雄激素受體、Ki-67在三陰性乳腺癌中的表達以及與預后的關系

王維斯，國士剛，李國明，付新澳，李居尚，范宗奇

（1.承德醫(yī)學院研究生學院，河北承德 067000；2.朝陽市中心醫(yī)院；3.中國醫(yī)科大學朝陽市中心醫(yī)院）

乳腺癌（breast cancer，BC）是目前女性最常見的惡性腫瘤[1]，據國際癌癥研究機構報告顯示，2020年全球癌癥患者的總人數(shù)增加約1900萬，其中新增的乳腺癌人數(shù)約為226萬，占比11.7 %[2]。三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是乳腺癌的一種特殊亞型，其特點是患者的雌激素受體（estrogen receptor，ER）為陰性表達、孕激素受體（progesterone receptor，PR）和人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，HER-2)為陰性表達[3,4]，目前TNBC還未找到特定的治療靶點，缺乏有效治療手段，患者無法從靶向治療中受益[5]。雄激素受體（androgen receptor，AR）是一種類固醇受體，不僅與生殖密切相關，還在維持人體激素平衡中有重大作用。Ki-67是一種核蛋白，在細胞處于靜止期時不表達，可用來提示細胞的增殖分化程度。本研究通過分析AR、Ki-67在TNBC中的表達情況，結合患者臨床資料分析其臨床意義，探究其與TNBC患者預后的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取朝陽市中心醫(yī)院2015年1月～2020年5月診治的TNBC女性患者88例作為觀察組，同時納入了NTNBC女性患者89例作為對照組。納入標準：（1）在我院進行手術治療，且通過病理診斷確診；（2）術前未進行新輔助治療；（3）完整的石蠟組織塊和臨床資料。排除標準：（1）乳腺癌手術史；（2）合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤者；（3）乳腺癌復發(fā)。觀察組年齡17～83歲，平均年齡（54.64±11.67）歲；體重指數(shù)(BMI)16.30～34.48，平均BMI（24.45±3.70）。對照組年齡29～81歲，平均年齡（55.35±10.35）歲；體重指數(shù)(BMI)17.58～37.22，平均BMI（25.78±3.80）。2組資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。本研究符合醫(yī)學倫理會審核標準。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化 提取乳腺癌組織的石蠟標本，切片厚度為5μm。進行常規(guī)脫蠟和水化處理，隨后進行相應的抗原修復。在免疫組化實驗中使用SP法檢測AR和Ki-67的表達。在實驗實際操作中，嚴格按照說明書進行SP法檢測。在陰性對照中，使用磷酸鹽緩沖液替代一抗，采用已知抗體陽性標本作為陽性對照。

1.2.2 判定標準 細胞核內出現(xiàn)呈淺黃、棕黃的細小顆粒視為陽性細胞，當AR陽性細胞數(shù)量占所有腫瘤細胞數(shù)量比例≥1%時，則判定為陽性。Ki-67陽性標志是細胞核內出現(xiàn)棕黃色顆粒，Ki-67指數(shù)臨界值為≤30%時定義為低表達，＞30%時定義為高表達[6]。

1.2.3 隨訪 患者出院后，通過電話隨訪和門診復查隨訪，隨訪結局事件為患者死亡或截止值2023年5月，隨訪內容為患者的總生存時間（overall survival，OS）。OS定義為患者從術后第1天起至死亡日期或末次隨訪時間。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 26.0和R3.6.3軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料用（n,%）表示，組間差異比較采用χ2檢驗或 Fisher 精確概率法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 AR、Ki-67在TNBC及NTNBC中的表達

AR在TNBC中陽性表達為棕黃色，在細胞核中表達（圖1A），Ki-67在TNBC中陽性表達為棕褐色，在細胞核中表達（圖1B）。

圖1 AR、Ki-67在癌組織中的不同表達情況（SP×400）

AR在NTNBC中的表達較顯著（圖2A），在TNBC中的表達較弱（圖2B），Ki-67在TNBC中的表達顯著（圖3A），在NTNBC中的表達較弱（圖3B）。

圖2 AR在不同組織中的表達情況（SP×100）

圖3 Ki-67在不同組織中的表達情況（SP×100）

結果顯示，AR在NTNBC組織中表達率高于TNBC中的表達率，Ki-67在TNBC中表達率高于NTNBC組織。差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2 AR、Ki-67的表達與TNBC臨床特征之間的關系

