HLA-DM 基因多態性與脊髓灰質炎疫苗誘導抗體應答的相關性

齊汝楠，史 磊，劉舒媛，李 菁，史 荔

（中國醫學科學院 &北京協和醫學院醫學生物學研究所，云南 昆明 650118）

脊髓灰質炎是嚴重危害兒童健康的急性傳染病，接種脊髓灰質炎減毒活疫苗（oral poliomyelitis vaccine，OPV）和脊髓灰質炎滅活疫苗（inactivated poliomyelitis vaccine，IPV）可以有效控制脊灰的傳播，但現有脊灰疫苗的保護效果很難達到100%[1]。受種者遺傳背景是影響疫苗免疫效果的重要因素，研究表明脊灰疫苗誘導抗體應答的遺傳度為60%[2]。接種脊灰疫苗后，外源性抗原在內體溶酶體中被水解，HLA-DM 分子催化II 類分子相關的恒定鏈多肽（class II-associated invariant chain peptide，CLIP）從MHC II-CLIP 復合體中解 離，抗原肽與MHC II 類分子結合后表達在專職性抗原呈遞細胞（antigen presenting cells，APC）表面，被CD4+T 細胞的TCR 識 別[3?5]。DM 分子是抗原被有效呈遞的關鍵因素，可穩定空載MHC II 類分子構象阻止其發生變性失活，促進高親和力抗原肽的裝載并保證MHC II-抗原肽復合體在APC表面可較長時間的穩定表達[6?8]。DM 分子由DMA 和DMB 基因編碼組成，研究表明DM 與多種自身免疫性疾病和感染性疾病的發病風險有關[9?11]，不同DMA 和DMB 等位基因組合編碼的DM 分子在功能活性上存在差異，繼而影響抗原肽在APC 表面的呈現和對CD4+T 細胞的激活[12]。本研究將探討HLA-DM 基因多態性對脊灰疫苗誘導抗體應答的可能作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象

以355 名2～3 月齡廣西壯族自治區的健康嬰幼兒為研究對象，所有個體均無脊髓灰質炎疫苗接種史及其他可能影響試驗評估的情況，由監護人簽署知情同意書并通過廣西倫理審查委員會的批準（批準文號GXIRB2017-0009-6）。受試者在2 月齡和3 月齡時分別接種1 劑IPV，4 月齡接種1 劑bOPV，免疫前和第3 針免疫后第28 天采集受試者靜脈血，提取外周血基因組DNA，檢測血清中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊灰病毒中和抗體滴度。免疫前脊灰病毒中和抗體效價 ＜ 1:8 且免疫后中和抗體效價≥1:8 或免疫前中和抗體效價≥1:8 且免疫后中和抗體效價≥4 倍增長的個體為抗體陽轉組，不符合抗體陽轉組標準的個體為抗體非陽轉組。

1.2 HLA-DMA、HLA-DMB、HLA-DOA 和HLADOB 基因分型

根據世界衛生組織HLA 命名委員會的命名原則，采用Sanger 測序法對HLA-DMA 外顯子3 和HLA-DMB 外顯子2/3 中的10 個SNPs 進行基因分型，見表1～2。擴增引物信息見表3。擴增體系為12.5 μL Takara PrimerSTAR Max DNA Polymerase（2×），0.5 μL 正向引物（10 pmol/μL），0.5 μL 反向引物（10 pmol/μL），1.5 μL DNA 樣本（20 ng/μL），加入ddH2O 至總體系為25 μL，反應條件為98 ℃預變性2 min，98 ℃變性10 s、58 ℃退火5 s，共30 個循環，最后72 ℃延伸5 s。

表1 HLA-DMA 基因分型SNPs 位點信息Tab.1 HLA-DMA genotyping SNPs locus information

表2 HLA-DMB 基因分型SNPs 位點信息Tab.2 HLA-DMB genotyping SNPs locus information

表3 引物序列及片段大小Tab.3 Primers sequence and fragment size

1.3 統計學處理

在Pypop 0.7.0 軟件中對分型結果進行哈迪-溫伯格平衡（hardy-weinberg equilibrium，HWE）檢驗。采用SHEsis 軟件分析基因位點間的連鎖不平衡，構建HLA-DMA-DMB 單倍型。應用SPSS 23.0 中的卡方檢驗（χ2）比較不同性別、民族、DM各等位基因與基因型在抗體陽轉組和非陽轉組之間的分布，P＜ 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 樣本基本情況

納入研究對象的355 名嬰幼兒由196 名男性和159 女性組成，其中114 名是漢族，241 名是壯族。各型抗體陽轉組和非陽轉組間的性別和民族分布，差異無統計學意義（P＞ 0.05），見表4。

