三結構域蛋白8、Ras相關蛋白35、多聚ADP核糖聚合酶1在子宮內膜癌組織中的表達及檢測臨床意義

左學騫,趙海波,李 丹

(滄州市人民醫院婦科,河北 滄州 061000)

子宮內膜癌(Endometrial cancer,EC)是一種女性常見惡性腫瘤,好發于絕經期或絕經后婦女[1]。EC發病機制復雜多樣,包括:原癌基因激活、血管新生等均與其有關,對相關因子表達進行檢測有助于制定針對性治療方案和生存改善。Rab蛋白是一種小GTP結合蛋白,擁有GTP酶活性,也被稱為 Rab鳥嘌呤三核苷酸磷酸酶(Rab GTPase),于真核細胞與膜相關的細胞器中廣泛存在,對細胞內膜運輸功能有調節作用[2-4]。Ras相關蛋白35(Rab35)是Rab蛋白家族成員之一,以往研究中證實,Rab35蛋白參與胃癌、肺癌細胞的遷移侵襲過程[5]。三結構域蛋白8(Tripartite motif 8,TRIM8)屬于TRIM蛋白家族的成員,能通過多種信號通路對炎癥、腫瘤、免疫反應等進行調控,在腦膠質瘤、乳腺癌、肝癌及腎癌等中均有相關報道[6-7]。多聚ADP核糖聚合酶1(Poly ADP ribose polymerase-1,PARP-1)是一種有多功能的蛋白質翻譯后修飾酶,能對組蛋白、RNA聚合酶、DNA聚合酶、DNA連接酶和其自身等進行多聚ADP核糖基化的修飾,參與DNA復制和轉錄,維持基因組穩定、染色體結構完整及細胞凋亡過程,并在多種惡性腫瘤組織中有異常表達[8]?；谝陨媳尘?本研究探討TRIM8、Rab35、PARP-1與EC患者臨床病理特征的關系,旨在為EC臨床診治研究提供新方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料 研究對象為2016年5月至2018年10月于本院收治的100例EC患者,年齡24～76歲,平均(55.43±8.75)歲;FIGO分期:Ⅰ期40例,Ⅱ期36例,Ⅲ-Ⅳ期24例;分化程度:高分化40例,中分化44例,低分化16例。取EC患者手術切除的癌旁組織(距癌組織>5 cm)和癌組織進行研究。病例納入標準:經病理診斷為EC;初次手術且無術前放化療史;本次試驗內容患者與家屬了解知情已簽知情同意書。排除標準:伴有心、肝、腎、肺等疾病;合并其他腫瘤或腫瘤復發;自身免疫疾病;凝血功能障礙;語言障礙、精神疾病;手術禁忌證。本研究已獲醫院倫理委員會批準。

1.2 主要試劑和儀器 DAB顯色試劑(上海源葉生物科技有限公司,貨號R21317);免疫組化試劑盒(上海康朗生物科技有限公司,貨號KL-D3026);光學顯微鏡(日本 Olympus公司)。

1.3 免疫組化檢測組織中TRIM8、Rab35、PARP-1蛋白表達 取EC組織和癌旁組織,經過脫蠟、脫苯、水化和抗原修復后,用3% H2O2去除內源性過氧化物酶,清洗并封閉10 min,分次加入TRIM8單克隆抗體、Rab35抗體、PARP-1抗體,4 ℃過夜,以PBS洗滌2 min,共3次,加入二抗,37 ℃ 20 min,以PBS洗滌2 min,共3次,加試劑SABC,37 ℃ 20 min,以PBS洗滌5 min,共4次,加入DAB顯色劑,蘇木精-復染、脫水干燥后封片,陰性對照以PBS代替,放于顯微鏡下觀察染色強度及計算陽性細胞百分比。 TRIM8、Rab35、PARP-1陽性表現為淡黃色至棕褐色顆粒,光鏡下隨機選5個高倍視野,對陽性細胞數和細胞總數進行計數。陽性表達判定:陽性細胞所占百分比×染色強度,TRIM8蛋白表達<3分為陰性,≥3分為陽性[9];Rab35蛋白表達≤3分為陰性,>3分為陽性[10];PARP-1蛋白表達≥3為陽性,<3為陰性[11]。

1.4 臨床資料收集 將患者臨床資料,包括:年齡、臨床分期、分化程度、浸潤深度及淋巴結轉移情況進行收集,分析子宮內膜癌組織TRIM8、Rab35、PARP-1表達與患者臨床病理特征的關系。隨訪5年,以復診、電話等方式,對患者死亡情況做記錄。

2 結 果

2.1 子宮內膜癌組織和癌旁組織TRIM8、Rab35、PARP-1蛋白表達比較 TRIM8、Rab35、PARP-1蛋白陽性表達多為棕黃色,EC組織和癌旁組織中Rab35、PARP-1蛋白陽性表達率依次為71.00%(71/100)和35.00%(35/100)、74.00%(74/100)和43.00%(43/100),TRIM8蛋白陽性表達率分別為30.00%(30/100)和69.00%(69/100)(均P<0.01),見圖1。

A:癌旁組織TRIM8表達;B:癌旁組織Rab35表達;C:癌旁組織PARP-1表達;D:EC組織TRIM8表達;E:EC組織Rab35表達;

2.2 TRIM8、Rab35、PARP-1蛋白表達的相關性 Spearman相關性分析顯示,EC組織中Rab35與PARP-1呈正相關,Rab35和PARP-1與TRIM8表達呈負相關(r=0.542、-0.461、-0.461,均P<0.05)。

