促紅細胞生成素對正畸牙復發大鼠牙周組織改建及Wnt/β-catenin信號通路的影響

賈 慧,康 凱,楊 磊

(邯鄲市口腔醫院,河北 邯鄲 056001)

牙齒畸形可由多種因素引起,其發病原因除了先天的遺傳因素影響之外,后天的環境因素同樣發揮重要作用[1]。畸形牙齒不僅會影響患者正常的生活能力,也會對面部的形象造成影響[2]。正畸牙往往是通過機械手段改變畸形牙的位置,通過骨改建改善牙周組織進行治療,但往往因為畸形早已形成的內在作用導致牙齒復位[3]。因此,在通過機械矯正牙齒畸形的同時,利用具有針對性的治療藥物避免牙齒位置移動并緩解正畸牙復發,成為當下研究的重中之重[4]。畸形牙的復發受多種影響因子的調控,其中,Wnt/β-連環蛋白(β-catenin)信號通路被證實在牙槽骨的形成和牙周組織的恢復過程中發揮重要作用[5]。Wnt蛋白家族可調節內源性骨量,同時促進β-catenin的釋放,導致β-catenin在細胞內大量積累,Wnt和β-catenin的進一步結合,可以促進成骨分化,改善骨量[6-7]。促紅細胞生成素作為一種激素樣物質,可以顯著促進紅細胞生成,被認為是治療貧血等癥狀的藥物[8]。近年來有研究[9]證實,促紅細胞生成素可以促進人類牙髓細胞的增殖,參與調節牙齒的骨質分化,促進牙槽骨的形成,但其作用機制尚未明確。促紅細胞生成素還可參與調控Wnt/β-catenin信號通路,促進牙周膜干細胞的進一步分化,加速骨質形成[10];推測其可能在正畸牙復發過程中通過調控Wnt/β-catenin信號通路,對牙周組織改建產生影響,但需要進一步驗證。故本研究通過構建大鼠正畸牙復發模型,探究相關機制,討論促紅細胞生成素作為藥物參與治療正畸牙復發的可能性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物:從杭州啟真實驗動物科技公司購進10周齡的雄性SD大鼠(SPF級,體重343～362 g),生產許可證號SCXK(浙)2022-0005,飼養于溫度24～28 ℃,濕度55%～62%,12 h光照晝夜交替的環境中,自由飲水進食。本研究經邯鄲市口腔醫院倫理委員會批準。

1.1.2 主要藥物與試劑及儀器:促紅細胞生成素(批號LK29422)購自上海高創化學科技公司;Wnt/β-catenin抑制劑(KYA1797K)(批號MJ1903)購自武漢科斯坦生物公司;蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(批號LD49144)、通用免疫組化檢測試劑盒(批號LD29922)、Trizol試劑(批號LD17952)、蛋白裂解液(批號LD52191)、BCA試劑盒(批號LD49192)、鼠源骨形態發生蛋白(BMP)2(批號XY28494)、BMP4(批號XY49957)一抗、羊抗鼠二抗(批號XY28550)均購自山東綠都生物技術公司;反轉錄試劑盒(批號LK48292)、PCR試劑盒(批號LK45892)、兔源Wnt(批號XY41164)、β-catenin(批號XY38118)一抗、羊抗兔二抗(批號XY42925)均購自南京龍葵生物科技公司;顯微鏡(型號IXplore Standard)、熒光定量PCR儀(型號Prism 7000)、蛋白成像儀(型號LF-G500)均購自北京龍方科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠正畸牙移動模型建立及分組給藥:參照文獻[11]構建大鼠正畸牙移動模型,麻醉大鼠,仰臥位固定,于大鼠上頜左側第一磨牙加裝加力裝置,施加50 g近中拉力,彈簧拉力器校準作用力大小,持續加力20 d,期間各組大鼠飲食正常,觀察并防止加力裝置脫落,建立大鼠正畸牙移動模型。20 d后,將48只正畸牙模型大鼠隨機分為模型組、促紅細胞生成素低(250 IU/kg)、高(500 IU/kg)劑量組[12]、促紅細胞生成素(500 IU/kg)+KYA1797K(25 mg/kg)組[13],每組12只,分組后拆除各組大鼠加力裝置,進行麻醉,制備印模,測量第一磨牙和第二磨牙之間遠中溝間的距離,記為A0。另取12只健康大鼠作為對照組(不進行任何處理)。促紅細胞生成素低、高劑量組大鼠腹腔注射250、500 IU/kg的促紅細胞生成素[12];促紅細胞生成素+KYA1797K組大鼠腹腔注射500 IU/kg的促紅細胞生成素和25 mg/kg的KYA1797K[13];對照組、模型組大鼠腹腔注射等體積0.9%氯化鈉溶液。各組注射每天1次,連續30 d。

1.2.2 正畸牙復發情況檢測:分別于取下加力裝置第10、20、30 天麻醉大鼠,制備印模后石膏灌注,對石膏模型進行標記分組,利用3D掃描儀對模型進行掃描,測量第一磨牙和第二磨牙之間遠中溝間的距離,分別記作A10、A20、A30。計算復發距離得出復發率,作為評定大鼠復發情況的判斷依據,計算公式如下:復發率=(A0-An)/A0×100%;An分別為A10、A20、A30。

