CD147 通過AIM2 炎癥小體介導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞焦亡和增殖

王 玲，秦祥川，李金秋，阿仙姑·哈斯木

（新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院/新疆地方病分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 836001）

宮頸癌（cervical cancer，CC）仍然是目前女性在生殖系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一，同時(shí)是女性第四大癌癥死亡病因，雖然人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）疫苗已經(jīng)問世，對宮頸癌的有效防治也提供了新機(jī)遇，但目前宮頸癌的發(fā)病人群仍日趨年輕化，2020 年全球約有34.2萬死亡病例和60.4 萬新發(fā)病例[1]，這意味著宮頸癌仍然是一個(gè)重大的世界公共衛(wèi)生問題。

細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子（cluster of differentiation 147，CD147）是原發(fā)性腫瘤中最常見的表達(dá)蛋白之一，它是一種高度糖基化的I 型跨膜蛋白，屬于免疫球蛋白超家族（immunoglobulin superfamily，IgSF）成員，在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞上皮轉(zhuǎn)化、炎癥發(fā)生、細(xì)胞增殖、加速腫瘤細(xì)胞糖酵解、調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞自噬等方面有著重要作用[2?3]。炎癥小體是由細(xì)胞質(zhì)中的模式識(shí)別受體組裝的多蛋白復(fù)合體，可介導(dǎo)炎癥和焦亡的發(fā)生[4]。焦亡是一種程序性細(xì)胞死亡方式，也是一種由炎癥小體介導(dǎo)的炎癥細(xì)胞死亡[5?6]。炎癥小體黑色素瘤缺乏因子2（absent in melanome 2，AIM2）是介導(dǎo)細(xì)胞焦亡的關(guān)鍵上游起始蛋白，是免疫系統(tǒng)的一種非特異性受體因子，屬于經(jīng)典炎癥小體家族[7]。研究表明AIM2 炎癥小體在細(xì)菌感染、自身免疫性疾病及腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中有重要作用[8]。CD147 在多種惡性腫瘤中均表達(dá)升高，本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，與正常宮頸細(xì)胞相比CD147 在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)顯著升高[9]，但CD147 對腫瘤的作用是否與炎癥小體有關(guān)，尚未見相關(guān)研究 。本研究以SiHa 宮頸癌細(xì)胞為研究對象，探究CD147 對宮頸癌的作用機(jī)制是否與AIM2 炎癥通路調(diào)控焦亡有關(guān)，為宮頸癌發(fā)病機(jī)制及新靶點(diǎn)的治療研究提供思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑

人宮頸癌細(xì)胞SiHa 細(xì)胞株購于武漢普諾賽公司，CD147-siRNA 慢病毒由吉?jiǎng)P公司構(gòu)建。Trizol 試劑、乳酸脫氫酶釋放檢測試劑盒、RIPA組織細(xì)胞裂解液均購自塞維爾生物科技有限公司抗體 CD147（Ab217319）購自美國Abcam 公司，AIM2（sc-515514）購自美國Santa Cruz 公司，caspase-1（22915-1-AP）、IL-18（60070-1-lg）、GSDMD（20770-1-AP）、GAPDH（60004-1-lg）購自三鷹生物技術(shù)有限公司，DMEM 培養(yǎng)基購于普諾賽公司；逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量試劑盒均購買于TaKaRa 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理宮頸癌SiHa 細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM（10%胎牛血清+1%青鏈霉素雙抗）培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。慢病毒轉(zhuǎn)染前，在6 孔板中種100000 個(gè)細(xì)胞，并按照吉?jiǎng)P公司的說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。根據(jù)慢病毒不同干擾序列，將實(shí)驗(yàn)分組為SiHa 組、陰性對照組（shCD147-NON）、敲低組1（shCD147-1）和敲低組2（shCD147-2）。熒光倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞感染狀況，以綠色熒光蛋白表示細(xì)胞感染率。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí) 驗(yàn)選取狀態(tài)良好的細(xì)胞提RNA，按照試劑盒（Takara 生物科技公司）說明書方法對內(nèi)參（GAPDH）及目的基因（CD147、AIM2、Caspase-1、IL-18、GSDMD）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA、PCR 擴(kuò)增及逆轉(zhuǎn)錄。統(tǒng)計(jì)相應(yīng)基因CT 值，運(yùn)用2-ΔΔCT的計(jì)算公式計(jì)算mRNA 的相對表達(dá)量。本研究中所涉及的PCR 引物，見表1。

