腫瘤壞死因子-α、可溶性血管內皮生長因子受體-1在妊娠期高血壓疾病大鼠血清及胎盤中的表達水平及意義

王 艷,時玲玲,吳桂杰,李 霞,趙芳瑩

(滄州市人民醫院產科,河北 滄州 061000)

妊娠期高血壓疾病(Hypertensive disorders complicating pregnancy,HDCP)是一種妊娠期特發病,誘發因素眾多,病情復雜,臨床表現以血壓升高、蛋白尿及浮腫等表現為主,其病情也與新生兒不良結局發生有關,也是導致孕婦和胎兒死亡的主要原因之一[1-2]。正常妊娠是一種成功的自然半同種異體移植過程,有賴于母胎間免疫平衡,一旦免疫失衡就可能引起免疫排斥反應,導致病理妊娠[3]。腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)是一種機體重要的促炎因子,由單核細胞、淋巴細胞及免疫激活的內皮細胞等分泌,正常妊娠時,TNF-α水平較低,若機體出現免疫紊亂或炎性反應時,TNF-α表達水平升高[4]。孕婦體內的炎癥應答機制被激活后,易引起血管內皮功能障礙,可溶性血管內皮生長因子受體-1(soluble fms-like tyrosine kinase receptor 1,sFlt-1)是血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)受體之一,對于胎盤絨毛膜血管形成、滋養層細胞侵襲及分化和胚胎發育有調節作用,其異常表達與HDCP發病密切相關[5-6]。基于此,本研究探討了TNF-α、sFlt-1在HDCP大鼠血清及胎盤中的表達,為進一步對HDCP的防治提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雌性SD大鼠40只,雄性SD大鼠20只,SPF級,體重180～200 g,自西安交通大學實驗動物中心購入,動物飼養條件:20～23 ℃,濕度60%～70%,明暗各12 h,自由飲水、攝食。

1.2 主要試劑和儀器 L-精氨酸甲酯(上海源葉生物科技有限公司,貨號S20013);反轉錄試劑盒(上海雅吉生物科技有限公司,貨號D1801XL);BCA蛋白濃度測定試劑盒、PSB緩沖液(上海源葉生物科技有限公司,貨號R21250、R22379);RIPA蛋白裂解液、總RNA提取、Trizol試劑(上海聯邁生物工程有限公司,貨號LM3201-1、LM-21087R、LM0016);蘇木素-伊紅染色(HE)試劑盒(上海撫生實業有限公司,貨號FS-10-17869);實時熒光定量PCR儀、光學顯微鏡(日本 Olympus公司);電泳儀(美國 Bio-Rad公司);多功能凝膠成像系統(美國Syngene公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組與模型制備:將雌性和雄性SD大鼠按照2∶1的比例合籠混養,于次日收集雌性大鼠陰道分泌物,用于鏡下觀察,當發現精子時則為妊娠第1天,選取20只雌性大鼠分為對照組和模型組,模型組大鼠于妊娠第14天起,每日皮下注射L-精氨酸甲酯125 mg/kg,1次/d,連續7 d,對照組大鼠給予等量0.9%氯化鈉溶液灌胃,妊娠21 d時,行血壓及尿蛋白檢測,若模型組孕鼠血壓較對照組升高≥20 mmHg,尿蛋白≥(+)時,則表示造模成功。

1.3.2 孕鼠血壓及24 h尿蛋白檢測:分別于妊娠第14、21天測定大鼠血壓,并將大鼠放入代謝籠中進行24 h尿液采集,測定尿液尿蛋白含量。

1.3.3 胎盤及血液標本采集:于妊娠第21天,將大鼠麻醉后采集腹主動脈血液標本,同時剖宮取出胎鼠,測定各組胎鼠身長、體重及胎盤重量,并分離胎盤組織,置入-80 ℃冰箱冷凍保存,用于后續實驗。

1.3.4 血清TNF-α、sFlt-1水平測定:取各組大鼠血液標本,3000 r/min離心15 min后將上清收集,存于-80 ℃中,用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定血清TNF-α、sFlt-1水平,試劑盒購自武漢益普生物科技有限公司(貨號CSB-E11987r、MM-44222R1)。

1.3.5 HE染色:取各組大鼠胎盤組織,經脫水、透明、浸蠟、包埋及切片等步驟后,行HE染色再封片(中性樹膠),放于光學顯微鏡下觀察胎盤組織結構變化。

1.3.6 Tunel法檢測胎盤組織細胞凋亡:取胎盤組織石蠟切片,先脫蠟和水化,再用PBS緩沖液沖洗2次,蛋白酶K處理15 min,2% H2O2處理5 min,經PBS沖洗2次,加Tunel反應液37 ℃避光30 min,每張切片隨機取5個視野,熒光顯微鏡下觀察,陽性細胞為棕色顆粒。

1.3.7 Western blot法檢測各組大鼠胎盤組織中TNF-α、sFlt-1蛋白表達:取胎盤組織放入RIPA裂解液中,12000 r/min離心10 min后取上清液,BCA檢測蛋白濃度,蛋白上樣10 μg電泳,將電泳分離得到的樣本,移到PVDF膜上固定,并封閉1 h(10%山羊血清),先一抗孵育過夜(4 ℃)后,加二抗(常溫)孵育1 h,選β-actin為內參,經洗膜、顯色后,成像拍照后做灰度值統計分析。