2.3 TRIM8、Rab35、PARP-1蛋白表達與患者臨床病理參數的關系 EC組織TRIM8、PARP-1、Rab35蛋白陽性表達與年齡、分化程度、肌層浸潤深度無相關性,同FIGO分期、淋巴結轉移有關,Rab35蛋白陽性表達和肌層浸潤深度有關(均P<0.05),見表1。

表1 TRIM8、Rab35、PARP-1蛋白表達與患者臨床病理參數的關系[例(%)]

2.4 隨訪5年生存率 隨訪結果,Rab35陽性患者5年生存率55.17%(32/58)低于陰性患者70.57%(34/42),PARP-1陽性患者5年生存率65.96%(31/47)低于陰性患者79.24%(42/53),TRIM8陽性患者5年生存率93.33%(42/45)高于陰性患者72.73%(40/55)(均P<0.05)。

2.5 子宮內膜癌患者預后因素Cox回歸模型分析 Cox回歸模型分析發現,FIGO分期Ⅲ-Ⅳ期、肌層浸潤深度≥1/2和PARP-1、TRIM8、Rab35表達異常為影響EC患者預后的危險因素(均P<0.05),見表2。

表2 子宮內膜癌患者預后因素Cox回歸模型分析

3 討 論

EC是女性生殖系統三大惡性腫瘤之一,多好發于中老年女性,臨床中以陰道流血、異常排液及疼痛為主要常見表現,近年來,其發病率逐年增加,病死率也以每年1.4%的速度升高[12-13]。EC的進展與細胞因子、凋亡機制等關系密切[14]。凋亡信號失調能夠使腫瘤細胞逃避外在的免疫監控和內在的細胞調節機制,促使組織發生癌變,因此,與凋亡失控調節相關的分子可能參與腫瘤的發生發展過程。

PARP-1與DNA修復和損傷誘導的凋亡密切相關,并能夠維持基因組的完整性和穩定性[15-16]。Rab35蛋白則參與細胞的運輸、釋放、吞噬及遷移等過程[17-18]。TRIM8作為TRIM家族的重要成員之一,可激活p53信號通路,提高化療藥物的敏感性,增強抗腫瘤效用,又能通過激活NF-κB信號通路促進炎癥相關腫瘤的進展[19-20]。例如:TRIM 8基因組位點在膠質母細胞瘤中出現雜合性丟失和頻繁缺失,提高體內外的乳腺癌細胞增殖、遷移能力可通過敲除TRIM8實現,TRIM 8能通過恢復p53活性抑制肝細胞癌增殖等。在本研究中,癌旁組織TRIM8蛋白陽性表達率較子宮內膜癌組織陽性表達升高,子宮內膜癌組織Rab35、PARP-1蛋白陽性表達率高于癌旁組織,提示TRIM8表達降低,Rab35、PARP-1表達升高,可能與EC發生發展有關。進一步通過Spearman相關性分析發現,Rab35與PARP-1呈正相關,Rab35和PARP-1與TRIM8表達呈負相關,EC組織TRIM8、PARP-1、Rab35蛋白陽性表達與FIGO分期、淋巴結轉移有關,除此之外,Rab35蛋白陽性表達也與肌層浸潤深度有關。說明TRIM8在子宮內膜癌發生發展中可能發揮抑癌作用,Rab35、PARP-1發揮致癌作用,并能促進EC的發展、浸潤和轉移。PARP-1表達增強原因可能與腫瘤細胞增殖活躍后過氧化物大量產生有關,NO、氧自由基等產后使DNA損傷,導致DNA雙鏈缺口和斷裂,DNA損傷加重,出現過多DNA斷端,使PARP-1活化[21-24]。在PARP-1活化的同時,其對DNA的修復能力下降,故當細胞處于低分化時,PARP-1表達升高。而何彩平等[23]發現,Rab35蛋白可消除抑制Akt磷酸化和P13K信號通路的活性蛋白,激活P13K/Akt通路并在體外使正常細胞發生癌變。武宸宇等[9]對于TRIM8表達與EC的關系進行研究,發現TRIM8的表達在轉錄后水平會受特定miRNA的調節,并認為miR-182-5p可能通過抑制TRIM8表達發揮致癌作用。

此外,本研究對EC患者進行5年隨訪,發現PARP-1陽性、Rab35陽性患者5年生存率低于陰性患者,TRIM8陽性患者5年生存率高于陰性患者,同時經過Cox回歸模型分析發現,FIGO分期Ⅲ-Ⅳ期、肌層浸潤深度≥1/2、PARP-1、TRIM8、Rab35是影響子宮內膜癌患者預后的獨立因素。許高云等[25]收集72例EC患者臨床資料并進行多因素Cox回歸分析也發現,FIGO 分期、淋巴結轉移、VEGF-C及Ki-67表達是影響EC患者預后狀況的獨立影響因素。這也與臨床中癌灶浸潤至深肌層或病理分期較高的EC患者易出現不良預后的結果是一致的,可見TRIM8、Rab35、PARP-1的表達水平監測能可為患者預后預測提供新思路,但具體作用機制還有待進一步研究證實。

綜上所述,子宮內膜癌組織PARP-1、Rab35表達升高、TRIM8表達降低,PARP-1、TRIM8表達異?？赡芘c子宮內膜癌的發生、發展和密切相關。