黃芩苷調節JAK2/STAT3信號通路對口腔鱗癌細胞增殖、凋亡和侵襲的影響

戴 琦,崔 寧,劉文卓

(濟南市中西醫結合醫院,山東 濟南271100)

口腔癌在全球惡性腫瘤中排名靠前,屬于較常見的頭頸部癌癥,其中超過90%起源于鱗狀組織,是口腔癌中最常見的,所以又被稱為口腔鱗癌(Oral squamous cell carcinoma,OSCC)。OSCC的預后較差,病死率也較高,而且其分子發病機制也很復雜[1-2]。雖然手術、化療、放療已經在OSCC中得到了應用,但是患者的生存率并未明顯提高,治療效果不理想[3]。因此需要開發新的治療OSCC的方法。黃芩苷是從黃芩中提取的中藥單體,對多種腫瘤都具有抗腫瘤作用。黃芩苷又是一種黃酮苷,廣泛作用于癌癥的發生和發展階段,調節不同信號通路,單獨或聯合用藥可以抑制細胞增殖,減緩癌癥進展[4-5]。例如有報道顯示黃芩苷可以通過miRNA表達,調節肺癌的發展,從而發揮抗腫瘤活性[6]。相關研究稱信號轉導和轉錄激活子3(Signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)是一種在不同的惡性腫瘤發生和發展過程中的重要蛋白。而Janus激酶2(Janus kinase 2,JAK2)磷酸化后則可以激活STAT3發揮作用[7-8]。JAK2/STAT3通路調控細胞增殖和凋亡,激活JAK2/STAT3通路可以誘導OSCC、非小細胞肺癌的進展;還對具有放射抗性的結直腸癌發揮作用,改善結直腸癌患者的預后[9-11]。綜合上述報道,本文選取黃芩苷對JAK2/STAT3信號通路在OSCC細胞增殖、凋亡和侵襲中的作用進行探討。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞 人OSCC細胞CAL27來自上海博爾森生物科技有限公司。

1.2 主要試劑 DMEM細胞培養液購自廈門慧嘉生物科技有限公司;胎牛血清購自成都點純科技有限公司;黃芩苷(批號572667)來自上海麥克林生化科技股份有限公司;JAK2/STAT3通路激動劑Broussonin E 來自云南西力生物技術股份有限公司;膜聯蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)、碘化丙啶(PI)凋亡試劑盒、兔源一抗JAK2、磷酸化JAK2(p-JAK2)、STAT3、磷酸化STAT3(p-STAT3)、增殖細胞核抗原(PCNA)、β-actin購自愛必信(上海)生物科技有限公司;Transwell小室來自上海惠研生物科技有限公司;白細胞介素(IL)-18、IL-1β酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒購自上海遠慕生物科技有限公司;兔源一抗基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)、Bcl-2相關X蛋白(BAX)購自北京中杉金橋生物技術有限公司;辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗購自北京泰澤嘉業科技發展有限公司。

1.3 細胞培養 人OSCC細胞系CAL27在DMEM完全培養基中培養,并補充有10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素,在37 ℃濕潤的含5% CO2的培養箱中培養。

1.4 細胞分組并用集落形成測定各組細胞增殖能力 對于集落形成測定,將細胞以1×103個細胞接種在6孔板中,分別用100、150、200 mg/L的黃芩苷處理細胞并分為低濃度黃芩苷組、中濃度黃芩苷組、高濃度黃芩苷組[12],另外再用200 mg/L的黃芩苷+20 μmol/L JAK2/STAT3激活劑Broussonin E[13]進行處理作為高濃度黃芩苷+Broussonin E組,對照組不做其他特殊處理。孵育1周后,吸去培養基,將各組細胞在乙醇中固定10 min,然后用0.5%的結晶紫進行30 min細胞染色,然后使用顯微鏡進行檢測分析。

1.5 流式細胞術分析各組細胞凋亡 將各組細胞培養24 h后,用PBS洗滌,重懸并以1×105/ml的濃度,將各組細胞與Annexin V-FITC和PI在室溫下避光孵育15 min,使用流式細胞儀進行流式細胞術分析細胞凋亡率。

1.6 各組細胞侵襲測定 各組CAL27細胞以1×106每孔的數量加入涂有基質膠的24孔Transwell小室的上室中,與不含FBS的DMEM共同培養;在Transwell小室的下室中添加含FBS的DMEM培養液,在培養箱中共同孵育。固定各組侵襲的CAL27細胞,用細胞染色液染色并在光學顯微鏡下拍照、計數。

