下調HPV16 E6/E7 表達宮頸癌細胞Siha 上清液代謝組學

肖金寶，趙駿達，馬俊旗

（新疆醫科大學第一附屬醫院婦科門診，新疆 烏魯木齊 830000）

子宮頸癌（cervical cancer，CC）作為女性惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率持續上升且呈現低齡化，因而受到廣泛關注[1]。宮頸癌惡性進展中主要是受到高危型人乳頭瘤病毒HPV16、18 型的持續感染，導致癌基因E6 和E7 蛋白的活化，進而影響多條信號途徑，促進癌細胞持續增殖，最終形成宮頸癌[2?3]。研究表明，E6 和E7 對葡萄糖[4?5]、脂肪酸[6]、氨基酸[7]代謝具有有一定的影響，宮頸癌細胞的增殖、轉移離不開代謝產能的供給。因此，本研究探討HPV E6/E7 蛋白的活化與宮頸癌相關能量代謝改變的關系，從而對宮頸癌的篩查、治療、預后提供有利的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞人源宮頸癌Siha（HPV16+）細胞，購買于武漢Pricella 生命科技有限公司。

1.1.2 主要試劑HPV16 E6 抗體（sc-460）、HPV16 E7 ED17 抗體（sc-6981）購買于美國 Santa Cruz Biotechnology 公司。FBS 胎牛血清、青-鏈霉素、DMEM 培養基購買于BI 公司，X-tremeGENE?HP DNA 轉染試劑盒購買于默克生命科學公司，每組質粒由海吉凱生物科技有限公司構建，RNAi 片段引物序列如下，見表1。

表1 E6 RNAi、E7 RNAi 片段引物序列Tab.1 Primer sequences of E6 RNAi and E7 RNAi fragments

1.2 實驗方法

1.2.1 建立宮頸癌細胞Siha 的RNAi 載體轉染siRNA 片段、對照（si-NON）構建于由吉凱基因科技有限公司（上海）。本實驗根據默克公司生產的質粒轉染試劑（名稱：X-tremeGENE HP DNA）說明書，其官網http://www.powerful-transfection.com/尚寫的詳細操作實驗步驟，首先調整Siha 細胞生長狀態和所需的細胞數量進行試驗。其次按照3 μL X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent添加至1 μg 質粒DNA/100uL MEM 培養基中的比例進行轉染。48 h 后應用萊卡熒光倒置顯微鏡（Leica DMIL LED）觀察Siha 細胞轉染效率，應用Western blot 驗證。

1.2.2 細胞培養宮頸癌Siha 培養于DMEM 完全培養基，包含10%FBS 及2%PS，培養于37℃、5%的CO2培養箱內。

1.2.3 核磁共振檢測細胞上清液-80℃冰箱中取出樣品，準備在室溫中4℃的冰水混合物中逐漸解凍，準備無酶EP 管，并加入450 μL 的每組細胞上清液，并加入DSS 緩沖溶液50 μl（配置比例：0.045MNaH2PO4+0.045MK2HPO4inD2O）。本實驗中應用的實驗儀器微波1HNMR，并采用NOESYPRESAT-ID 脈沖序列進行上清液內的氫譜測定，內標為DSS，將化學位移設定值為0 ppm。最后采用預飽和方式進一步抑制水峰，其時間設置為2 s，采樣點數為32 k，譜寬需為10 000 Hz，掃描次數設為為126 次，采樣時間平均1.64 s，測試溫度為恒溫（25℃）。

1.2.4 代謝譜數據分析方法所有1HNMR 譜需要經過相位和基線校正，并用增寬因子為0.5 Hz 的指數窗函數進行處理。數據用SIMCA-P+11 軟件進行上清代謝數據的OPLS-DA 分析。各組細胞上清中差異性的代謝物需要經過OPLS-DA 分析，并確定從中得到其變量重要性的參數（variable importance in the projection，VIP）值，要求VIP＞1。