表4 研究對象基本情況Tab.4 Basic information on research subjects

2.2 等位基因分析

DMA 和DMB 基因頻率分布均符合HWE（P＞0.05）。脊灰I 型中DMA*01:02 在抗體非陽轉組中的頻率高于陽轉組（P=0.022），DMB*01:01 在抗體非陽轉組中的頻率高于陽轉組（P=0.021）。脊灰II 型中DMA*01:02 在抗體非陽轉組中的頻率高于陽轉組（P=0.014），見表5。

表5 DMA 和DMB 各等位基因在抗體陽轉組和非陽轉組中的頻率分布Tab.5 Comparison of frequencies of alleles of DMA and DMB between two groups

2.3 基因型分析

脊灰I 型中DMB*01:01/DMB*01:01 在抗體非陽轉組中的頻率高于陽轉組（P=0.020）。脊灰II型中DMA*01:02/DMA*01:02 在抗體非陽轉組中的頻率高于陽轉組（P=0.001），DMB*01:01/DMB*01:01 在抗體非陽轉組中的頻率高于陽轉組（P=0.003），見表6。

表6 DMA 和DMB 各基因型在抗體陽轉組和非陽轉組中的頻率分布Tab.6 Comparison of frequencies of genotypes of DMA and DMB between two groups

2.4 單倍型分析

脊灰I 型中DMA*01:02-DMB*01:01 單倍型在抗體非陽轉組中的頻率高于陽轉組（P=0.017）。脊灰II 型中DMA*01:02-DMB*01:01 單倍型在抗體非陽轉組中的頻率高于陽轉組（P=0.008），見表7。

表7 DMA-DMB 單倍型在抗體陽轉組和非陽轉組中的頻率分布Tab.7 Comparison of frequencies of genotypes of DMA and DMB between two groups

3 討論

DMA 和DMB 基因的多態性可能會改變DM異二聚體結構，導致DM 分子催化肽交換功能變化，從而影響抗原肽的呈遞[12]。本研究發現DMA*01:02 和DMB*01:01 在脊灰II 型抗體非陽轉組中的等位基因頻率高于陽轉組。其他研究中，DMA*01:02 和DMB*01:01 在I 型糖尿病患者中的頻率低于對照組[13]，DMA*01:02 與銀屑病發病風險相關[10]，類風濕性關節炎患者中DMA*01:02的頻率高于健康對照組[11]，DMA*01:03、DMA*01:04 和DMB*01:02 在系統性紅斑狼瘡患病風險相 關[14]，DMA*01:01 和DMB*01:01 在尖銳濕疣患者中的頻率較高，而健康對照者中DMA*01:02在的頻率較高[15]。相比于優勢等位基因DMA*01:01，DMA*01:02 的rs1063478 位點堿基發生G→A 變異，導致DMA 第140 位氨基酸由谷氨酰胺突變為異亮氨酸，DMA*01:03 的rs6926628 位點堿基發生A→C 變異，導致DMA 第155 位氨基酸由甘氨酸突變為丙氨酸，在rs41555121 位點G→A變異影響下，DMA*01:03 等位基因的第184 位氨基酸由精氨酸突變為組氨酸，此位點直接影響DM 分子與DR 分子結合[16]。HLA-DMA 多態性影響DM 分子的結構穩定性和肽交換催化活性，Miguel álvaro-Benito 等[17]發現，與單倍型DMA*01:01-DMB*01:01 相比，DMA*01:03-DMB*01:01的熱穩定性下降且肽交換催化速率降低。之后該研究團隊比較了DMA*01:01-DMB*01:01 和DMA*01:03-DMB*01:07，發現HLA-DM 單倍型具有特定的細胞功能，并差異性地影響T 細胞的激活，與前者相比，DMA*01:03-DMB*01:07 單倍型存在時的T 細胞活性大幅增強，同時觀察到在HLADR 和HLA-DM 表達水平相同的條件下，DM 同種異型影響著形成免疫肽組的特異性組成[12]。在本研究中，未發現到DM 基因多態性與抗體水平存在相關性，推測可能是單獨的DM 基因突變對T 細胞活化和漿細胞分泌抗體的影響較為局限。其他疫苗誘導抗體反應的研究發現，DMA*01:02-DMB*01:01 和DMA*01:03-DMB*01:07 單倍型與乙腦疫苗抗體非陽轉組有關[18]。

綜上所述，本研究表明HLA-DM 基因的多態性與脊灰疫苗誘導抗體應答存在相關性，尤其是DMA*01:02 和DMB*01:01 在脊灰Ⅰ型和Ⅱ型抗體應答陽轉組和非陽轉組中的差異分布可作進一步的探究。接下來可納入更多的研究群體進行討論，進一步分析HLA Ⅱ類抗原呈遞基因多態性與疫苗誘導抗體反應之間的關聯，探討在其他疫苗和群體中DM 基因多態性影響抗體的變化方向，為新興疫苗的研發設計提供參考。