2 結 果

2.1 兩組胎鼠發育情況比較 HDCP組胎鼠重量、胎盤重量、胎鼠身長均低于對照組,差異有統計學意義(均P<0.05),見表1。

表1 兩組胎鼠發育情況比較

2.2 兩組大鼠血壓及24 h尿蛋白含量比較 HDCP組大鼠妊娠21 d血壓及尿蛋白含量高于妊娠14 d,HDCP組大鼠妊娠14、21 d血壓及尿蛋白含量高于對照組,差異有統計學意義(均P<0.05),見表2。

表2 兩組大鼠血壓及24 h尿蛋白含量比較

2.3 兩組大鼠胎盤組織結構比較 HE染色觀察對照組大鼠胎盤組織形態和結構正常,細胞完整。HDCP組大鼠胎盤組織細胞結構不完整,絨毛數目減少,且絨毛大部分不成熟,滋養層細胞代償性增殖。見圖1。

圖1 兩組大鼠胎盤組織結構比較(HE染色,×400)

2.4 兩組大鼠胎盤組織細胞凋亡情況比較 Tunel檢測胎盤細胞凋亡,凋亡細胞顯示棕色,對照組胎盤組織凋亡細胞較少,HDCP組胎盤組織中細胞凋亡率高于對照組(P<0.05),見圖2。

注：與對照組比較,*P<0.05

2.5 兩組大鼠血清TNF-α、sFlt-1表達水平比較 HDCP組大鼠血清TNF-α、sFlt-1表達水平高于對照組(均P<0.05),見表3。

表3 兩組大鼠血清TNF-α、sFlt-1表達水平比較(pg/ml)

2.6 兩組大鼠胎盤組織中TNF-α、sFlt-1蛋白表達情況比較 HDCP組胎盤組織中TNF-α、sFlt-1蛋白表達水平高于對照組(均P<0.05),見圖3。

注：與對照組比較,*P<0.05

3 討 論

HDCP是指妊娠中晚期由于不明原因引起血壓持續升高,該病發展急驟,可對孕婦多個器官造成損害,導致胎盤供血、供氧異常,影響胎兒生長發育,出現胎兒生長受限、早產等不良妊娠結局[7-8]。本研究通過皮下注射L-精氨酸甲酯建立HDCP模型,發現胎鼠重量、胎盤重量減輕,胎鼠身長小于對照組,HDCP大鼠妊娠21 d血壓及尿蛋白含量高于妊娠14 d,HDCP大鼠妊娠14、21 d血壓及尿蛋白含量高于對照組,且胎盤組織細胞結構不完整,絨毛數目減少,絨毛大部分不成熟,胎盤細胞凋亡率較高,提示HDCP大鼠蛋白尿、血壓升高,胎盤受損,胎鼠發育異常,進一步表明造模成功[9]。

研究表明,正常妊娠期間細胞免疫以Th2型免疫為主。而發生HDCP則以Th1型免疫反應為主,即Th1/Th2關系失調,通過分泌IL-1、IL-2、TNF表現出免疫殺傷,并使內皮細胞結構、功能受損,影響胎盤組織血管發育和血供[10-12]。本研究對大鼠血清及胎盤組織TNF-α、sFlt-1表達水平進行檢測,HDCP組大鼠血清及胎盤組織TNF-α、sFlt-1表達水平高于對照組,證實了血清及胎盤組織TNF-α、sFlt-1水平升高是HDCP發生的重要因素。其機制可能是TNF-α刺激了內皮細胞黏附分子表達[13]。正常情況下黏附分子表達很少,當受到TNF-α等細胞因子刺激時,血管內皮細胞功能出現紊亂,收縮血管物質和舒張血管物質分泌失衡,破壞血管調節功能,使滋養細胞侵入功能異常,螺旋小動脈生理重鑄不能正常進行,引起了全身小動脈痙攣,出現外周阻力增加,出現血壓升高、體液蛋白外滲等情況[14-17]。繼而出現胎盤低灌注和缺氧,激活了sFlt-1基因的啟動子區域中的低氧反應元件,使胎盤合成釋放更多的sFlt-1,胎盤局部和血循環中的sFlt-1也隨之增加,過度抑制由VEGF介導的血管生成作用,胎盤血管生長受阻,無法滿足胎兒發育需求[18-21]。張凱歌等[22]發現,丹參川芎嗪注射液有擴張血管、改善血液微循環的效果,能降低血壓及利尿,HDCP大鼠經丹參川芎嗪注射液干預后,胎盤sFlt-1表達水平降低,PLGF表達水平升高。熊智慧等[23]研究證實了,hucMSCsexo改善血管內皮功能是可通過上調VEGF表達,下降sFlt-1 的表達來發揮作用的。張蕊等[24]觀察到妊娠高血壓患者外周血可伴多種炎性因子異常表達,包括:IL-12、TNF-α,且兩者與不良妊娠結局和病情嚴重程度有關。李玲等[25]給予妊娠高血壓大鼠苦參堿及硫酸鎂干預,發現能抑制大鼠胎盤組織中JAK2、STAT3磷酸化,減輕炎性反應(TNF-α、IL-6水平降低)及氧化應激,緩解內皮損傷。

綜上所述,TNF-α、sFlt-1高表達可能與妊娠期高血壓疾病發生密切相關,減輕炎性反應導致的內皮損傷,可能為臨床HDCP的治療提供幫助,但由于PDCH發病機制復雜,后續還需深入研究。