1.3 統計學處理

本文所涉及的實驗結果均經過3 次獨立實驗的驗證后取平均值。統計學分析采用SPSS17.0 軟件。定量資料以（）表示，多組數據間的對比需采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜ 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 E6-RNAi 和E7-RNAi 的細胞模型建立

通過熒光倒置顯微鏡對轉染HPV16 編碼E6或E7 基因序列特異性RNAi 片段的宮頸癌細胞進行觀察，明確轉染效果見圖1A。Western blotting驗證各組細胞E6/E7 蛋白表達量。結果顯示，與Siha 組比較，si-E6 組與si-E7 組中E6/E7 的表達量降低（F=145.8，P＜0.001，圖1B，圖1C）。

圖1 檢測Siha 細胞內E6-RNAi 和E7-RNAi 的轉染效率Fig.1 The transfection efficiency of E6-RNAi and E7-RNAi in Siha cells was detected

2.2 E6、E7 蛋白表達下調對宮頸癌細胞上清代謝譜變化的影響

利用1H-NMR 代謝譜分析細胞上清液，在si-E6、si-E7 組和Siha 組中共有差異代謝物13 種，見圖2。異亮氨酸，亮氨酸，纈氨酸，酪氨酸，β-羥丁酸，苯丙氨酸，甲酸酪氨酸，α-葡萄糖，β-葡萄糖，乙酸，苯丙氨酸含量下降（P＜ 0.05）；乳酸，丙氨酸，甲酸含量上升（P＜ 0.05），見表2。

圖2 RNA 干擾后SiHa 細胞上清1HNMR 譜圖Fig.2 1HNMR spectra of SiHa suspention after RNAi

表2 RNA 干擾組與非干擾租1HNMR 譜經過OPLS-DA 分析獲得的主要差異性代謝物及其相關系數Tab.2 Otherness metabolites of different cell samples using OPLS-DA based on different normalization methods and its correlation coefficients

2.3 E6、E7 蛋白表達下調對相關代謝通路的影響

利用MetaboAnalyst 5.0 在線軟件分析，得到與13 種差異代謝物相關的變化10 條途徑（P＜0.05），主要分為糖代謝與氨基酸代謝2 類。其中氨基酸代謝主要包含：（1）氨酰-tRNA 生物合成途徑；（2）纈氨酸、亮氨酸以及異亮氨酸生物化學代謝途徑；（3）苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物化學合成途徑；（4）苯丙氨酸合成途徑;（5）纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解途徑；（6）苯丙氨酸的代謝途徑；（7）酮體的合成與降解途徑；（8）泛醌和其他萜類-醌類生物的合成途徑。而糖代謝途徑主要包括：（1）糖酵解/糖異生途徑；（2）丙酮酸的代謝途徑，乙醛酸和二羧酸類的代謝途徑，見圖3，表3。

圖3 下調Siha 細胞E6/E7 蛋白代謝通路分析圖Fig.3 Analysis of down-regulated E6/E7 protein metabolic pathways inSiha cells

表3 下調Siha 細胞E6/E7 蛋白后10 條相關代謝通路Tab.3 10 metabolic pathways associated with down-regulation of E6/E7 protein in SIHA cells

3 討論

宮頸癌位居女性婦科惡性腫瘤第2 位，其不但威脅身心健康也會造成一定的經濟負擔。新疆地區高發腫瘤包括子宮頸癌，其發病率正呈現為年輕化[8?9]。宮頸癌誘發的主要原因是高危型的人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）2a 以上的持續性感染，其中常見于HPV16 和18 的感染[10]。其機制為HPV 的DNA 與宿主細胞的DNA整合，通過誘導致癌基因 E6、E7 和調控細胞周期得蛋白存在相互作用，紊亂細胞的周期，從而促進它無限增殖，演變為癌細胞[11]。