1.2.3 牙周組織病理學變化觀察:末次腹腔注射給藥24 h后,麻醉大鼠,仰臥位固定于操作臺上,手術刀剖開牙齒周圍表面皮膚,切取上頜左側第一磨牙及其周圍的牙周組織,取部分牙周組織液氮處理研磨至粉凍存備用;另一部分牙周組織置于4%多聚甲醛中固定24 h,加入EDTA脫鈣劑進行脫鈣處理,常規脫水包埋制成石蠟切片。選取部分切片,按照HE染色試劑盒說明書方法染色,上鏡觀察染色結果。

1.2.4 免疫組化檢測牙周組織BMP2、BMP4表達水平:隨機選出每只大鼠5張切片,滴加3% H2O2處理10 min,蒸餾水反復清洗3次,滴加0.1%膜蛋白酶37 ℃預熱處理20 min,修復抗原,切片上滴加山羊血清,室溫孵育30 min,滴加鼠源一抗(BMP2、BMP4,稀釋比均為1∶680),4 ℃孵育過夜,PBS緩沖液反復清洗3次。滴加羊抗鼠二抗(稀釋比為1∶1800),37 ℃孵育45 min。以通用免疫組化檢測試劑盒進行免疫組織化學染色,置于顯微鏡下觀察染色結果,每張切片選取5個視野,利用軟件(Image Pro Plus 6.0)計算BMP2、BMP4表達(平均光密度值),平均光密度值越大代表表達越強。

1.2.5 牙周組織Wnt、β-catenin mRNA表達水平檢測:取出部分凍存備用的牙周組織粉末,Trizol試劑提取其總RNA,反轉錄為cDNA。熒光定量PCR法檢測牙周組織Wnt、β-catenin mRNA水平(以GAPDH為內參),引物由廣州展晨生物科技公司設計、合成。反應體系共30 μl:cDNA 2 μl、緩沖液5 μl、dNTPs 4 μl、正反向引物各1 μl、DNA聚合酶1 μl、ddH2O 16 μl。擴增條件:94 ℃持續9 min,94 ℃持續17 s,62 ℃持續23 s,72 ℃持續31 s,共40個循環,被測mRNA水平使用相對基因定量方法(2-ΔΔCt法)計算。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.6 牙周組織Wnt、β-catenin蛋白表達水平檢測:取剩余凍存的牙周組織粉末,加入1 ml裂解液充分振蕩,確保蛋白裂解充分,BCA蛋白檢測試劑盒定量蛋白濃度,定量后加熱變性,電泳分離后轉膜,脫脂牛奶封閉2 h,加入兔源一抗Wnt(1∶1120)、β-catenin(1∶1270)、GAPDH(1∶1350),常溫孵育12 h,洗滌,再將膜與稀釋比為1∶2400的羊抗兔二抗室溫下孵育2 h,洗滌后,ECL試劑顯色,Image J軟件分析蛋白條帶灰度值,計算目標蛋白表達水平。

2 結 果

2.1 各組大鼠正畸牙復發率比較 與對照組相比,模型組大鼠各時間段正畸牙復發率顯著升高(均P<0.05);與模型組相比,促紅細胞生成素低、高劑量組大鼠各時間段正畸牙復發率依次降低(均P<0.05);與促紅細胞生成素高劑量組相比,促紅細胞生成素+KYA1797K組大鼠各時間段正畸牙復發率顯著升高(均P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠正畸牙復發率比較(%)

2.2 各組大鼠牙周組織病理變化 對照組大鼠牙周組織中纖維排列緊密,細胞整齊分布;模型組牙周組織中纖維分散,細胞間排列間隙大,牙槽骨表面有少量成骨細胞排列,沒有明顯的細胞牙骨質;促紅細胞生成素低、高劑量組大鼠牙周組織中纖維分布逐漸密集,成骨細胞和細胞牙骨質逐漸增多;促紅細胞生成素+KYA1797K組較促紅細胞生成素高劑量組大鼠牙周組織纖維分布分散,存在大量細胞間隙,成骨細胞和細胞牙骨質減少。見圖1。

A:對照組;B:模型組;C:促紅細胞生成素低劑量組;D:促紅細胞生成素高劑量組;E:促紅細胞生成素+KYA1797K組

2.3 各組大鼠牙周組織BMP2、BMP4表達水平比較 與對照組相比,模型組大鼠牙周組織BMP2、BMP4表達顯著升高(均P<0.05);與模型組相比,促紅細胞生成素低、高劑量組大鼠牙周組織BMP2、BMP4表達依次升高(均P<0.05);與促紅細胞生成素高劑量組相比,促紅細胞生成素+KYA1797K組大鼠牙周組織BMP2、BMP4表達顯著降低(均P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠牙周組織BMP2、BMP4表達水平比較