1.7 ELISA法檢測細胞中IL-18、IL-1β表達水平 將各組細胞消化、裂解離心,收集上清液備用。根據說明,使用IL-18 ELISA試劑盒和IL-1β ELISA試劑盒檢測IL-18、IL-1β的表達水平。

1.8 Western blot檢測p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、PCNA、BAX、MMP-9蛋白表達水平 通過RIPA緩沖液從各組CAL27細胞中提取總蛋白,并通過BCA蛋白檢測試劑盒測定濃度,將蛋白質用10%的SDS-PAGE凝膠電泳分離,然后轉移到PVDF膜上,在TBS緩沖液中用1% BSA脫封閉膜,并在4 ℃下與一抗孵育,JAK2(1∶1000)、p-JAK2(1∶1000)、p-STAT3(1∶1000)、STAT3(1∶1000)、PCNA(1∶1000)、BAX(1∶1000)、MMP-9(1∶1000)、β-actin(1∶1000)。洗膜然后在室溫下與HRP標記的二抗孵育1 h,用ECL檢測試劑處理,使用Image Lab軟件定量每種蛋白質的相對水平。

2 結 果

2.1 各組CAL27細胞增殖能力比較 與對照組相比,低濃度黃芩苷組、中濃度黃芩苷組、高濃度黃芩苷組的細胞集落形成率下降(均P<0.05);中濃度黃芩苷組、高濃度黃芩苷組與低濃度黃芩苷比較,細胞集落形成率也下降(均P<0.05);高濃度黃芩苷組與低濃度黃芩苷比較,細胞集落形成率降低(P<0.05),高濃度黃芩苷+Broussonin E 組與高濃度黃芩苷組比較,細胞集落形成率上升(均P<0.05)。見表1。

表1 各組CAL27細胞集落生成率比較(%)

2.2 各組CAL27細胞凋亡率比較 低濃度黃芩苷組、中濃度黃芩苷組、高濃度黃芩苷組與對照組比較,CAL27細胞凋亡率升高(均P<0.05);中濃度黃芩苷組、高濃度黃芩苷組與低濃度黃芩苷相比,細胞凋亡率同樣增加(均P<0.05);高濃度黃芩苷組與低濃度黃芩苷相比,細胞凋亡率增加(P<0.05);而高濃度黃芩苷+Broussonin E 組與高濃度黃芩苷組比較,細胞凋亡率降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組CAL27細胞凋亡率比較(%)

2.3 各組CAL27細胞侵襲能力比較 與對照組比較,低濃度黃芩苷組、中濃度黃芩苷組、高濃度黃芩苷組CAL27細胞侵襲數減少(均P<0.05);中濃度黃芩苷組、高濃度黃芩苷組與低濃度黃芩苷相比,細胞侵襲數再次減少(均P<0.05);高濃度黃芩苷組與中濃度黃芩苷組比較,細胞侵襲數目也減少(P<0.05);與高濃度黃芩苷組比較,高濃度黃芩苷+Broussonin E組CAL27細胞侵襲數增加(P<0.05)。見表3。

表3 各組CAL27細胞侵襲數目比較(個)

2.4 各組CAL27細胞中IL-18、IL-1β表達水平比較 與對照組相比,低濃度黃芩苷組、中濃度黃芩苷組、高濃度黃芩苷組的IL-18、IL-1β表達水平降低(均P<0.05);中濃度黃芩苷組、高濃度黃芩苷組與低濃度黃芩苷相比,細胞IL-18、IL-1β表達水平降低(均P<0.05);高濃度黃芩苷組與低濃度黃芩苷相比,細胞中IL-18、IL-1β水平降低(均P<0.05);與高濃度黃芩苷組比較,高濃度黃芩苷+SC79組CAL27細胞中IL-18、IL-1β水平增加(均P<0.05)。見表4。

表4 各組CAL27細胞中IL-18、IL-1β表達水平比較(pg/ml)