表1 RT-qPCR 檢測基因的引物序列Tab.1 Primer sequences of genes detected by RT-qPCR

1.2.3 Western blot 實(shí)驗(yàn)收集處理后的SiHa 細(xì)胞裂解蛋白，檢測 CD147、AIM2、Caspase-1、IL-18、GSDMD 的蛋白相對表達(dá)量，將提取后的蛋白進(jìn)行上樣、電泳、電轉(zhuǎn)、5%脫脂牛奶封閉1 h、TBST 洗膜3 次、一抗 4 ℃孵育16 h，TBST 洗膜3 次，二抗雜交1.5 h，再次TBST 洗膜3 次后加上化學(xué)發(fā)光劑（ECL）顯色，上機(jī)檢測。抗體稀釋如下：CD147（1∶10000）、AIM2（1∶5000）、Caspase-1（1∶1500）、IL-18（1∶5000）、GSDMD（1∶5000）、GAPDH(1∶8000)。

1.2.4 平板克隆實(shí)驗(yàn)以1000 個(gè)/孔的密度將各組細(xì)胞接種在6 孔板中培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)2 周，觀察細(xì)胞集落形成的大小和數(shù)量，PBS 洗滌3 遍、固定后染液染色，并采集各組細(xì)胞集落圖像。

1.2.5 CCK-8 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞接種到96 孔板，每孔2000 個(gè)細(xì)胞，每組6 個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)12、24、36、48 h 后，將20 μL CCK-8 試劑避光加入每孔200 μL培養(yǎng)基中。3 h 后，在450 nm 處用酶標(biāo)儀測定吸光度值。

1.2.6 乳酸脫氫酶（LDH）釋放實(shí)驗(yàn)先收集細(xì)胞到離心管內(nèi)離心，8000 g 4 ℃離心10 min，棄上清，超聲波破碎細(xì)胞。根據(jù)乳酸脫氫酶活性檢測試劑盒的說明書制備樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，并將制備好的樣品轉(zhuǎn)移到 96 孔板中，使用酶標(biāo)儀檢測 450 nm 波長下的吸光度值，計(jì)算乳酸脫氫酶活性。

1.2.7 細(xì)胞焦亡形態(tài)學(xué)觀察細(xì)胞培養(yǎng)皿置于熒光倒置顯微鏡的載物臺(tái)上，分別觀測SiHa 細(xì)胞和對照組細(xì)胞形態(tài)變化，拍照記錄，熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 9.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組間多重比較統(tǒng)計(jì)分析使用LSD-t法；組間統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用單因素方差分析；2 組間統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD147 在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)水平及慢病毒轉(zhuǎn)染效率的測定

Western blot 檢測 CD147 在宮頸癌細(xì)胞 SiHa（HPV+）、C33a（HPV-）和正常宮頸上皮細(xì)胞H8（HPV+）、HCerEpic（HPV-）中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示：蛋白CD147 在HPV 陽性細(xì)胞中表達(dá)水平高于HPV 陰性細(xì)胞，且在宮頸癌SiHa 細(xì)胞中表達(dá)水平最高（F=975.2，P＜ 0.0001），見圖1A，故選取SiHa 細(xì)胞進(jìn)行CD147 低表達(dá)慢病毒的轉(zhuǎn)染。RT-qPCR 和Western blot 實(shí) 驗(yàn)檢測SiHa 組、shCD147-NON 組、shCD147-1 組和shCD147-2組細(xì)胞中CD147 mRNA 和蛋白的表達(dá)情況，RTqPCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與SiHa 組相比，shCD147-1 組和shCD147-2 組 CD147 mRNA 表達(dá)均顯著降低（F=240.4，P＜ 0.0001），見圖1B。Western blot檢測結(jié)果與RT-qPCR 結(jié)果一致（F=457.1，P＜0.0001），見圖1C。熒光倒置顯微鏡下觀察可見細(xì)胞中多含有綠色熒光，提示CD147 慢病毒轉(zhuǎn)染成功，見圖1D。結(jié)果表明CD147 在宮頸癌細(xì)胞中的高表達(dá)且慢病毒介導(dǎo)的CD147 低表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖1 檢測 CD147 在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)水平及慢病毒轉(zhuǎn)染效率Fig.1 The expression level of CD147 in cervical cancer cells and the transfection efficiency of lentivirus were detected

