、熱等）［29］，所以氣候因素直接影響附生乳酸菌群落結構組成。之前相關研究也證實，季節因素是影響苜蓿葉層細菌群落結構的最主要因素，其中溫度、濕度、降水、日照等均是影響植物表面微生物多樣性的重要因素［30］。此外，本研究還發現選取的氣候因素中，年平均氣溫、年平均降水量與乳酸桿菌屬相對豐度呈顯著負相關，這與Gras 等［31］的研究結果相似，即溫度、降水量可顯著降低乳桿菌屬相對豐度；然而Guan等［32］卻發現，溫度與全株玉米附生乳桿菌屬相對豐度呈正相關。這可能是因為溫度、降水量作為一個重要的非生物環境變量，影響微生物群落的組成，溫度能影響微生物對環境的適應及生長繁殖，主導乳酸菌群落中關鍵菌的相對豐度［33］，而降水量影響微生物生存環境中的水分和pH 值，篩選適應環境的微生物，決定附生微生物群落結構［34］，所以溫度和降水是保證關鍵乳酸菌良好生長的重要因素，過高或過低均會影響其生長。綜上，氣候因素是影響紫花苜蓿原料附生乳酸菌群落組成和多樣性的關鍵因素，而附生乳酸菌主導青貯過程中乳酸菌群落演替。因此，氣候因子間接影響青貯后乳酸菌群落呈區域性規律分布。

4 結論

通過對甘肅不同區域青貯紫花苜蓿中乳酸菌群落組成和多樣性進行研究，發現甘肅青貯紫花苜蓿乳酸菌群落呈地域性分布，在河西干旱灌區，以植物乳桿菌為主；隴中、隴東干旱半干旱灌溉區以植物乳酸菌、鼠李糖乳桿菌和戊糖片球菌為主要菌屬；隴南濕熱區，以乳酸片球菌和戊糖片球菌為主；甘南州高寒區以植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌為主。

研究還發現，影響甘肅不同區域青貯紫花苜蓿中乳酸菌群落區域分布的關鍵因素是紫花苜蓿葉際自然附生乳酸菌，而區域性氣候條件中年平均溫度和年平均降水量是影響紫花苜蓿葉際附生乳酸菌的關鍵因素。因此，區域性氣候條件通過決定紫花苜蓿附生乳酸菌種類是主導青貯乳酸菌群落呈區域性分布特征的驅動因素。