在TNBC組織中，AR的表達情況與淋巴結轉移個數(shù)相關(P=0.033)。Ki-67的表達情況與腫瘤直徑相關（P=0.027)，與淋巴結轉移個數(shù)也相關（P=0.042），見表1。

表1 AR、Ki-67的表達與TNBC臨床特征之間的關系

2.3 AR與Ki-67與預后之間的關系

AR陽性表達組和AR陰性表達組中，患者3年總生存率分別為89.21%和57.63%。Kaplan-Meier生存分析顯示：AR陽性表達組和陰性表達組的3年總生存率相比，差異有統(tǒng)計學意義，見圖4A。Ki-67高表達組和Ki-67低表達組的3年總生存率分別為57.38%和81.48%。Kaplan-Meier生存分析顯示：Ki-67高表達組與Ki-67低表達組3年總生存率相比，差異有統(tǒng)計學意義，見圖4B。

圖4 Kaplan-Meier生存分析曲線圖

2.4 AR與Ki-67相關性分析

在本研究88例TNBC中，有14例患者AR呈陽性表達、Ki-67高，47例表現(xiàn)為AR陰性表達、Ki-67高表達，12例表現(xiàn)為AR呈陰性表達、Ki-67低表達，15例表現(xiàn)AR陽性表達，Ki-67低表達。AR與Ki-67在TNBC中的表達呈負相關性關系（r=-0.320，P＜0.05），見表2。

表2 AR與Ki-67相關性分析

2.5 生存分析及列線圖的構建

采用COX單因素回歸分析方法，分析結果顯示,腫瘤直徑、病理分級以及AR、Ki-67的表達情況是乳腺癌預后的影響因素(P＜0.05)。淋巴結轉移個數(shù)在實際臨床應用中對患者的預后有意義，因此也納入COX多因素回歸分析的指標，結果顯示,病理分級，淋巴結轉移個數(shù)、AR、Ki-67的表達情況是乳腺癌預后的影響因素(P＜0.05),見表3。

表3 生存分析

基于COX單因素以及多因素的篩選構建TNBC的OS的列線圖預測模型，見圖5。在本研究中，1年生存率、2年生存率、3年生存率列線圖模型的AUC分別為0.843、0.868、0.806，提示列線圖模型有較好的區(qū)分度，見圖6。

圖5 預測TNBC總生存時間的列線圖

圖6 列線圖預測患者1年、2年、3年總生存時間的ROC曲線

3 討論

根據國際癌癥研究機構最新報告顯示，乳腺癌發(fā)病率已經超過肺癌，占所有腫瘤的11.7%，成為女性中最常見的癌癥，是全球第五大癌癥死因，也是女性癌癥死亡的主要原因[2]。作為乳腺癌的一種特殊亞型，TNBC仍然是目前最具挑戰(zhàn)性的一種[7]。主要采用的治療手段仍然是手術為主，輔以放療或化療[8]。TNBC發(fā)生早期復發(fā)和遠處轉移的風險較其他類型的乳腺癌更高，給患者的身心健康帶來了極大的負擔和痛苦。因此，尋找精確的治療靶點、以使患者獲益，仍然是當前研究的焦點和難題。

AR是一種核受體[9]，基因位于Xq11-12號染色體上，有四個不同的功能區(qū)：N端區(qū)域、氨基末端的調節(jié)域（AF-1位點）、由兩個鋅指組成的DNA結合域、帶有核定位信號的鉸鏈區(qū)和C端配體結合域（AF-2位點），N端主要負責參與轉錄激活[10-12]。AR在乳腺癌癌變中的作用機制不是一成不變的，并且十分復雜。在沒有配體的情況下，AR存在于細胞質中，并且與熱休克蛋白及其伴侶復合物組成較為穩(wěn)定的復合物[13]。當C端配體結合域結合循環(huán)中的雄激素，導致構象改變，使AR二聚體化。此時形成的受體-激素復合物由細胞核外進入到細胞核內，以促進由同一個激活劑介導的靶基因轉錄（AR激活的轉錄/基因組模式）進程，并通過負反饋作用使AR轉錄失活[13]。