近年來，代謝重編程作為癌癥標志之一，快速生長的癌細胞可以適應其不斷增長的能量需求。癌細胞的是從缺乏營養的環境中獲得必要的營養物質，并利用這些營養物質來維持細胞的活力、增殖。癌細胞的異常代謝功能最初是由奧托·瓦博格提出的，對于正常細胞而言，其腫瘤細胞偏向于消耗較多葡萄糖，提出“Warburg effect”[12?13]。自此，眾多科學研究集中在與癌癥相關其它類型的代謝重編程，如葡萄糖的氧化磷酸化、氨基酸合成和脂質氧化等代謝變化，為尋找癌癥進展中其余的潛在的治療靶點。課題組前期研究發現異常的糖代謝，脂代謝等會影響宮頸癌惡性進展[14?15]。

在宮頸癌進展中，參與糖酵解過程中關鍵酶如HK2 等呈現過表達，促進宮頸癌細胞的生長、轉移等惡性行為[16]。研究顯示，在腫瘤細胞中，抑制烯醇化酶1（enolase 1，ENO1）表達將抑制宮頸癌Hela 細胞發生典型上皮-間質轉化（epithelialmesenchymal transition，EMT）樣形態學改變[17]。前期研究發現RACK1 通過IGF1R/Akt/mTOR 信號通路激活糖酵解途徑促進宮頸癌發生淋巴結轉移[18]。另1 個常見的代謝變化是氨基酸代謝增加，特別是谷氨酰胺代謝。谷氨酰胺是1 種主要的能量底物，為癌細胞提供額外的能量來源[19]。在腫瘤細胞中多種特定的氨基酸轉運體均過表達，如鈉離子依賴的中性氨基酸轉運蛋白2（sodiumdependent neutral amino acid transporter 2，SNAT2）、丙氨酸-絲氨酸-半胱氨酸轉運蛋白2（alanine-serine-cysteine transporter 2，ASCT2）溶、質載體家庭6成員14（solute carrier family 6 member 14，SLC6A14）等[20]。若靶向一些氨基酸的轉運體，將會抑制其轉運氨基酸，記憶布減弱其細胞捏ATP 能量代謝。

HPV 基因組轉錄本還含有非編碼蛋白，通過蛋白質-蛋白質相互作用，在病毒與宿主的相互作用和感染的發展中發揮關鍵用途。E6/E7 直接促進糖酵解關鍵蛋白HK2 表達[21]，或HPV E6/p53 信號通路誘導的miR-34a/LDHA 軸調控宮頸癌Warburg 效應促進腫瘤的生長和侵襲[22]。故靶向HR-HPV 感染對抗糖酵解水平也可成為宮頸癌治療的有效策略。研究顯示，2 型轉谷氨酰胺酶（transglutaminase 2，TG2）與宮頸癌細胞內HPV16-E6 蛋白的表達水平存在相關性，可作為早期識別的重要指標以及判斷預后的重要的分子標記物[23]。本次研究通過下調Siha 細胞中E6、E7 蛋白后，利用1H-NMR 對轉染后的細胞上清液進行代謝組學分析，篩選出13 種共有的并變化的差異代謝物，其中，亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，酪氨酸，β-羥丁酸，苯丙氨酸，酪氨酸，α-葡萄糖，β-葡萄糖，乙酸，苯丙氨酸含量下降，乳酸，丙氨酸，甲酸含量上升。以上差異代謝物涉及10 條代謝通路，見圖3 和表3。其主要影響氨基酸代謝以及葡萄糖代謝。提示E6/E7 的表達異常與氨基酸代謝和糖代謝紊亂存在相關性。

綜上所述，HPV16 感染導致宮頸癌發生是一個復雜的過程，本研究結果表明，E6、E7 蛋白下調對葡萄糖代謝與氨基酸代謝相關的物質含量有影響，提示HPV16 感染與葡萄糖、氨基酸代謝改變之間存在著相互的關聯，隨著對E6/E7 蛋白誘導HPV 相關癌癥的分子機制研究的不斷深入，其可能會成為臨床宮頸癌治療的新靶點。本研究不足是缺少對E6、E7 影響葡萄糖、氨基酸代謝的調控機制的研究，后續實驗將會繼續探索其存在的主要調控機制。