2.4 各組大鼠牙周組織Wnt、β-catenin mRNA表達水平比較 與對照組相比,模型組大鼠牙周組織Wnt、β-catenin mRNA表達水平顯著升高(均P<0.05);與模型組相比,促紅細胞生成素低、高劑量組大鼠牙周組織Wnt、β-catenin mRNA水平依次升高(均P<0.05);與促紅細胞生成素高劑量組相比,促紅細胞生成素+KYA1797K組大鼠牙周組織Wnt、β-catenin mRNA水平顯著降低(均P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠牙周組織Wnt、β-catenin mRNA表達水平比較

2.5 各組大鼠牙周組織Wnt、β-catenin蛋白表達水平比較 與對照組相比,模型組大鼠牙周組織Wnt、β-catenin蛋白水平顯著升高(均P<0.05);與模型組相比,促紅細胞生成素低、高劑量組大鼠牙周組織Wnt、β-catenin蛋白水平依次升高(均P<0.05);與促紅細胞生成素高劑量組相比,促紅細胞生成素+KYA1797K組大鼠牙周組織Wnt、β-catenin蛋白水平顯著降低(均P<0.05)。見表5。

表5 各組大鼠牙周組織Wnt、β-catenin蛋白表達水平比較

3 討 論

牙齒畸形發病概率較高,對多數患者造成嚴重困擾,往往通過機械治療即可矯正畸形牙齒,但復發概率高,嚴重時造成病情反復,對患者形象產生巨大影響,因此通過藥物治療緩解病情復發成為研究的熱點[14-15]。常規染色和檢測正畸牙復發率是判斷正畸牙復發程度的重要指標[16]。本研究通過構建正畸牙復發大鼠模型,發現模型組大鼠各時間段正畸牙復發率較高,牙周組織中纖維分散,有少量成骨細胞生成,沒有明顯的細胞牙骨質。表明大鼠正畸牙復發的程度明顯,骨質生成緩慢,具有典型的正畸牙復發癥狀。

促紅細胞生成素具有促進紅細胞生長的作用,近年來已被證實參與調控牙齒生長,高劑量的促紅細胞生成素作用可促進牙髓細胞的生長,促進牙齒固定[17]。促紅細胞生成素也可加速牙槽骨的骨質分化,促進牙齒定型,防止牙齒錯位[18]。因而推測促紅細胞生成素可作用于正畸牙,快速固定牙齒,防止牙齒復位。本研究發現使用不同劑量促紅細胞生成素作用于正畸牙復發大鼠后,結果顯示大鼠各時間段正畸牙復發率顯著降低,牙周組織中纖維分布逐漸密集,成骨細胞和細胞牙骨質逐漸增多,且促紅細胞生成素劑量越高效果越好;表明促紅細胞生成素可快速形成骨質成分,抑制正畸牙復發,但具體的作用機制有待探索。BMP蛋白家族可參與誘導骨髓細胞分化為成骨細胞,其中BMP2、BMP4蛋白是骨質形成中的關鍵蛋白[19-20]。BMP2、BMP4的高表達可促進骨質的快速形成,被認為是骨改建能力判定的重要標志[21-22]。本研究發現,模型組大鼠牙周組織BMP2、BMP4表達較對照組顯著升高,不同劑量促紅細胞生成素干預后,牙周組織BMP2、BMP4表達進一步升高,且促紅細胞生成素劑量越高效果越明顯;表明促紅細胞生成素可促進BMP2、BMP4蛋白表達,進一步促進骨質生成和骨化,加速牙齒固定,緩解正畸牙復發。

有研究指出Wnt/β-catenin信號通路在牙槽骨形成過程中發揮重要作用,Wnt/β-catenin信號通路參與牙周膜干細胞的分化,促進成骨組織快速生成[23-24]。Wnt、β-catenin的高表達可參與影響牙本質的形成和再生,進一步促進牙根發育[25]。本研究發現,模型組大鼠牙周組織Wnt、β-catenin mRNA和蛋白水平較對照組顯著升高;不同劑量促紅細胞生成素干預后,大鼠牙周組織Wnt、β-catenin mRNA和蛋白水平進一步升高,且促紅細胞生成素劑量越高Wnt、β-catenin mRNA和蛋白水平升高效果越好;表明促紅細胞生成素可能通過調控Wnt/β-catenin信號通路發揮促進牙周組織改建,減緩大鼠正畸牙復發的作用。為進一步驗證,本研究在高劑量促紅細胞生成素的基礎上使用Wnt/β-catenin抑制劑KYA1797K進行干預,發現KYA1797K能部分逆轉高劑量促紅細胞生成素對大鼠正畸牙復發的改善效果;進一步證實促紅細胞生成素通過激活Wnt/β-catenin信號通路抑制大鼠正畸牙復發。

綜上所述,促紅細胞生成素可能通過激活Wnt/β-catenin信號通路,加速骨質生成,促進牙周組織改建,減緩大鼠正畸牙復發。但促紅細胞生成素是否通過其他通路間接參與調控,還需要進一步的實驗加以說明。