2.2 下 調(diào)CD147 對AIM2 炎癥小體信號(hào)通路 的影響

RT-qPCR 和Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測AIM2 炎癥小體相關(guān)因子的mRNA 及蛋白的表達(dá)。RTqPCR 結(jié)果顯示，與SiHa 組相比，shCD147-1 組和 shCD147-2 組細(xì)胞中AIM2（F=363.3，P＜0.0001）、Caspase-1（F=18.47，P＜ 0.0001）、IL-18（F=476.1，P＜ 0.0001）、GSDMD（F=59.35，P＜0.0001）表達(dá)升高，見圖2A。Western blot 檢測結(jié)果顯示，與SiHa 組相比，shCD147-1 組和 shCD147-2 組細(xì)胞中AIM2（F=580.2，P＜ 0.0001）、Caspase-1（F=66.67，P＜ 0.0001）、IL-18（F=210.9，P＜ 0.0001）、GSDMD（F=124.0，P＜ 0.0001）表達(dá)升高，見圖2B，結(jié)果提示下調(diào)CD147 可激活A(yù)IM2 炎癥小體信號(hào)通路。

圖2 下調(diào)CD147 對 SiHa 細(xì)胞AIM2 炎癥小體信號(hào)通路的影響Fig.2 Effect of down-regulating CD147 on AIM2 inflammasome signaling pathway in SiHa cells

2.3 下調(diào)CD147 對宮頸癌細(xì)胞焦亡的影響

熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)，與SiHa組相比，shCD147 組出現(xiàn)細(xì)胞焦亡典型形態(tài)，主要表現(xiàn)為細(xì)胞明顯的腫脹和空泡化的現(xiàn)象，見圖3A，且乳酸脫氫酶（LDH）釋放度明顯升高（t=11.13，P＜ 0.001），見圖3B。結(jié)果提示下調(diào)CD147可促進(jìn)細(xì)胞焦亡的發(fā)生。

圖3 下調(diào)CD147 對宮頸癌SiHa 細(xì)胞焦亡的影響Fig.3 Effect of down-regulation of CD147 on pyroptosis in cervical cancer SiHa cells

2.4 下調(diào)CD147 對宮頸癌細(xì)胞 增殖克隆能力的影響

CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與SiHa 組相比，shCD147-1 組和 shCD147-2 組細(xì)胞增殖能力減弱（24 h：F=105.9，P＜ 0.0001；36 h：F=2847，P＜0.0001；48 h：F=489.2，P＜ 0.0001），見圖4A。平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與SiHa 組相比，shCD147-1 組和 shCD147-2 組細(xì)胞集落形成能力顯著降低（F=309.0，P＜ 0.0001），見圖4B。結(jié)果提示下調(diào)CD147 表達(dá)可抑制SiHa 細(xì)胞的增殖克隆能力。

圖4 下調(diào) CD147 后宮頸癌 SiHa 細(xì)胞增殖克隆能力情況Fig.4 The proliferation and cloning ability of cervical cancer SiHa cells after down-regulation of CD147