2.5 各組CAL27細胞中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、PCNA、BAX、MMP-9蛋白表達比較 與對照組比較,低濃度黃芩苷組、高濃度黃芩苷組的p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、PCNA、MMP-9蛋白表達降低,BAX蛋白表達增加(均P<0.05);中濃度黃芩苷組、高濃度黃芩苷組與低濃度黃芩苷組相比,p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、PCNA、MMP-9蛋白表達降低,BAX蛋白表達增加(均P<0.05);高濃度黃芩苷組與低濃度黃芩苷組相比,蛋白表達趨勢同前組一致(均P<0.05);與高濃度黃芩苷組比較,高濃度黃芩苷+Broussonin E 組p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、PCNA、MMP-9蛋白表達升高,BAX蛋白表達降低(均P<0.05)。見表5。

表5 各組CAL27細胞中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、PCNA、BAX、MMP-9蛋白表達比較

3 討 論

OSCC是口腔內最常見的癌癥之一,由于口腔組織在環境、遺傳等因素的影響下,其復發率、轉移率和致死率都很高,并且預后也較差[14-15]。目前常采用化療以及放療的方法進行治療,但是生存率較低[16-17]。OSCC的轉移性使其病死率大大增加,腫瘤細胞轉移到身體的其他部位,形成新的腫瘤,使OSCC的治療難度增大,患者生存率降低[18]。所以探索OSCC的發生發展機制,開發新的治療策略就顯得尤為重要。因此本文選取人OSCC細胞CAL27,對其增殖、凋亡和侵襲,以及藥物作用影響進行研究。

黃芩苷具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤等多種生物活性,對于炎癥、氧化應激、癌細胞轉移都有一定的治療作用[19]。近年來人們開始探索其在抗腫瘤中的作用,研究顯示其主要阻斷細胞周期、抑制細胞凋亡,并且對細胞轉移也有抑制作用[20]。比如有報道稱黃芩苷可以通過AMPK信號通路抑制而使膽管癌細胞凋亡,為膽管癌治療提供新方法[21]。但黃芩苷對于OSCC的研究還較少,故本文對黃芩苷在OSCC中的作用進行探究。結果顯示,低、中、高濃度的黃芩苷處理會使CAL27細胞的集落形成率降低,抑制細胞的增殖,促進細胞凋亡,而且細胞侵襲數目也明顯減少。此外炎癥因子水平降低、增殖相關蛋白PCNA、促凋亡蛋白BAX、侵襲相關蛋白MMP-9表達也發生變化。且隨著黃芩苷濃度的變化,相關實驗指標變化程度也不同,都證明黃芩苷可以抑制OSCC細胞的增殖和侵襲,促進OSCC細胞凋亡,具有治療OSCC的潛力。

眾多研究顯示JAK2/STAT3信號通路在很多癌癥中都發揮作用。其在肝細胞癌中被活化后會促進腫瘤轉移[22];JAK2/STAT3信號通路在胃癌中通過炎癥因子異常激活后,會增加p-JAK2、p-STAT3的表達,促進腫瘤發展[23];趨化因子激活JAK2/STAT3通路使OSCC的上皮間質轉化受到影響,采用JAK2/STAT3通路抑制劑可以抑制OSCC細胞的干性;其次在肺癌中JAK2/STAT3通路抑制后,可以降低癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力[24-25]。本文繼續研究JAK2/STAT3信號通路在OSCC中作用以及黃芩苷對JAK2/STAT3信號通路的影響。結果顯示,OSCC CAL27細胞中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3表達升高,低、中、高濃度黃芩苷處理后細胞中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3蛋白表達降低。隨著黃芩苷濃度升高,p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3蛋白表達越少。本研究推測黃芩苷可能抑制JAK2/STAT3信號通路對CAL27細胞的增殖、凋亡和侵襲產生影響。為了驗證此猜測,使用JAK2/STAT3信號通路激活劑Broussonin E干預高濃度黃芩苷處理的CAL27細胞,結果顯示Broussonin E的加入明顯地減弱了高濃度黃芩苷對CAL27細胞的增殖和侵襲的抑制,并減少了細胞凋亡。表明黃芩苷可能通過抑制JAK2/STAT3通路影響OSCC細胞的增殖、凋亡和侵襲,對OSCC產生作用。

綜上所述,黃芩苷可能通過抑制JAK2/STAT3通路進而影響OSCC細胞的增殖、凋亡和侵襲,本文為提升OSCC的治療,降低細胞轉移,提高患者生存率開拓了新的策略。而本研究尚未對其進行體內探索,有待進一步更加深入地探究。