乳腺癌是一種激素依賴性的腫瘤，AR在乳腺癌中的地位不可忽略。AR在正常乳腺組織與乳腺癌組織的表達水平略有不同[14]，在本研究中，AR在TNBC中的表達低于NTNBC的表達也證實了這一觀點。文獻中報道，AR在TNBC中的陽性表達占比超過30%，而且其表達水平在TNBC分子亞型中差異很大[15,16]。在本研究中，TNBC中AR陽性表達占比為33.0%，該結果與其他研究結果一致[17,18]。對于TNBC來說，研究[19]顯示AR是一個堅實的潛在治療目標。一項關于AR表達與TNBC相關性研究的meta分析結果顯示，AR陽性與TNBC低復發(fā)風險相關[18]。進一步的研究將AR與更好的總生存期（P=0.04）聯(lián)系起來。因此，類比前列腺癌中AR抑制劑的應用以及取得的有效成果，大量的AR抑制劑開始在TNBC中進行使用，目前研究較多的抑制劑，如比卡魯胺、恩雜魯胺、阿比特龍，在多項實驗中均顯示其在AR陽性表達的TNBC中能夠有效的抑制腫瘤細胞的增殖，增加細胞凋亡，減緩疾病的進程[20]。雖然,目前AR在TNBC中的具體作用機制還未明了，但現(xiàn)有的這些研究都能不同程度的驗證AR抑制劑在TNBC預后中的積極意義。這些結果表明，AR為TNBC患者的靶向治療展露了曙光。

核Ki67蛋白通常只在增殖細胞中表達[21]。Ki67在細胞間期主要位于核皮質，在有絲分裂期被招募到凝集的染色體上[22]。Ki67蛋白在除G0期外的G1，S，G2期和有絲分裂的細胞核中均能檢測到[23]。免疫染色是Ki67表達的金標準[24]。Ki67指數(shù)在前列腺癌患者的預后中已成為獨立的影響因素[25]。Ki-67指數(shù)是增殖活性的指標，并已被廣泛研究為治療反應的預測標志物[23,26]。多項研究[27,28]顯示，獲得pCR的患者與未獲得pCR的患者相比，Ki-67的表達具有顯著統(tǒng)計學意義。一些研究報道[29]顯示，僅使用Ki-67表達不足以預測pCR，這表明預測模型還需要除Ki-67外其他標志物。AR陽性TNBC的Ki-67指數(shù)低于AR陰性TNBC，對化療的敏感性可能較低[28]，在本實驗中也驗證這一結果。本研究中發(fā)現(xiàn)AR與Ki67的表達有相關性，因此在實驗中將AR和Ki67進行融合，構建新的分類變量，以期望提高預測患者預后的準確性。本研究中的結果顯示，AR（﹣）/Ki-67（﹢）表達的患者發(fā)生死亡風險是AR（﹢）/Ki-67（﹣）表達患者的5倍。AR（﹢）/Ki-67（﹣）表達的患者生存時間最長。

本研究仍存在一定的局限性。其一，樣本均來源于朝陽市中心醫(yī)院，因此樣本的來源具有地域性，選擇性偏倚無法避免；其二，本研究隨訪時間為3年，由于朝陽市中心醫(yī)院TNBC患者量較少，橫跨年限時間較長，因此部分患者出現(xiàn)失訪，導致現(xiàn)有樣本量不夠充足的局限性，未對樣本進行不同分子亞型的分組研究。另外，由于本研究是單中心研究，且樣本量較為有限，因此未對列線圖進行內部或外部驗證，有待于擴大樣本容量實施進一步的研究和驗證。