3 討論

細(xì)胞焦亡在腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有促進(jìn)或抑制的雙重作用。一方面，細(xì)胞焦亡引起的長期炎癥反應(yīng)有利于腫瘤細(xì)胞生長微環(huán)境的構(gòu)建，促進(jìn)正常細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，幫助腫瘤細(xì)胞實(shí)現(xiàn)免疫逃逸，加快腫瘤的發(fā)生發(fā)展；另一方面，作為促炎性細(xì)胞死亡方式之一，細(xì)胞焦亡激活后通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生焦亡，進(jìn)而發(fā)揮對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。CD147 作為免疫球蛋白超家族中的一個(gè)重要成員[10]，因其誘導(dǎo)鄰近成纖維細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs），促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲，又被命名為細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)劑（extracellular matrix metalloproteinase inducer，EMMPRIN），越來越多的證據(jù)表明，CD147 在正常組織或細(xì)胞中表達(dá)降低，而在多種腫瘤中表達(dá)升高，包括肝癌、黑色素瘤、肺癌等[11]。目前對于晚期宮頸癌患者并沒有較好的解決方案，而炎癥常常與癌癥的發(fā)生密切相關(guān)，宮頸炎就是宮頸癌發(fā)生和發(fā)展重要病因之一，因此炎癥是癌癥預(yù)防和治療的一個(gè)重要策略。CD147 與多種炎癥性疾病具有相關(guān)性，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、間質(zhì)性肺炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等，CD147 可能參與這些炎性疾病反應(yīng)的調(diào)節(jié)。近年來隨著國內(nèi)外學(xué)者的進(jìn)一步研究，炎癥小體在調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生、生長、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用[12]。AIM2 炎癥小體是炎癥小體家族的重要一員，AIM2 炎癥小體可作為一種細(xì)胞質(zhì)傳感器來識(shí)別外來雙鏈DNA，其通過細(xì)胞外囊泡進(jìn)行細(xì)胞間的傳播[13]。當(dāng)AIM2 炎癥小體受到病原體信號(hào)刺激后，其復(fù)合體中的Caspase-1 被進(jìn)一步激活釋放促炎細(xì)胞因子，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生焦亡[14]。細(xì)胞焦亡是一種由消皮素介導(dǎo)的細(xì)胞程序性死亡形式，它是細(xì)胞不斷擴(kuò)增，直到細(xì)胞膜破裂導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物釋放，從而激活強(qiáng)烈的炎癥和免疫反應(yīng)[15]，細(xì)胞焦亡可由多種影響因素激活炎性小體而觸發(fā)[16]。宮頸癌與炎癥之間的機(jī)制非常復(fù)雜，尚不完全清楚，需要進(jìn)一步闡明，為其靶向治療提供方向和思路。

本研究通過Western blot 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CD147 在宮頸癌細(xì)胞中高表達(dá)，且在HPV 陽性的細(xì)胞中表達(dá)相對較高，在HPV 陰性的細(xì)胞中表達(dá)相對較低，提示 CD147 的表達(dá)與 HPV 病毒感染有關(guān)，有研究發(fā)現(xiàn)CD147 分子在HIV-1 宿主細(xì)胞上高表達(dá)，抑制CD147 發(fā)揮可拮抗HIV-1 感染宿主細(xì)胞的作用[17]，說明CD147 和病毒感染有相關(guān)性。過去普遍認(rèn)為腫瘤細(xì)胞的死亡方式是凋亡，而凋亡的機(jī)制一直是研究的熱點(diǎn)。然而越來越多的證據(jù)表明，腫瘤細(xì)胞的死亡方式是多樣化的，程序性壞死可分為細(xì)胞凋亡、細(xì)胞焦亡及鐵死亡等[18]。CD147不僅可以通過凋亡，還可通過自噬、鐵死亡等方式影響腫瘤的發(fā)生[19]。研究發(fā)現(xiàn)CD147 作用機(jī)制與激活Caspase 酶有關(guān)，沉默CD147 后，Caspase-3 表達(dá)升高，從而使細(xì)胞進(jìn)入凋亡階段[20]。本研究采用 shRNA 技術(shù)沉默其表達(dá)后，通過RT-qPCR和Western blot 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，下調(diào) CD147 后，AIM2炎癥相關(guān)因子AIM2、Caspase-1、IL-18、GSDMD明顯上調(diào)，熒光倒置顯微鏡下觀察到下調(diào) CD147細(xì)胞出現(xiàn)典型的細(xì)胞焦亡形態(tài)，且乳酸脫氫酶（LDH）釋放度明顯升高，證明CD147 誘導(dǎo)細(xì)胞死亡可能通過AIM2 炎癥小體途徑來實(shí)現(xiàn)，也說明CD147 誘導(dǎo)細(xì)胞死亡是多通路的。本研究通過CCK-8 和平板克隆實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)下調(diào)CD147 表達(dá)后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖能力、集落形成能力顯著降低，與曹勛榮等研究結(jié)果相一致[21]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)CD147 在宮頸癌細(xì)胞中呈高表達(dá)趨勢，下調(diào)CD147 可通過介導(dǎo)AIM2炎癥小體誘發(fā)細(xì)胞焦亡，抑制宮頸癌SiHa 細(xì)胞增殖克隆，進(jìn)而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。CD147 的表達(dá)量與HPV 病毒感染有關(guān)，但其具體機(jī)制尚不完全明確，需進(jìn)一步研究，本課題組后續(xù)將進(jìn)一步分析CD147 與HPV 的相關(guān)性及之間的具體分子機(jī)制，為宮頸癌機(jī)制及新靶點(diǎn)的治療研究提供了新思路。